Hier presenteren we een methode om organismal vetgehalte in het derde instar (L3) larvale stadium van Drosophila melanogaster gemeten. Deze methode maakt gebruik van de relatief lage dichtheid van vetweefsel om onderscheid te maken tussen de larven met gewijzigde vetreserves. Drijfvermogen gebaseerde analyse is een waardevol hulpmiddel voor snelle, reproduceerbare en economisch screening.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
A-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Drosophila melanogaster is een belangrijk experimenteel systeem in de studie van vetregulatie. Er bestaan momenteel talrijke technieken om de niveaus van opgeslagen vet in Drosophila te meten, maar de meeste zijn duur en/of arbeidsintensief en hebben duidelijke beperkingen. Hier presenteren we een methode om snel en goedkoop de vetniveaus van organismen in L3 Drosophila-larven te bepalen. De techniek is gebaseerd op de verschillen in dichtheid tussen vet- en magere weefsels en maakt een snelle detectie van vette en magere fenotypen mogelijk. We hebben de nauwkeurigheid van deze methode geverifieerd door vergelijking met het percentage lichaamsvet zoals bepaald door extractie van neutrale lipiden en gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GCMS). Verder geven we gedetailleerde protocollen voor het verzamelen en synchroniseren van larven, evenals relevante experimentele recepten. De hieronder gepresenteerde techniek overwint de belangrijkste tekortkomingen van de meest gebruikte methoden voor lipidenkwantificering en biedt een krachtige manier om snel en gevoelig L3-larven te screenen op fenotipen van vetregulatie, terwijl de integriteit van de larven behouden blijft. Deze assay heeft brede toepassingen voor de studie van metabolisme en vetregulatie met behulp van Drosophila.
Inleiding
Drosophila melanogaster is gebruikt voor meer dan een eeuw in de studie van de genetica en andere fundamentele biologische vragen. In de afgelopen decennia is duidelijk geworden dat Drosophila is een krachtig instrument in de studie van vele ziekten bij de mens. 70 - 80% van de genen geassocieerd met ziekten bij de mens een geïdentificeerde fly ortholoog 1-4, Drosophila biedt een vereenvoudigde, doch vertaalbare systeem om complexe ziekten te bestuderen. Metabolisme in het bijzonder heeft geprofiteerd van een dergelijke studie. Niet alleen zijn de genetica van metabolisme goed geconserveerd tussen vliegen en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Verzamel eieren van Vliegen met genotypen van Interest
OPMERKING: Ideale kruisen bestaan uit 150 virgin vliegen en ten minste 75 mannen. De verzamelingen moet bestaan uit ten minste 200 vliegen.
- Bereid druif platen.
- Voeg 37,5 g agar tot 1,5 liter gedestilleerd water in een 4 L kolf.
- Autoclaaf water / agar mix voor 50 min bij 121 ° C (250 ° F).
- Terwijl water / agar mix is een autoclaaf, voeg 50 g sucrose tot 500 ml druivensap en roer met een roerstaaf op een verwarmde roer plaat totdat sucrose is opgelost.
- Zet het vuur en blijf roeren tot het druivensap / sucrose mengsel afkoelen tot onder de 70 ºC. Te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 geeft een voorbeeld van hoe het drijfvermogen gebaseerde test zowel hogere als lagere vetopslag in genetisch gemanipuleerde larven kunnen detecteren. Figuur 1A toont dat excitatie of silencing van een bepaalde subset van neuronen (E347) in het larvale hersenen induceert lagere en hogere vetgehalte winkels respectievelijk. Dezelfde genetische achtergrond controle werd gebruikt in beide gevallen. Figuur 1B is een voorbeeld van hoe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn een groot aantal technieken die zijn ontwikkeld om lipiden te meten 8-10. Echter, elk van deze methoden geleverd met een aantal belangrijke nadelen zijn die onder het drijfvermogen gebaseerde test hierboven beschreven. Ten eerste, deze test is erg snel. Het testen van een volledige concentratie gradiënt duurt niet langer dan 30 - 60 min. Dit is een enorme verbetering ten opzichte van de meeste van de technieken die momenteel worden gebruikt. Bijvoorbeeld lipide kwantificering doo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
K.E.H. werd ondersteund door de Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. Dit werk werd ondersteund door NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 en AHA Award 12BGIA11930014 aan T.R.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Verrijkt ontkiemd | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml Conical | Fisher | 50-869-569 |
Referenties
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Usin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
