voorbereiding en In Vitro Karakterisering van-dendrimeer gebaseerde Contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de bereiding en karakterisering van een dendrimere magnetische resonantie imaging (MRI) contrastmiddel dat cyclen gebaseerde macrocyclische chelaten coördinerende paramagnetische gadolinium-ionen draagt. In een serie MRI-experimenten in vitro, deze agent produceerde een versterkte MRI signaal in vergelijking met de commercieel beschikbare monomere analoog.

Samenvatting

Paramagnetische complexen van gadolinium (III) met acyclische of macrocyclische chelaten zijn de meest gebruikte contrastmiddelen (CA) voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Hun doel is om de versoepeling snelheid van water protonen in het weefsel te versterken, waardoor de MR beeldcontrast en de specificiteit van de MRI-metingen toeneemt. Huidige klinisch goedgekeurde contrastmiddelen vanaf hoogmoleculaire moleculen die snel uit het lichaam geklaard. Het gebruik van dendrimeren als dragers van paramagnetische chelaten kunnen een belangrijke rol spelen in de toekomstige ontwikkeling van efficiëntere MRI contrastmiddelen. Met name de toename van lokale concentratie van het paramagnetische soorten resulteert in een hoger signaal contrast. Bovendien is dit CA levert een langere retentietijd tissue tijd vanwege het hoge molecuulgewicht en grootte. Hier tonen we een geschikte procedure voor de bereiding van macromoleculaire MRI contrastmiddelen op basis van poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimeren monomacrocyclische DOTA-type chelatoren (DOTA - 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraacetaat). De chelerende eenheid werd toegevoegd door het benutten van de reactiviteit van het isothiocyanaat (NCS) groepen naar het oppervlak amine- groepen van de PAMAM dendrimeer te thioureum brugvorming. Dendrimere producten werden gezuiverd en geanalyseerd door middel van kernmagnetische resonantie spectroscopie, massaspectrometrie en elementanalyse. Tenslotte werden hoge resolutie MR beelden die zijn opgenomen en het signaal contrasten verkregen uit de voorbereide dendrimere en in de handel verkrijgbare monomeer agenten werden vergeleken.

Inleiding

Magnetic resonance imaging (MRI) is een krachtige en niet-ioniserende beeldvormingstechniek schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en klinische diagnostiek vanwege de invasieve aard en uitstekende intrinsieke zacht weefsel contrast. De meest gebruikte MRI methoden gebruiken het signaal verkregen uit water protonen leveren van hoge resolutie beelden en informatie binnen de weefsels op basis van verschillen in de dichtheid van het water signalen. De signaalintensiteit en de specificiteit van de MRI-experimenten kan verder worden verbeterd middels contrastmiddelen (CA). Dit zijn paramagnetische of superparamagnetische soorten die invloed hebben op de longitudinale _(T1) en transversale _(T2) relaxatie maal respectievelijk ^1,2.

Complexen van het lanthanide-ion gadolinium met polyaminozuren polycarbonzuur liganden de meest gebruikte T ₁ CA's. Gadolinium (III) verkort de T ₁ ontspanningtijd van water protonen, waardoor het signaal contrast in MRI-experimenten ³ toeneemt. Echter, ionische gadolinium giftig; de grootte benadert die van calcium (II), en ernstige gevolgen calcium bijgestaan ​​signalering in cellen. Daarom worden acyclische en macrocyclische chelaten gebruikt om deze toxiciteit te neutraliseren. Verschillende multidentaat liganden zijn tot nu toe ontwikkeld, waardoor gadolinium (III) complexen met een hoge thermodynamische stabiliteit en kinetische inertheid ^1. Op basis van het 12-ledige azamacrocycle cyclen, met name het tetracarbonzuur afgeleide DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-acetaat) zijn de meest onderzochte en toegepaste complexen van deze CA klasse.

Toch GdDOTA-type CA's zijn lage gewicht systemen moleculair, het weergeven van bepaalde nadelen zoals een lage contrast efficiency en een snelle renale excretie. Macromoleculaire en multivalente CA kan een goede oplossing voor deze problemen ⁴ zijn. Sinds CA biodistributie wordt vooral bepaald door de grootte, macromoleculaire CA tonen veel langere retentietijden in de weefsels. Even belangrijk is de meerwaardigheid van deze middelen resulteert in een verhoogde lokale concentratie van de monomere MR probe (bijvoorbeeld GdDOTA complex), fundamentele verbetering van de verworven MR-signaal en het meten kwaliteit.

Dendrimeren behoren tot de meest geprefereerde draagstructuren voor de bereiding van meerwaardige CA voor MRI ^4,5. Deze sterk vertakte macromoleculen met goed gedefinieerde afmetingen zijn gevoelig voor verschillende koppelingsreacties te binden. In dit werk, melden wij de voorbereiding, zuivering en karakterisering van een dendrimere CA voor MRI, bestaande uit een generatie 4 (G4) poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimeer gekoppeld aan GdDOTA-achtige chelaten (DCA). We beschrijven de synthese van de reactieve DOTA-derivaat en de koppeling met de PAMAM dendrimeer. Bij complexering met Gd (III), de standaard fysisch-chemische karakterisering procedure van DCA werd uitgevoerd. Tenslotte werden MRI experimenten uitgevoerd om het vermogen van DCA MR beelden te produceren met een sterker contrast dan die verkregen uit laagmoleculaire CA tonen.

Protocol

1. Bereiding van DCA

1. Synthese van de monomeereenheid 4 ^6.
   1. Synthese van 4- (4-nitrofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) boterzuur-tert-butylester (2).
      1. Te (4,7-bis-tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetra-cyclododec-1-yl) azijnzuur-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) in N, N-dimethylformamide ( DMF, 5 ml), voeg kaliumcarbonaat (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) toe en roer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 45 min.
         OPMERKING: macrocyclus 1 bereid uit cyclen en tert-butyl broomacetaat volgens de eerder gepubliceerde werkwijze ^7.
      2. Tert add-butyl-2-broom-4- (4-nitrofenyl) butanoaat (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) Portiegewijs gedurende 1 uur. Zet roeren van het mengsel onder thij dezelfde reactieomstandigheden voor de volgende 18 uur.
         Opmerking: Tert-butyl-2-broom-4- (4-nitrofenyl) butanoaat werd bereid uit 4- (4-nitrofenyl) boterzuur, thionylchloride en broom volgens de eerder gepubliceerde werkwijze ^8.
      3. DMF verwijderd via bulb-to-bulb vacuümdestillatie bij 40-60 ° C ^9.
      4. Zuiver het residu door kolomchromatografie (silicagel, 7% methanol / dichloormethaan) product 2 werd verkregen als een bruine amorfe vaste stof (1,09 g, 72%) ^10.
   2. Synthese van 4- (4-aminofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) boterzuur-tert-butylester (3).
      1. Los het nitrobenzeenderivaat 2 (1,00 g, 1,28 mmol) in ethanol (10 ml) en 7 N ammonia in methanol (150 pl). palladium toevoegen geactiveerde koolstof als katalysator (Pd / C, 150 mg, 15 gew%) aan de Solutiop.
      2. Schud het heterogene mengsel gedurende 16 uur onder een waterstofatmosfeer (2,5 bar) in de Parr hydrogenator apparaat.
      3. Bereid een koek van diatomeeënaarde door suspenderen in ethanol en het filteren van de suspensie door een gesinterde glazen trechter. Giet de schorsing van 1.1.2.2 in de voorbereide taart aan de Pd / C katalysator te verwijderen door middel van filtratie.
      4. Verwijder het oplosmiddel door zacht destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C), wat verbinding 3 werd verkregen als een bruine amorfe vaste stof (0,91 g, 95%).
   3. Synthese van 4- (4-isothiocyanatofenyl) -2- (4,7,10-tris- tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-yl) boterzuur-tert-butylester (4).
      1. Voeg thiofosgeen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) Aan een mengsel van 3 (0,91 g, 1,22 mmol) en triethylamine (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 equiv.) In dichloormethaan (15 ml).
      2. Krachtig roer de reactie mixture met een magnetische roerder bij kamertemperatuur gedurende 16 uur.
      3. Verwijder het oplosmiddel door zacht destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C) en zuiver het ruwe product door kolomchromatografie (silicagel, 5% methanol / dichloormethaan) om het product 4 werd verkregen als een lichtbruine amorfe vaste stof (0,51 g, 53%).
2. Synthese van het dendrimeer DCA.
   1. Synthese van het dendrimeer 5.
      1. Neem G4 PAMAM dendrimeer (667 mg, 10% dendrimeer-oplossing in methanol, 4,67 umol), verdampt de methanol door voorzichtig destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C) en los het residu in DMF (4 ml) .
      2. Voeg triethylamine (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 equiv.), Roeren gedurende 45 minuten bij 60 ° C en voeg isothiocyanaat 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. Ten opzichte van het oppervlak amino- groepen van het dendrimeer) portiegewijs over 1 uur.
      3. Roer het reactiemengsel met een magnetische roerder bij 45 ° C gedurende 48 uur.
      4. Verwijder het oplosmiddel door middel van bulb-to-bulb vacuümdestillatie bij 40-60 ° C.
      5. Zuiver het residu door grootte-uitsluitingschromatografie onder toepassing van een lipofiele gelfiltratiemedium en methanol als eluens. Om de kolom te pakken, zwel het filtermedium in methanol gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (> 4 ml methanol per 1 g poeder) zonder druk. Uitvoeren decantering door het verzamelen van 1 ml fracties.
      6. Analyseer de verzamelde fracties met dunnelaagchromatografie (TLC). Ontwikkel het TLC-plaat in 15% methanol / dichloormethaan (alleen de meest polaire vlek op de basislijn is afkomstig van dendrimere product). Damp de verzamelde fracties door zachte destillatie op een rotatieverdamper (badtemperatuur -40 ° C) tot 5 product (270 mg, 91%) te verkrijgen.
   2. Synthese van het dendrimeer 6.
      1. Los het beschermde chelator dendrimere 5 (270 mg, 4,23 umol) in mierenzuur (5 ml) en gedurende 24 uur roeren van het mengsel bij 60 ° C.
      2. Damp het mierenzuur door destillatie op een rotatieverdamper (~ 15 mbar, waterbadtemperatuur ~ 40 ° C) en vriesdrogen het product 6 te geven (druk ~ 0,2 mbar) ^9.
   3. Synthese van de dendrimere contrastmiddel (DCA)
      1. Los het dendrimere chelator 6 (4,35 umol) in water en op pH 7,0 met 0,1 M natriumhydroxide.
      2. Ontbinden GdCl ₃ · 6H ₂ O (113 mg, 304 umol) in water (1 ml) en druppelsgewijs aan de oplossing van 6 chelator gedurende 4 uur toe te voegen; handhaven van de pH op 7,0 met natriumhydroxide oplossing (0,05 M) door het meten van de pH met een pH-meter.
      3. Roer het mengsel met een magnetische roerder bij kamertemperatuur temperature gedurende 24 uur.
      4. Voeg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 158 mg, 426 umol) aan de oplossing portiegewijs gedurende 4 uur om de overmaat te verwijderen Gd (III), terwijl de pH op 7,0 met natriumhydroxide oplossing (0,05 M). Roer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
      5. Uitvoeren size-exclusion chromatografie om de meerderheid van GdEDTA en de overmaat EDTA te verwijderen. Gebruik een hydrofiele gelfiltratiemedium gezwollen in water om de kolom te pakken. Verminder het mengsel tot een geschikt volume en de kolom geladen. Elueer de kolom met gedeïoniseerd water zonder druk.
      6. Centrifugeer het monster met behulp van een 3 kDa centrifugale filtereenheid gedurende 30 minuten bij 1800 xg centrifugaalkracht aan de residuen van GdEDTA EDTA en verwijderen. Herhaal deze stap (ongeveer vijf maal) totdat het filtraat toont de afwezigheid van EDTA en GdEDTA. Breng het monster in een kolf, verdampen, en vervolgens vriesdrogen het oplosmiddel om een ​​gebroken wit product als de uiteindelijke DCA verkrijgen (186 mg, 71%).
         OPMERKING: Controleer afwezigheid van EDTA en GdEDTA door middel van ESI-MS.
      7. Bevestigen de afwezigheid van Gd (III) als een gratis ion met de xylenol oranje-test. Los het filtraat (0,5 ml) in een acetaatbuffer (pH 5,8). Voeg een paar druppels van een xylenol oranje oplossing en volgen de kleurverandering (geel of violette kleur geeft de aanwezigheid of afwezigheid van vrij Gd (III) ionen in oplossing respectievelijk) ^11.

2. In vitro karakterisering van dendrimere Producten

1. Schatting van het aantal macrocyclische DOTA-eenheden gekoppeld met de PAMAM dendrimeer (belading van het dendrimeer met DOTA-achtige macrocyclische)
   1. Schatting met ^1H NMR (NMR - kernmagnetische resonantiespectroscopie).
      OPMERKING: Deze procedure is mogelijk bij dendrimeren 5 en 6, maar niet op DCA.
      1. Noteer het ^1H NMR spectrum ^12.
      2. Integreer het aromatische gebied en de twee afzonderlijke alifatische regio (1. signalen van het dendrimeer en alifatische protonen macrocyclische 2. signalen van de t-Bu groepen) of onder alifatisch regio dendrimeren 5 en 6, respectievelijk.
         Opmerking: Er is geen apart signaal in het alifatische gebied afkomstig van de t-Bu groepen dendrimeer 6 aangezien ze zijn gehydrolyseerd.
      3. Gebruik Eq. 1 of Vgl. 2 het aantal macrocyclische eenheden (n), waarin R = de verhouding van integralen schatten (alifatisch / aromatisch van vgl. 1 of alifatisch-dendrimeer / alifatische t- Bu in vgl. 2), H _dend = aantal protonen in dendrimeer, H _Ar = het aantal aromatische protonen, H _tBu = het aantal protonen in t-Bu groep en H _mAC = het aantal protonen in een macrocyclus.
         Opmerking: Ofwel Eq. 1 of Vgl. 2 kunnen worden gebruikt for dendrimeer 5, terwijl slechts Eq. 1 kan worden gebruikt voor dendrimeer 6. Sinds uitwisselbare protonen (op amines, amides, thioureumverbindingen of carboxylaten) zijn meestal worden vervangen door deuterium, waren ze niet verondersteld in de berekeningen. Hier, H _dend = 1128 (5) of 1000 (6), H _Ar = 4 en H _MAC = 27 gebruikt.
         (1)
         (2)
   2. Schatting van elementairanalyse met de verhouding van stikstof tot zwavel.
      1. Voer de elementaire analyse van de vaste dendrimere monster (DCA in dit werk).
      2. Gebruik Eq. 3 het aantal macrocyclische eenheden (n), waarin R = de verhouding bepaald en% N% S, N of S _{dend dend} = het aantal schattenstikstof- of zwavelatomen in het dendrimeer en N of S _{MAC MAC} = aantal stikstof- of zwavelatomen in een macrocyclische eenheid.
         Opmerking: De factor 2,29 wordt verkregen uit de verhouding van de atoommassa van zwavel en stikstof. In dit werk, N _dend = 250, S _dend = 2, N = 5 _mac en _mac S = 1 gebruikt.
         (3)
   3. Estimation met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF).
      1. Voer de MALDI-TOF MS analyse ^13.
      2. Bereken het aantal macrocyclische eenheden (n) volgens Vgl. 4, waarbij M _z = de waargenomen massa (m / z), z = de lading van de soort, M _dend = de massa van de dendrimere enerzijds, en M _mac = de massa van een macrocyclische eenheid.
         NEETE: M _dend = 14.306 en M _mac = 719 werden gebruikt in dit werk.
         (4)
2. Bepaling van DCA concentratie ([DCA]): Bulk magnetische gevoeligheid meting (BMS)
   1. Ontbinden DCA (5-10 mg) in water (360 ui) in een plastic flacon buis ([DCA] ~ 5-10 mM).
      OPMERKING: [DCA] dient in het traject van 5-10 mM om mogelijke overlapping van t- BuOH resonanties voorkomen bij monsterconcentraties> 15 mM, met de resonantie van water bij δ = 4,7 ppm.
   2. Voeg 60 ul van D ₂ O: t- BuOH mengsel (2: 1 v / v) aan de waterige oplossing van DCA en meng de resulterende oplossing (420 pl) met een Vortex mixer.
   3. Overdracht 400 ul van het monster in een NMR-buis en buitenste plaats een coaxiale NMR inzetbuis met een t-BuOH: _H2O mengsel (10:90 v / v) in de monsterbuis.
   4. Recordhet ^1H NMR spectrum en meet de frequentieverschuiving tussen de resonantiesignalen die uit t- BuOH in de binnenste en buitenste buizen NMR (referentie) ^12.
   5. Gebruik Eq. 5 aan de [DCA], waarbij T = de absolute temperatuur te bepalen, Δχ = het opgenomen shift, p _eff = de effectieve magnetische moment voor een lanthanide-ionen (μ _eff = 7,94 voor Gd (III) ^14, en s = een constante afhankelijke van de vorm van het monster en de positie in het magnetische veld (0, 1/3 en 1/6 in het geval van een bol, cilinder evenwijdig aan, en de cilinder loodrecht op het magnetische veld, respectievelijk).
      Opmerking: De berekende waarde verkregen voor de [DCA] worden veranderd in de oorspronkelijke concentratie als gevolg van de toevoeging van de D ₂ O: t- BuOH-oplossing (60 ui).
      (5)
3. dynamisch lichtverstrooiing (DLS) metingen.
   1. Bereid een gefilterde DCA-oplossing (0,2 urn polytetrafluorethyleen / PTFE filter, 0,75 mM per Gd (III)) in 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) buffer (25 mM, pH 7,4) en breng deze in een cuvet voor de DLS meting.
   2. Plaats de cuvet in de DLS inrichting en stel de volgende parameters: 5 herhalingen van 15 scans (1 scan = 12 sec, brekingsindex = 1,345, absorptie = 1%) zonder vertraging tussen de scans en temperatuurevenwicht 30 seconden voor de opname .
   3. Exporteert de verkregen gegevens en het verkrijgen van de grootteverdeling histogram door het uitzetten populatie (%) als een functie van grootte (hydrodynamische diameter).
4. Meting van de longitudinale en transversale relaxiviteiten.
   OPMERKING: Een soortgelijke procedure werd reeds beschreven aan de hand van de relaxatietijd analyzer ^15; Deze procedure werd uitgevoerd met een 300 MHz NMR-spectrometer met Topspinsoftware.
   1. Bereid een reeks van DCA-oplossingen in H ₂ O: D ₂ O (500 pl, 10% D ₂ O in H ₂ O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 en 5,0 mm, [HEPES ] = 25 mM) van de DCA voorraad monster (zie paragraaf 2.2).
   2. Transfer 450 ul van de oplossing in een NMR-buis en plaats deze in het instrument.
   3. Optimaliseer de acquisitie parameters (90 ° excitatie pulsduur (p1) en bestraling frequentieverschuiving (O ₁₎₎ en voer vervolgens de T ₁ en T ₂ experimenten met behulp van de inversie recovery (IR) en Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) pulssequenties, respectievelijk.
   4. Bepaling van _T1 en _T2 relaxatietijden.
      1. Selecteer de opgenomen meting, proces van de 2D-spectrum in de F2 dimensie, en het uitvoeren van de interactieve fase correctie.
      2. Selecteer de juiste slice (piek met maximale intensiteit) bij de analyse / T _{1 / T 2 ontspanning venster, integreren, en de uitvoer van de regio om de ontspanning module.}
      3. Selecteer de juiste fitting functie (invrec of uxnmrt2 voor IR en CPMG experimenten, respectievelijk) aan de T ₁ of T ₂ relaxatietijden te verkrijgen.
   5. Herhaal stap 2.4.4.2-2.4.4.4 voor alle overige [DCA] oplossingen.
   6. Bereken de relaxatiesnelheden (R ₁ en R ₂₎ uit de verkregen waarden T ₁ (R = _1,2 1 / _1,2 T).
   7. Plot R ₁ en R ₂ (sec ^-1) als functie van Gd (III) -concentratie in mM.
   8. Bepaal de longitudinale en transversale relaxiviteiten, r ₁ en r ₂ (mM ^-1 sec ^-1), uit de helling van de aangebrachte lijn, zoals gedefinieerd door Vgl. 6, waarin _{Ri, obs} = de longitudinale (i = 1) of dwars (i = 2) diamagnetische relaxatiesnelheid vanwater in afwezigheid van paramagnetische soorten en [GD] = de concentratie van Gd (III) gebruikt in het experiment.
      (6)

3. In vitro MRI; Vergelijking tussen DCA en GdDOTA

1. Voorbereiding van de buis fantomen
   1. Bereid waterige oplossingen van DCA (4 x 350 pi) en GdDOTA (4 x 350 pi) en water monsters (4 x 350 pi) twee sets van experimenten waarbij de concentratie van de contrastmiddelen wordt berekend: (3.1.1.1) per Gd (III) of (3.1.1.2) per molecuul.
      1. Bereid twee DCA samples en twee GdDOTA monsters met concentraties van 0,5 en 1,0 mM per Gd (III) resp. Bovendien, voor te bereiden twee watermonsters (als controle-buizen).
      2. Bereid twee DCA monsters (2,5 en 5,0 mM per Gd (III) of 0,05 en 0,1 mM per dendrimere molecuul), twee GdDOTA monsters (0,25, 0,5 mM) en twee watermonsters (control tubes).
         LET OP: De juiste DCA en GdDOTA concentraties moeten worden voorbereid door het verdunnen van de respectieve voorraad monsters met concentraties bepaald via de BMS methode (zie punt 2.2) met HEPES buffer (pH 7,4). Om de berekening te vereenvoudigen, n = 50 werd uitgegaan van het gemiddelde aantal macrocyclische eenheden per dendrimeer molecuul. Daarom is de verhouding van DCA: GdDOTA was 1: 5, berekend op een basis per molecuul.
   2. Plaats de monsters in 300 ul plastic flesje buizen, het vermijden van de aanwezigheid van luchtbellen in de oplossing.
      OPMERKING: De grootte van de plastic flesje buizen afhankelijk van het type en de grootte van de radiofrequente spoel gebruikt (hier een voorbeeld waarbij het volume spoel wordt gegeven).
   3. Plaats de monsters in een injectiespuit (60 ml volume), vul het met 1 mM GdDOTA oplossing, en plaats het in de scanner.
      Opmerking: De monsters werden in de waterige oplossing van GdDOTA geplaatst gevoeligheid effecten (variaties in het magnetische veld en voorkomentrength die in de buurt van interfaces tussen stoffen van verschillende magnetische gevoeligheid) optreden.
2. Parameter optimalisatie en beeldvorming.
   1. Gebruik de anatomische scan (Localizer / TriPilot) aan de spuit met de monsters positie in het isocentrum van de magneet.
   2. Druk op het verkeerslicht (aanpassing scan) om aanpassingen uit te voeren voor shimming (aanpassing van het magnetisch veld homogeniteit) van het hele volume, de centrale frequentie (O _1), de ontvanger versterking (RG), en de zend gain (TX0 en TX1).
   3. Voor T _1-gewogen (T _1w) beeldvorming, selecteert u de snelle methode lage hoek shot (FLASH).
   4. Kies coronale slice voor de verticaal geplaatste (spuit horizontaal) monsters in de scanner met behulp van de Localizer scan.
   5. Gebruik Eq. 7 voor de optimalisatie van de contrast-ruisverhouding (CNR) opnameparameters ^16, waarbij α = de kantelhoek, TE = de echotijd, TR =de herhalingstijd en T _{1, A,} T _{1, B} = T ₁ keer monster A (T _{1, A)} en monster B (T _{1, B)} die de CNR worden gemaximaliseerd (hetzelfde geldt voor T ₂ keer: _{2 T, A} en T _{2, B).}
      OPMERKING: T ₁ en _T2 relaxatietijden worden ingesteld op waarden verkregen uit de metingen van longitudinale en transversale relaxiviteiten (sectie 2.4), terwijl TE, TR en α moeten worden verkregen van de CNR optimalisatie berekening.
      (7)
   6. Het verwerven van de afbeelding met de parameters verkregen in de voorgaande stap (3.2.5).
   7. Bereken de signaal-ruisverhouding (SNR).
      1. Laad de verworven afbeelding T _1w (scan) in de Image display & processingvenster, en klik op Define regio van belang (ROI).
      2. Kies een cirkelvormige ROI en trek het op het monster positie en achtergrond. Vervolgens op display de gemiddelde signaalamplitude (S _signaal) en de standaarddeviatie van de achtergrond _(ruis S) te verkrijgen.
      3. Herhaal stap 3.2.7.2 voor de DCA, GdDOTA en watermonsters.
      4. Bereken de SNR met de formule: SNR = S _signaal / _ruis S.
   8. Na een enigszins gewijzigde procedure uit te voeren _T2-gewogen (T _2w) beeldvorming met behulp van de snelle overname met ontspanning enhancement (RARE) methode. Voor optimalisatie van de CNR acquisitieparameters Gebruik Vgl. 8.
      (8)

Resultaten

De bereiding van DCA bestond uit twee fasen: 1) synthese van de monomere DOTA-type chelator (figuur 1) en 2) het koppelen van de chelator met de G4 PAMAM dendrimeer en eropvolgende bereiding van het dendrimere Gd (III) complex (figuur 2) . In de eerste fase wordt een basis-cyclen DOTA-type chelator met vier carbonzuren en een orthogonale groep geschikt is voor verdere synthetische modificaties bereid. De bereiding begonnen van 1<...

Discussie

Voorbereiding van de dendrimere MRI-contrastmiddel vereist juiste keuze van de monomere eenheid (dat wil zeggen, de chelator voor Gd (III)). Ze verminderen de toxiciteit van dit paramagnetische ion en tot nu toe een groot aantal acyclische en macrocyclische chelatoren dienen daartoe ^1-3. Hiervan macrocyclische DOTA-type chelatoren bezitten de hoogste thermodynamische stabiliteit en kinetische inertheid en daarmee zijn de meest geprefereerde keuze voor de bereiding van inerte MRI contrastmiddelen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cyclen	CheMatech	C002
tert-Butyl bromoacetaat	Alfa Aesar	A14917
N,N-Dimethylformamide	Fluka	40248
Kaliumcarbonaat	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrofenyl)butyrzuur	Aldrich	335339
Thionylchloride	Acros Organics	382662500	Opmerking: Corrosieve stof; giftig bij inademing
Broom	Acros Organics	402841000	Opmerking: veroorzaakt ernstige huidbrandwonden, dodelijk bij inademing
Di-ethylether	elke bron
Natriumsulfaat	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidaat	Aldrich	364789	Opmerking: ontvlambare stof; irriteert de huid en ogen
Borontrifluoride etheraat	Acros Organics	174560250	48% BF3. Opmerking: Ontvlambare stof; veroorzaakt huidbrandwonden, dodelijk bij inademing
Natriumbicarbonaat	Acros Organics	424270010
Ethyl-acetaat	elke bron		Voor kolomchromatografie
n-Hexaan	elke bron		Voor kolomchromatografie
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) destillatieapparaat	Büchi		Modeltype: Glazen oven B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Methanol	elke bron		Voor kolomchromatografie
Dichloormethaan	elke bron		Voor kolomchromatografie
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
Ammoniak	Acros Organics	428381000	7 N oplossing in Methanol
Palladium	Aldrich	643181	15% nat
Hydrogeneringsapparaat PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Gesinterde glazen trechter	elke bron
Thiofosgeen	Aldrich	115150	Opmerking: irriterend voor de huid; giftig bij inademing
Triethylamine	Alfa Aesar	A12646
Dichloormethaan	Acros Organics	348460010	Extra droog
Magneetroerer	elke bron
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. oplossing in MeOH
Lipofiele Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Dunne laag chromatografie platen	Merck Millipore	1.05554.0001
Mierenzuur	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	elke bron
Gadolinium(III)chloride hexahydraat	Aldrich	G7532
Natriumhydroxide	Acros Organics	134070010
pH-meter	elke bron
Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat	Aldrich	E5134
Massaspectrometer (ESI)	Agilent		Ion trap SL 1100
Acetaat buffer	elke bron		pH 5.8
Xylenol oranje	Aldrich	52097	20 μM in acetaat buffer
Hydrofiele Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membraan (MWCO 3000)
Centrifuge	elke bron
NMR spectrometer	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Versie 2.1
Combustieanalyse instrument	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elementaire Analyser
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxide	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	elke bron
Norell NMR buizen	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxiale buis	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0,20 μm PTFE filter	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastic buisjes	elke bron
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI scanner	Bruker		BioSpec 70/30 USR magneet (7 T). Opmerking: mogelijke gevaren in verband met hoge magnetische velden
RF spoel	Bruker		Dual frequentie volume spoel (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software)	Bruker		Versie 5.1