Een methode voor het extraheren Pigmenten van Squid Doryteuthis pealeii

Samenvatting

Een protocol voor de extractie van de pigmenten uit de nanostructuur korrels in squid Doryteuthis pealeii chromatoforen wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Cephalopoden kunnen snelle en adaptieve veranderingen in huidkleuring ondergaan voor doeleinden zoals waarneming, communicatie, verdediging en voortplanting. Deze vermogens worden gedeeltelijk ondersteund door de uitbreiding en inkrimping van pigmentorganen, bekend als chromatoforen. Hoewel bekend is dat de chromatoforen een verankerd netwerk van gepigmenteerde korrels bevatten, zijn hun structuur-functie-eigenschappen niet volledig beschreven. We beschrijven een methode voor het isoleren van de nanogestructureerde korrels in de chromatoforen van de inktvis Doryteuthis pealeii en laten zien hoe hun bijbehorende pigmenten kunnen worden geëxtraheerd in zure oplosmiddelen. Om dit te bereiken, wordt de chromatofoor bevattende huidlaag eerst handmatig geïsoleerd met behulp van een oppervlakkige dissectie, en worden de pigmentkorrels verwijderd door middel van sonicatie, centrifugatie en wascycli. Pigmenten die zich in de gezuiverde korrels bevinden, worden vervolgens geëxtraheerd via zure methanoloplossingen, waardoor nanostructuren met kleinere diameters overblijven die vrij zijn van zichtbare kleur. Deze extractieprocedure levert een opbrengst van 58% op van oplosbare pigmenten geïsoleerd uit korrels. Door deze methode te gebruiken, kan de samenstelling van de chromatofoorpigmenten worden bepaald en worden gebruikt om inzicht te geven in het mechanisme van adaptieve kleuring bij cephalopoden.

Inleiding

Koppotigen zoals inktvis, inktvis en octopus hebben de mogelijkheid om hun uiterlijk te camoufleren en signalering dynamisch veranderen. ^1-6 Deze mogelijkheid wordt mede ondersteund door de selectieve areal uitbreiding van gepigmenteerde organen bekend als chromatoforen. ^4,7-9 chromatoforen zijn zachte actuatoren die een netwerk van nanogestructureerde pigmentkorrels voordoen binnen cytoelastic sacculus radiaal is verankerd door spiervezels bevatten. ^1,3 Daar ze bediend, chromatoforen breiden met 500% in gepresenteerd oppervlak verspreiden van de granules gedurende het orgel. ^{3,7 , 10,11} Wanneer deze actie onderling over een aantal chromatoforen de totale kleur van het dier wordt gewijzigd. Hoewel bekend is dat de pigmentkorrels bijdragen kleurverandering, de samenstelling is onbekend. We beschrijven een werkwijze voor het isoleren en zuiveren chromatophore pigmenten die kunnen worden aangepast voor toekomstig compositiestudies.

De isolatie van pigmentkorrels gaat om een meerdere stappen extractie, homogenisering, en zuivering procedure. ^3,12 Chromat die weefsel wordt geoogst door zorgvuldige uitroeiing van de inktvis. Een digestie en homogeniseren wordt vervolgens gebruikt om het omringende weefsel dissociëren en scheiden de chromatophore cellen. De nanostructuur korrels zijn vervolgens geïsoleerd en gezuiverd uit de resterende chromatoforen met behulp van herhaalde sonicatie en centrifugeren. Na zuivering, worden pigmenten gewonnen uit de korrels in een proces dat geschikt is bij de winning van zichtbare kleur van vlindervleugels middels zure methanoloplossingen. ¹³ Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en spectrofotometrie worden gebruikt om te bevestigen dat de chromatophore pigmenten met succes worden geëxtraheerd door gebruik dit proces.

Deze werkwijze beschrijft de isolatie van chromatophore granules die wordt gebruikt om de moleculaire bijdragen c staandoloration in koppotigen. ¹² kleine molecule extracties van gehele dieren kan vaak een lang en moeizaam proces zijn. Het doel is om toekomstige onderzoekers van een effectieve en gemakkelijke protocol te informeren voor de verwerving van pigmenten uit de nanostructuur korrels in koppotigen.

Protocol

Ongewervelde dieren studies hierin uitgevoerd worden niet geregeld in de Verenigde Staten; dus de Institutional Animal Care en gebruik Comite heeft geen bevoegdheid tot herziening van dergelijke protocollen. In plaats van deze die niet onder de jurisdictie van de regelgeving in de Verenigde Staten, de auteurs verklaar dat deze studies werden uitgevoerd met een oprechte poging in de richting van het ethisch gebruik, zorg en behandeling van deze dieren, het aantal personen dat werd geminimaliseerd en deze inspanningen zijn in overeenstemming met de Basel verklaring en de Internationale Raad voor Proefdierkunde (ICLAS) ethische richtlijnen.

1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection

1. Aankoop onthoofd inktvis D. pealeii van de afdeling Marine Resources in het Marine Biological Laboratory in Woods Hole, MA of van een verse vismarkt. Niet specimens die zijn filets of eerder gewijzigd om deze procedure te gebruiken. Met name de chromatophore laag moet nog intact op het monster zijn.
   1. Wanneer de dieren niet direct worden gebruikt, bewaar ze bij -20 ° C tot gebruik. Om de monsters te ontdooien, plaats ze in water op kamertemperatuur gedurende 1 uur voorafgaand aan de dissectie.
2. Gebruikt roestvrij stalen rechte puntig dissectie scharen, langs de postérieure zijde van het dier te snijden. Begint bij de basis van de ventrale mantel en sluit op de vin gebied.
3. Verwijder alle van de interne organen (maag, kieuw, inkt klier, voortplantingsorganen, systemische hart en arm hart) door ze te tillen met ontleden pincet en het afsnijden van hun bindweefsel met behulp van dissectie schaar. Gooi organen in een specimen zak.
4. Gebruik ontleden T-pinnen om de mantel pin (fin zijde naar boven) in een standaard 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "aluminium dissectie pan met een flexibele dissectie pad. Dompel het weefsel in 250 ml van zeewater die door middel van een eenmalige polystyreen vacuümfiltratie systeem is gefilterdmet 0,2 urn poriën.
5. Verwijder voorzichtig de epidermale huidlaag (ondoorzichtige kleur) met ontleden tang, het bijhouden van de chromatophore bevattende huidlaag intact. Zodra de epidermale laag wordt verwijderd, gooi het in een monster zak.
6. Ontleden kleine (1 cm x 1 cm) delen van de chromatophore laag met een tang en dissectie schaar. Verzamel monsters in 1,5 ml micro-centrifugebuis (vul helft van elke holle buis met de ontleed weefsel).
7. Voeg 500 gl gefiltreerd zeewater aan het weefsel bevattende buizen. De monsters kunnen 's nachts worden opgeslagen bij 4 ° C.

2. Isoleren Chromat pigmentkorrels

1. tissue Spijsvertering
   1. Bereiding van Papaïne / collagenase
      1. Weeg 30 mg collagenase en 5 mg papaïne met een 4 "x 4" low stikstof wegen papier. Transfer deze in een 50 ml polypropyleen centrifugebuis met een schroefdop.
      2. Meet 10 ml deionized water met behulp van een gegradueerde pipet. Voeg direct naar flacon met papaïne / collagenase. Vortex hoogste stand totdat de oplossing helder is.
   2. Het verwijderen van extracellulaire Tissue
      1. Centrifugeer de verzamelde chromatophore weefsel van stap 1,7 gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Gooi de bovenste laag van het zeewater in een plastic afval emmer.
      2. Voeg 500 ul van de papaïne / collagenase-oplossing aan het weefsel via een P1000 variabel volume eenkanaals micropipet. Vortex elk monster gedurende 1-2 minuten op de hoogste stand.
      3. Sonificeer de monsters gedurende 5 minuten bij een frequentie van 40 kHz tot cellen dissociëren uit het omringende weefsel.
      4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Verwijder het supernatant in een plastic afval emmer.
      5. Centrifugeer de verzamelde chromatophore weefsel gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Gooi de bovenste laag van het zeewater in een plastic afval emmer. Herhaal dit nogmaals.
      6. Handmatig verwijderen van alle resterende grote weefsel secgen die niet verteren in dit proces met een tang voordat u verder gaat met de volgende stap.
2. Isoleren van de pigmentkorrels
   1. Bereiding van homogenisatiebuffer
      1. Weeg 2,38 g (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) (HEPES, 100 mM), 0,095 g magnesiumchloride (10 mM), 0,856 g kalium-aspartaat (50 mM) en 0,015 g dithiotreïtol (1 mM). Over in een 150 ml polystyreen container met een schroefdop. Voeg een commerciële mini tablet proteaseremmer.
      2. Meet 100 ml gedemineraliseerd water met een maatcilinder. Voeg direct bij de container met de homogenisering zouten. Vortex totdat de oplossing helder is.
   2. Homogenisering van pigmentkorrels
      1. Centrifugeren elk monster uit stap 2.1 bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant in een plastic afval emmer. Dit monster moet leegte van extracellulaire weefsel.
      2. Voeg 500 &# 181; l van homogenisering buffer aan elke buis en vortex voor 1-2 minuten elk om grondig te mengen van de monsters. Sonificeer de monsters gedurende 30 min (~ 40 kHz) en volgen 5 min centrifugeren bij 14.000 x g.
      3. Verwijder het supernatant in een plastic emmer, en herhaal de vorige stap 2-3 keer naar de volledige vertering van de chromatophore sacculus en eiwitten tethers waarborgen. De overgebleven oplossing een lichtgele bovenstaande vloeistof en een roodgekleurde pellet met de geïsoleerde pigmentkorrels bevatten.

3. Pigment Extraction

1. Bereiding van Zure Methanol (HCl-MeOH)
   1. Voeg voorzichtig 25 pl geconcentreerde (36,5-38% (w / w)) zoutzuur (HCl) tot 5 ml methanol (MeOH). Bewaar de HCl-MeOH oplossing in een schroefdop glazen monsterflesje. Roer voorzichtig gelijkmatig de oplossing te mengen.
      OPMERKING: De zuurder de oplossing, hoe meer pigment in de fi extrahereneerste extractie.
2. Extractie van Pigment
   1. Centrifugeer het pigment korrel suspensie (vanaf 2.2.2) gedurende 5 min bij 14.000 xg Verwijder de bovenstaande vloeistof in een plastic afval emmer.
   2. Voeg 500 ul van het HCl-MeOH-oplossing en vortex elk monster gedurende ~ 3-4 min. Sonificeer de monsters gedurende 10 min (~ 40 kHz), centrifugeer 5 min bij 14.000 x g.
   3. Met behulp van een overdracht pipet, het verzamelen van de bovenstaande vloeistof in een 1 dram schroef-top glazen flacon. De supernatant dient donkerrood van kleur zijn.
   4. Herhaal de extractie stap 3.2.2 tot er geen kleur wordt onttrokken (~ 4-5 wasbeurten).
      OPMERKING: Elke extractie zal opleveren ~ 1,5 ml pigment. Het resterende kleurloze pellet is het pigment geëxtraheerde granules. OPMERKING: De kleurloze korrels en geëxtraheerd pigmenten kunnen worden bewaard in water bij 4 ° C tot verder gebruik.

4. Karakterisering hele Extraction Process

1. scanning Electron Microscopie
   1. Beeld de granules (ongereageerd uit stap 2.2.1 en pigment gewonnen uit stap 3.2.3) met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) om de zuiverheid van het extractieproces te controleren.
   2. Om korrel monsters voor te bereiden voor de beeldvorming, de eerste centrifuge zowel niet gereageerde korrels en pigment gewonnen granulaten voor 5 min bij 14.000 xg, en gooi de bovenstaande vloeistof in een plastic afval emmer. Resuspendeer deze in 1 ml ethanol en borg 2-3 druppels van de suspensie granule op aluminium SEM stubs met een transferpipet.
   3. Na drogen van de monsters overnacht sputter coater met goud-platina coating gedurende 3 minuten een 15 nm coating te bereiken.
   4. Afbeelding met behulp van een SEM met een Schottky emitter en een secundaire elektronen detector. Gebruik een 5-7 kV bundel spanning en een werkafstand tussen 8 en 9 mm op de foto om deze materialen.
2. Ultraviolet-zichtbare (UV-vis) Fotometrische metingen
   1. Bewaken van de absorptie probestanden voor alle 3 voorwaarden (niet-omgezette korrel van 2.2.2, gewonnen pigment uit 3.2.3 en pigment gewonnen granulaat uit 3.2.4) met een dual beam spectrofotometer 200-800 nm.
   2. Verzamel een blanco meting met gedeïoniseerd water in een 1 ml cuvette het ongereageerde granules en granules pigment geëxtraheerd. Verzamel UV-Vis absorptiespectra voor beide monsters.
   3. Verzamel een blanco meting met de zure methanoloplossing in een 1 ml cuvette de opgezogen pigment. Verzamel UV-Vis absorptie spectrum voor monster.
   4. Bepalen maximum golflengte van elk monster door het identificeren van de golflengte waarbij de absorptie piek van de maximale relatieve hoogte bereikt.

Resultaten

Chromatoforen worden ontleed uit de D. pealeii dorsale mantel (Figuur 1A, 1B). Zodra ze verwijderd worden chromatoforen gelyseerd en gezuiverd middels centrifugatie en wascycli te isoleren uit de gepigmenteerde granules (figuren 2A, 2B). Zure methanol oplossing (HCl-MeOH) worden gebruikt om het pigment van de korrels (figuur 2C) extract, waardoor een oplosbaar pigment extract en onoplosbare, kle...

Discussie

We hebben een methode om pigmenten pijlinktvis chromatophore granules extract aangetoond. Door specifiek te richten op de korrels, ons doel is om hun rol in het bemiddelen van adaptieve kleur te bepalen. Deze methode verschilt van eerdere rapporten ontworpen om cephalopod pigmenten te karakteriseren met behulp van bulk weefselmonsters ¹⁴ of gevriesdroogd huid ^15.

Hoewel dit protocol is effectief bij het extraheren chromatophore pigmenten wordt beperkt tot kleine reactie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	Geen gevaar
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritatie, acute toxiciteit
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Milde irritatie
Zoutzuur	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosie
k-Aspartaat	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reageert hevig met oxidanten
Magnesiumchloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Milde oogirritatie
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Zeer ontvlambaar
Mini tablet protease remmer	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosie voor metaal en huid
Papaïne	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritatie