A-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in<em&gt; Drosophila</em

Samenvatting

Hier presenteren we een methode om organismal vetgehalte in het derde instar (L3) larvale stadium van Drosophila melanogaster gemeten. Deze methode maakt gebruik van de relatief lage dichtheid van vetweefsel om onderscheid te maken tussen de larven met gewijzigde vetreserves. Drijfvermogen gebaseerde analyse is een waardevol hulpmiddel voor snelle, reproduceerbare en economisch screening.

Samenvatting

Drosophila melanogaster is een belangrijk experimenteel systeem in de studie van vetregulatie. Er bestaan momenteel talrijke technieken om de niveaus van opgeslagen vet in Drosophila te meten, maar de meeste zijn duur en/of arbeidsintensief en hebben duidelijke beperkingen. Hier presenteren we een methode om snel en goedkoop de vetniveaus van organismen in L3 Drosophila-larven te bepalen. De techniek is gebaseerd op de verschillen in dichtheid tussen vet- en magere weefsels en maakt een snelle detectie van vette en magere fenotypen mogelijk. We hebben de nauwkeurigheid van deze methode geverifieerd door vergelijking met het percentage lichaamsvet zoals bepaald door extractie van neutrale lipiden en gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GCMS). Verder geven we gedetailleerde protocollen voor het verzamelen en synchroniseren van larven, evenals relevante experimentele recepten. De hieronder gepresenteerde techniek overwint de belangrijkste tekortkomingen van de meest gebruikte methoden voor lipidenkwantificering en biedt een krachtige manier om snel en gevoelig L3-larven te screenen op fenotipen van vetregulatie, terwijl de integriteit van de larven behouden blijft. Deze assay heeft brede toepassingen voor de studie van metabolisme en vetregulatie met behulp van Drosophila.

Inleiding

Drosophila melanogaster is gebruikt voor meer dan een eeuw in de studie van de genetica en andere fundamentele biologische vragen. In de afgelopen decennia is duidelijk geworden dat Drosophila is een krachtig instrument in de studie van vele ziekten bij de mens. 70 - 80% van de genen geassocieerd met ziekten bij de mens een geïdentificeerde fly ortholoog ^1-4, Drosophila biedt een vereenvoudigde, doch vertaalbare systeem om complexe ziekten te bestuderen. Metabolisme in het bijzonder heeft geprofiteerd van een dergelijke studie. Niet alleen zijn de genetica van metabolisme goed geconserveerd tussen vliegen en mensen, maar de betrokken organen en celtypen zijn ook vergelijkbaar ^2,5. Bijvoorbeeld, het vet lichaam van de vlieg winkels zowel triacylglyceriden (TAG) en glycogeen, functioneert analoog met die welke in zoogdierlijke lever en wit vetweefsel ^6. Met behulp van Drosophila als model voor humane obesitas is enorm verbeterd ons begrip van lipidemetabolisme en de genetica van obesitas ^7. Het larvale stadium van ontwikkeling is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de scheiding van voedingsmiddelen bij opslag en gebruik zoals het is gewijd aan voeding en energieopslag in verpopping te gebruiken.

Momenteel zijn er veel verschillende kwantitatieve werkwijzen voor het bepalen vetopslag niveaus in Drosophila. De meest gebruikte methode is de gekoppelde colorimetrische assay (CCA) ^8,9. CCA is ontwikkeld voor het bepalen TAG niveaus in serum en werkt op de vooronderstelling dat glycerol bevrijd van de ruggengraat van triglyceriden De volgende reacties ondergaan uiteindelijk resulteert in een redox-gekoppelde reactie opwekken van een gekleurd product. De absorptie van specifieke golflengten van licht wordt dan gemeten op de aanvankelijke hoeveelheid glycerol aanwezig bepalen. Echter, kan glycerol worden bevrijd van mono- en diacylglycerides naast TAG en derhalve kan geen nauwkeurige maat s bedragentroleerd lichaamsvet ^9. Bovendien kan oog pigment gemalen volwassen vliegen storen met absorptie lezingen en compliceren resultaten ^9,10. Daarom moet CCA vergezeld en gevalideerd door dunnelaagchromatografie (TLC), waardoor de scheiding van de meeste families lipide dat kan worden gekwantificeerd met densitometrie ^10,11. Echter, sommige lipide klassen zoals sterolen niet worden geanalyseerd en moeten op een andere manier ¹² worden gekwantificeerd. Massaspectrometrie (MS) is een nauwkeurige manier om alle klassen van de grote mobiele lipiden ^12,13 kwantificeren. Echter, de lipide-extractie procedures die nodig zijn om te analyseren door MS zijn zowel tijdrovend (de meeste nemen bijna een hele dag) en kostbaar. Hier geven we een alternatieve methode om snel en goedkoop organismale vetgehalte bepalen de L3 larven van Drosophila melanogaster.

De methode hieronder maakt gebruik van het verschil in dichtheid tussen vetweefsel en mager weefsel. Mammalian fat weefsel heeft een dichtheid van ongeveer 0,9 g / ml ¹⁴ terwijl skeletspier een dichtheid van 1,06 g / ml ^15. Dit verschil betekent dat dieren met hogere slaat vet lagere dichtheid dan dieren met een lagere winkels vet, waardoor ze beter zweven in een oplossing van vaste dichtheid hebben. Deze eigenschap maakt extreem snelle screening van een groot aantal dieren terwijl zowel goedkoop en niet-invasief. Drijfvermogen gebaseerde analyse is gebruikt om zowel de fenotypen van wijziging bekende regulatoren van vetgehalten en om nieuwe genetische en neurologische regulatoren identificeren van obesitas ^16,17 bevestigen.

Protocol

1. Verzamel eieren van Vliegen met genotypen van Interest

OPMERKING: Ideale kruisen bestaan ​​uit 150 virgin vliegen en ten minste 75 mannen. De verzamelingen moet bestaan ​​uit ten minste 200 vliegen.

1. Bereid druif platen.
   1. Voeg 37,5 g agar tot 1,5 liter gedestilleerd water in een 4 L kolf.
   2. Autoclaaf water / agar mix voor 50 min bij 121 ° C (250 ° F).
   3. Terwijl water / agar mix is ​​een autoclaaf, voeg 50 g sucrose tot 500 ml druivensap en roer met een roerstaaf op een verwarmde roer plaat totdat sucrose is opgelost.
   4. Zet het vuur en blijf roeren tot het druivensap / sucrose mengsel afkoelen tot onder de 70 ºC. Test de binnentemperatuur met een alcohol thermometer.
   5. Voeg 3 g Drosophila schimmelwerend middel (bijvoorbeeld Tegosept) tot druivensap / sucrose mengsel opwarmen en roer om op te lossen.
   6. Wanneer het water / agar mengsel uit de autoclaaf, laat de kolf afkoelen tot de aanraking door zwenken af ​​en toe.
   7. Combineer water / agar mengsel en druivensap / sucrose mengsel en roer tot goed gemengd.
   8. Gebruik een serologische pipet tot 8 toe - 10 ml van de druif mengsel aan de deksel van een kleine petrischaal (35 x 10 mm stijl). Laat het mengsel hogere kroon dan de hoogte van het deksel muren om een ​​convexe vorm te vormen.
   9. Sta druif platen afkoelen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens in een luchtdichte houder bij 4 ° C.
2. Bereid gist plakken.
   1. Voeg 6 ml fosfaatbufferoplossing (PBS) tot 4 gram levend actieve gedroogde gist in een 50 ml conische buis en meng met een spatel tot een gladde massa.
   2. Store gist plakken bij 4 ºC.
3. Voeg een kleine klodder (ongeveer 1/8 theelepel) van gist deeg naar het midden van een druif plaat. Gladstrijken eventuele ruwe randen met een spatel.
4. Plaats druif platen in een incubator totdat omgevingstemperatuur bereikt.
5. Transfer vliegen van belang in een eicel opvangruimte en plaats druif plaat wet gist pasta naar binnen gericht op de top. Tape druif plaat om het ei collectie kamer om te voorkomen dat de plaat vallen. Zorg ervoor dat u belangrijke genotype en actuele informatie over de bodem van de druif plaat te schrijven.
6. Upend het ei collectie kamer om de vliegen om eieren te leggen op de druif plaat.
7. Plaats een doos of bedekken het ei verzameling kamers en plaats ze in een incubator bij 25 ºC.
8. Laat vliegen om eieren te leggen voor 4-6 uur.
9. Einde collectie door het nemen van de druif plaat uit het ei opvangruimte en de overdracht van de vliegen terug in hun fles voedsel. Gebruik een spatel om af te vegen overtollige gist plakken van de druif plaat. Store druif plaat in een grotere petrischaal in een bevochtigde incubator bij 25 ºC voor ~ 24 uur.

2. Breng Larven naar Experimental Eten

1. Bereid experimentele voedsel.
   LET OP: Dit voedsel recept is gebaseerd op de Bloomington voorraad centrum recept ^18. belangrijke wijzigingenomvatten verhoogde hoeveelheid gist om de voedingswaarde van het levensmiddel optimaliseren zoals beoordeeld door timing van zwerven fase (tussen 112-120 uur na eierverzameling bij 25 ° C). Hoewel we dit recept ideaal voor de gezondheid en ontwikkeling van onze experimentele larven gevonden, geen voedsel recept is aanvaardbaar gezien kalibratie met positieve en negatieve controles, waarvan voorbeelden in stap 3.10 worden vermeld.
   1. Meet 1600 ml gedestilleerd water.
   2. Meng 134 g maïsmeel, 10,6 g Drosophila Agar Type II, en wat water (~ 500 ml) in een 1 L beker. Meng gedurende 2 minuten met een gemotoriseerde handmixer.
   3. Meng 70 gram levend actieve gedroogde gist, 18,4 g sojameel, 84,8 g moutextract, en wat water (~ 500 ml) in een 1 L beker. Meng gedurende 2 minuten met een gemotoriseerde handmixer.
   4. Swirl elke beker en giet het in een 4 L kolf. Gebruik de rest van het water te spoelen de bekers en toe te voegen in de kolf.
   5. Meet 140 ml lichte glucosestroop en toe te voegen aan de kolf, meng door zwenken.
   6. Autoclaaf gedurende 50 minuten bij 121 ° C (250 ° F) in de vloeibare omgeving.
   7. Na behandeling in een autoclaaf, giet het voedsel in een 4 L beker en laat afkoelen. Help het koelproces door het mengen met een gemotoriseerde handmixer.
   8. Zodra de kolf genoeg aan de orde is afgekoeld, voeg 8,8 ml propionzuur en 16,8 ml Drosophila antischimmelmiddel / ethanoloplossing. Goed mengen. (Voeg Drosophila anti-schimmel middel oplossing door het toevoegen van 380 g Drosophila anti-schimmel middel tot 1 L 200 proof ethanol en roeren op een warm bord totdat het is opgelost, zorg ervoor dat de oplossing niet hoger is dan 70 ºC.)
   9. Giet voedsel in flesjes tot het eten ongeveer 1 inch diep en laat het afkoelen bij kamertemperatuur 2-3 uur. Plug flesjes en op te slaan in een incubator bij 25 ºC. Gebruik binnen een week.
2. Duik een spatel een paar keer in de bovenste laag van de flacon van het voedsel te scoren. Dit zal helpen de larven te graven en te voeden.
3. 22-24 uur na ei collectie heeftended, gebruik dan een kleine penseel tot 50 eerste larvestadium (L1) larven van ongeveer dezelfde grootte te verzamelen. Plaats larven in de experimentele voeding. Reinig het penseel op een laboratorium doekje en zorgen dat er geen resterend larven op de verfkwast over te gaan naar een ander genotype.
4. Plaats flacon van larven in een incubator bij 25 ° C en laten ontwikkelen.

3. Bepaal vetgehalte in Larven

1. Bereid oplossingen.
   1. Bereid 1 L 10x PBS voorraad.
      1. Voeg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na ₂ HPO ₄ en 2,4 g KH ₂ PO _4-800 ml water in een 2 L bekerglas met een roerstaaf. Roer met geen warmte totdat alle zouten worden opgenomen. Breng de pH tot 7,4. Verhoog het volume op 1 liter met water.
   2. Bereid 2 L 1x PBS. Voeg 200 ml 10x PBS stockoplossing aan 1800 ml water.
   3. Gebruik deze voorraad 1x PBS om 20% w / v sucrose.
2. Verwijder de flacon van larven van deincubator zodra er 20-40 larven dwalen de zijkanten van de flacon (meestal op de vijfde dag na de ei-collecties). De datum en tijd van de test en het aantal larven zwerven.
3. Bereid experimentele door toevoeging van 11,5 ml PBS en 9 ml 20% sucrose een 50 ml conische buis.
4. Voeg 20% ​​sucrose aan het flesje tot het 0,5-1 inch vanaf de bovenkant van de flacon.
5. Met een spatel roer de toplaag van voedsel aan vrije larven die nog gravende in het voedsel. Alle larven naar de oppervlakte van het sucrose-oplossing.
6. Tang om de larven voorzichtig brengen in de oorspronkelijke sucrose concentratie van stap 3,3.
7. Met een spatel roer de larven in deze oplossing.
8. Cap de conische buis en upend meerdere malen om de oplossing goed te mengen.
9. Haal het beschermkapje van de conische buis en schud om een ​​zachte vortex te creëren.
10. Laat de larven bezinken, hetzij drijven naar de top van de oplossing of siNKing onderaan. Wacht 2-5 minuten voor de larven om zich te vestigen.
    LET OP: Als er nog steeds larven die niet zijn zeker ofwel drijvende of zinken, kies een lijn te gebruiken als een afkappunt om de larven te bestempelen als ofwel een floater of een verzwaringslichaam. Breng dit hetzelfde criterium om alle genotypen. We gebruiken de hoek bij de bodem van de conische buis als onze grens. ADP of Sir2 ¹⁷ mutant larven kan worden gebruikt als een positieve controle en lsd2 ¹⁹ mutanten kan worden gebruikt als negatieve controle voor het kalibreren van de test.
11. Noteer het aantal drijvende larven en de specifieke geteste concentratie.
12. Voeg 1 ml 20% sucrose om de experimentele oplossing om de dichtheid te verhogen.
13. Herhaal stap 3,7-3,10. Noteer het aantal drijvende larven en deze nieuwe concentratie.
14. Verder stappen 3,12 en 3,13 tot ten minste 95% van de larven drijven.
15. Gebruik een tang om alle larven verzamelen in een dissectie schotel gevuld met PBS.
16. ObsErve larven onder een microscoop en de opmerking als er sprake is van kleine larven, pre-poppen, poppen, of enige andere verschillen tussen genotypen.
    Opmerking: In het ideale geval zouden alle larven homogeen en tegelijk ontwikkelingsstadium weergegeven. We hebben alleen waargenomen in overeenstemming vet metingen onder deze omstandigheden.
17. Noteer het totale aantal larven.
18. Behulp van een tang, transfer 10 larven naar een laboratorium vegen drogen. Label een microcentrifugebuis en plaats 10 larven in de buis.
19. Flash bevriezen van de larven in vloeibare stikstof. Bewaar de buis bij -20 ºC.

Resultaten

Figuur 1 geeft een voorbeeld van hoe het drijfvermogen gebaseerde test zowel hogere als lagere vetopslag in genetisch gemanipuleerde larven kunnen detecteren. Figuur 1A toont dat excitatie of silencing van een bepaalde subset van neuronen (E347) in het larvale hersenen induceert lagere en hogere vetgehalte winkels respectievelijk. Dezelfde genetische achtergrond controle werd gebruikt in beide gevallen. Figuur 1B is een voorbeeld van hoe...

Discussie

Er zijn een groot aantal technieken die zijn ontwikkeld om lipiden te meten ^8-10. Echter, elk van deze methoden geleverd met een aantal belangrijke nadelen zijn die onder het drijfvermogen gebaseerde test hierboven beschreven. Ten eerste, deze test is erg snel. Het testen van een volledige concentratie gradiënt duurt niet langer dan 30 - 60 min. Dit is een enorme verbetering ten opzichte van de meeste van de technieken die momenteel worden gebruikt. Bijvoorbeeld lipide kwantificering doo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 proof
Baker's yeast	Fleichmann's
Yellow Corn Meal	Quaker		Verrijkt ontkiemd
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Malt Extract	Breiss	5748
Light Corn Syrup	Karo
Propionic Acid	VWR	U330-09
Sodium chloride	Fisher	50147491
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous	Fisher	S3933
Potassium chloride	Fisher	P330-500
35 x 10 mm petri plate	Fisher	08-757-100A
50 ml Conical	Fisher	50-869-569