Method Article

Een geoptimaliseerde protocol voor de efficiënte Radioactief merken van Gold Nanodeeltjes met behulp van een 125-Gemerkte azide prosthetische groep

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gedetailleerde procedure voor de synthese van een 125 I-gemerkt azide en het radioactief merken van dibenzocyclooctyne (DBCO) -groep geconjugeerd, 13-nm-sized goud nanodeeltjes met behulp kopervrij click reactie wordt beschreven.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we een gedetailleerd protocol voor de radiosynthese van een 125I-gelabelde azide-prothetische groep en de toepassing ervan voor de efficiënte radiolabeling van DBCO-groep-gefunctionaliseerde goudnanodeeltjes met behulp van een kopervrije click-reactie. Radiojodinatie van de gestannyleerde voorloper (2) werd uitgevoerd met behulp van [125I]NaI en chlooramine T als oxidator bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na zuivering van het ruwe product door HPLC, werd de gezuiverde 125I-gelabelde azide (1) verkregen met hoge radiochemische opbrengst (75 ± 10%, n = 8) en uitstekende radiochemische zuiverheid (>99%). Voor de synthese van radiogelabelde 13-nm-grote goudnanodeeltjes werden de DBCO-gefunctionaliseerde goudnanodeeltjes (3) bereid met behulp van een thiolering polyethyleenglycol-polymeer. Een kopervrije click-reactie tussen 1 en 3 gaf de 125I-gelabelde goudnanodeeltjes (4) met meer dan 95% radiochemische opbrengst, zoals bepaald door radio-dunlaagchromatografie (radio-TLC). Deze resultaten geven duidelijk aan dat de huidige radiolabeling-methode met behulp van een spanningsgepromoveerde kopervrije click-reactie nuttig zal zijn voor de efficiënte en gemakkelijke radiolabeling van DBCO-groep-bevattende nanomaterialen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De door spanning gepromoveerde kopervrije klikreactie tussen azides en cyclooctynen is uitgebreid toegepast op de efficiënte bioorthogonale markering van een breed scala aan biomoleculen, nanomaterialen en levende organismen1-7. Vanwege de uitstekende locatie-specificiteit en snelle reactiesnelheid van deze conjugatiereactie, is het ook gebruikt om radiogelabelde tracers te synthetiseren. Een paar 18F-gelabelde azide of DBCO-prosthetische groepen zijn voorbereid voor in vitro markering van verschillende kankers targetende peptiden en antilichamen, evenals voor in vivo voorgetargette beeldvorming van tumoren8-13. Naast deze voorbeelden, werd dezelfde conjugatiereactie toegepast op de metaal-radio-isotoop-markering van nanomaterialen voor positronemissietomografie (PET) beeldvormingsstudies14-16.

Al enkele decennia lang wordt radioactief jodium gebruikt voor biomedisch onderzoek en klinische proeven via PET-beeldvorming (124I), enkele-foton-emissie-computertomografie (SPECT) beeldvorming (123I, 125I), en behandeling van schildklierkanker (131I)17-21. Daarom is een efficiënte methode voor radioactief jodiummarkering fundamenteel belangrijk voor verschillende onderzoeken, inclusief moleculaire beeldvormingsstudies, analyse van orgaanverdeling van biomoleculen, biomarkeridentificatie en geneesmiddelontwikkeling. Een kopervrije klikreactiestrategie zou kunnen worden gebruikt bij radioactief jodiummarkering. Echter, deze toepassing is niet zo uitgebreid onderzocht als 18F-gelabelde biomoleculen22-23. Hier zullen we een stapsgewijs protocol geven voor de synthese van een 125I-gelabeld azide voor radiomarkering van DBCO-groep-afgeleide moleculen. De procedures in dit rapport zullen radiojodinering van de stannyleerde precursor, zuiveringsstappen met HPLC en extractie op vaste fase omvatten. We demonstreren ook efficiënte radiomarkering van DBCO-groep-gemodificeerde 13-nm-grootte goud nanodeeltjes met behulp van de 125I-gelabelde azide. Het gedetailleerde protocol in dit rapport zal synthetische chemici helpen om een nieuwe radiomarkeringsmethodologie te begrijpen voor de synthese van radiogelabelde producten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: De geoxideerde vorm van radioactief jodium is vrij volatiel en moet met voldoende lood schilden en lead flacons worden behandeld. Alle radiochemische stappen moeten in een goed geventileerde houtskool gefilterd kap worden uitgevoerd, en de experimentele procedures moeten worden gevolgd door radioactiviteit detectie-apparaten.

1. Bereiding van chemicaliën en de omgekeerde fase cartridge voor de synthese van de 125I-gemerkte azide

  1. Bereiding van reagentia in oplossing
    1. Los 1 mg van het azide precursor (2) in 150 pi absolute ethanol (figuur 1).
      OPMERKING: Een gedetailleerde syntheseprocedure voor de azide precursor (2) gemeld bij het vorige artikel 22.
    2. Los 1 mg chloramine T in 20 pl 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (pH = 7,4).
    3. Los 2 mg natriummetabisulfiet in 20 ui H2O
  2. preparatie van het patroon
    1. Was de TC18 patroon met 10 ml absolute ethanol, gevolgd door 10 ml H2O Laat de matrix van de cartridge met lucht niet droog.

2. radiosynthese van de 125I-gemerkte azide prosthetische groep

  1. Radioactieve jodering reactie van de precursor
    1. Voeg het azide precursor-oplossing (1 mg in 150 pi absolute ethanol) en azijnzuur (10 ui) aan een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    2. Voeg 150 MBq [125I] NaI in 0,1 M NaOH (50 pl) aan het reactiemengsel.
    3. Toevoegen chloramine T-oplossing (1 mg in 20 pl 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing) en sluit de microcentrifugebuis bevattende reactiemengsel.
    4. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten totdat de reactie voltooid radioactieve jodering.
    5. Toevoegen natriummetabisulfietoplossing (2 mg in 20 gl H 2 O) aan het reactiemengselde radioactieve jodering reactie te blussen.
    6. Trekken 0,2 pi van het ruwe product en verdun vervolgens met 100 ul oplossing (H2O / CH3CN, 1: 1) voor HPLC analyse.
      Opmerking: Voor alle HPLC experimenten, gebruik 0,1% mierenzuur bevattende H2 O (oplosmiddel A) en 0,1% mierenzuur bevattende acetonitril (oplosmiddel B) als elutiemiddelen.
    7. Analyseer het verdunde ruwe product met behulp van een omgekeerde fase analytische radio-HPLC (C18 omgekeerde fasekolom, stroomsnelheid: 1 ml / min; eluens gradiënt: 20% solvent B gedurende 0-2 min, 20-80% oplosmiddel B 2-22 min, 80-100% solvent B gedurende 22-23 min, en 100% solvent B gedurende 23-28 min, retentietijd: 16,4 min) (figuur 2).
  2. Zuivering van het ruwe product met preparatieve HPLC
    OPMERKING: Laat voldoende loden mantel rond HPLC onderdelen zoals de injector, kolom detector, inzameling flesjes en de houder waarin het effluent verzameld.
    1. intrekken the gehele reactiemengsel in een HPLC flesje. Spoel de reactiebuis met acetonitril (0,5 ml) en voeg de spoeling in dezelfde injectieflacon. Verdun de verzamelde oplossing met H2O (1 ml).
    2. Injecteer het ruwe product op een preparatieve radio-HPLC (C18 omgekeerde fasekolom, stroomsnelheid: 10 ml / min; eluens gradiënt: 20% solvent B gedurende 0-2 min, 20-80% solvent B gedurende 2-22 min, 80-100% solvent B gedurende 22-23 min, en 100% solvent B gedurende 23-28 min).
    3. Verzamel de radioactieve piek die de 125I-gemerkte azide (1) (tR HPLC onder deze omstandigheden 17,8-18,8 min) in een glazen reageerbuis (figuur 2).
    4. Meet de radiochemische opbrengst van de fractie met een radioactiviteit dosiskalibrator volgens het protocol van de fabrikant.
    5. Injecteer het gezuiverde product op een analytische radio-HPLC met behulp van dezelfde HPLC-omstandigheden voor de bepaling van de radiochemische zuiverheid van het product.
  3. Vastefase-extractie van het product
    1. Verdun de fractie die het gewenste product (1) met 40 ml zuiver H2O
    2. Voeg de verdunde oplossing in een geconditioneerd TC18 cartridge.
    3. Spoel de patroon met een extra 15 ml H2O
    4. Elueer het product (1) opgesloten in de patroon met 2 ml aceton in een 10-ml glazen flacon die wordt beschermd door een loden schild. Meet de radioactiviteit van het eluaat met een radioactieve dosis calibrator volgens het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: Dimethylsulfoxide (DMSO) of absolute ethanol kunnen ook worden gebruikt voor elutie van het product uit de patroon. Ongeveer 5-10% van de radioactiviteit gewoonlijk vast aan de patroon, en de resterende radiogelabelde product niet volledig geëlueerd met overmaat organisch oplosmiddel.
    5. Damp het aceton met een stroom stikstof of argongas.
    6. Los het residue met DMSO (100-200 ul) voor de volgende radiomerking stap.

3. Synthese van DBCO-group-geconjugeerde Gold Nanodeeltjes

  1. Modificatie van het oppervlak van 13-nm-sized gouden nanodeeltjes met DBCO-groep bevattende polyethyleenglycol
    1. Bereid natrium-citraat gestabiliseerd gouden nanodeeltjes (3) (gemiddelde size = 13 nm) op basis van een vorige verslag 24.
    2. Voeg een waterige oplossing van Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) waardoor de citraat gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (10 nM, 15 ml). De oplossing wordt gedurende 20 minuten op een rondschudapparaat.
    3. Voeg een waterige oplossing van DBCO-bevattende polyethyleenglycol thiol (gemiddeld molecuulgewicht = 5000, 100 pM, 1,5 ml). De oplossing wordt gedurende 2 uur op een rondschudapparaat.
  2. Zuivering van het DBCO groep gemodificeerde goud nanodeeltjes
    1. Zuiver het-DBCO-groep gemodificeerde gouden nanodeeltjes (4) </ Strong> Door opeenvolgende centrifugeren (11.400 x g, 15 min x 3).
    2. Giet het supernatant en voeg zuiver water voor resuspensie van het goud nanodeeltjes pellets.

4. Radioactief merken van DBCO-groep gemodificeerde Gold Nanodeeltjes via de Copper-vrije Click Reaction

  1. Synthese van 125I-gemerkt goud nanodeeltjes met de 125 I-gemerkt azide (1)
    1. Bereid een geconcentreerde oplossing van DBCO-groep gemodificeerd goud nanodeeltjes door centrifugatie (11.400 x g, 15 min), en dient de concentratie van de nanodeeltjes van goud tot 2 uM.
    2. Voeg 4,1 MBq van de 125-gemerkte azide (1) in DMSO (5 ui) aan een suspensie van gouden nanodeeltjes (4) (2 uM, 50 ui).
    3. Incubeer het verkregen reactiemengsel bij 40 ° C gedurende 60 minuten.
    4. Onttrek een aliquot (0,2 pl) van het ruwe product en toepassen op een silica-coated dunnelaagchromatografie (TLC) plaat.
    5. Ontwikkel het TLC plaat onder toepassing van ethylacetaat als mobiele fase.
    6. Plaats de TLC plaat op een radio-TLC scanner en laat de scanner het radioactief reactie (figuur 3) volgens het protocol van de fabrikant te volgen.
  2. Zuivering van het ruwe product
    1. Zuiver het reactiemengsel dat de 125-gemerkte gouden nanodeeltjes (4) door centrifugeren (11.400 x g, 15 min).
    2. Giet het supernatant en voeg zuiver water voor resuspensie van het goud nanodeeltjes pellets.
    3. Onttrek een aliquot (0,2 pl) van het gezuiverde product en toepassen op een met siliciumdioxide beklede TLC platen.
    4. Ontwikkel het TLC-plaat met ethylacetaat als de mobiele fase.
    5. Plaats de TLC plaat op een radio-TLC scanner en start de scanner om de radiochemische opbrengst en radiochemische zuiverheid van het 125-I gemerkt gol bepalend nanodeeltjes (4) (figuur 3) volgens het protocol van de fabrikant.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De radioactieve jodering reactie van de precursor stannylated (2) gebruikte 150 MBq [125I] NaI, azijnzuur en chloramine T bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten uitgevoerd om het radioactief gemerkte product te verschaffen (1). Na preparatieve HPLC zuivering van het ruwe mengsel, werd het gewenste product verkregen met 75 ± 10% (n = 8) van radiochemische opbrengst. Analytische HPLC wees uit dat de radiochemische zuiverheid van de 125I-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het algemeen, de waargenomen radiochemische opbrengst van het gezuiverde 125-gemerkte azide (1) was 75 ± 10% (n = 8). De radiolabeling werd bereikt met 50-150 MBq radioactiviteit, en de radiochemische resultaten zijn zeer consistent. Als [125I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) radioactief verval ondergaan langer dan een maand werd in de radioactieve jodering reactie, de radiochemische opbrengst van 1 werd waargenomen dat enigszins verminderd (53-65%). De...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Research Foundation of Korea, gefinancierd door de regering van de Republiek Korea, (Subsidienummers 2012M2B2B1055245 en 2012M2A2A6011335) en door het RI-Biomics Center van het Korea Atomic Energy Research Institute.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramin T trihydraatSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Natriummetabisulfiet SigmaS9000
MierenzuurSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethylsulfoxide SigmaD2650
AcetonSigma650501
EthanolSigma459844
Goud(III)chloride trihydraatSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5.000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silicagel 60 F254Merck
Analytische HPLCAgilent1290 InfinityModelnummer
Preparatieve HPLCAgilent1260 InfinityModelnummer
Analytische C18 reverse-phase kolomAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparatieve C18 reverse-phase kolomAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Modelnummer
Radio-isotoop dosis kalibratieCapintec, IncCRC -25R dosis kalibratieModelnummer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Radiolabeling Gold NanoparticlesCopper Free Click ReactionIodine 125 Azide Prosthetic GroupRadioiodination ProtocolHPLC PurificationRadio TLC AnalysisDBCO Functionalized NanoparticlesStrain Promoted Azide Alkyne CycloadditionRadiochemical Yield MeasurementSolid Phase Extraction

Related Articles