Methodenartikel

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14 november 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foreward genetisch screening in modelorganismen is de werkpaard om functioneel belangrijke genen en routes in veel biologische processen te ontdekken. Bij de meeste mutagenese-gebaseerde screeningsmethoden hebben onderzoekers vertrouwd op het gebruik van giftige chemicaliën, carcinogenen of bestraling, wat gespecialiseerde apparatuur, veiligheidsopstelling en/of verwijdering van gevaarlijke materialen vereist. We hebben een eenvoudige aanpak ontwikkeld om erfelijke mutaties in C. elegans te induceren door gebruik te maken van in de kiemcellen tot expressie gebrachte histone-miniSOG, een licht-induceerbare krachtige generator van reactieve zuurstofsoorten. Deze mutagenesemethode is vrij van giftige chemicaliën en vereist minimale laboratoriumveiligheid en afvalbeheer. De geïnduceerde DNA-modificaties omvatten enkele nucleotidenveranderingen en kleine deleties, en vullen die aan die veroorzaakt door klassieke chemische mutagenese. Deze methodologie kan ook worden gebruikt om de integratie van extrachromosomale transgenen te induceren. Hier bieden we de details van de LED-opstelling en protocollen voor standaard mutagenese en transgenintegratie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetische screens zijn op grote schaal gebruikt om genetische mutanten verstoren diverse biologische processen in modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1 genereren. Analyses van dergelijke mutanten leiden tot de ontdekking van functioneel belangrijke genen en hun signaalwegen 1,2. Traditioneel mutagenese in C. elegans wordt bereikt met mutagene chemicaliën, straling of transposons 2. Chemicaliën zoals ethylmethaansulfonaat (EMS) en N-ethyl-N -nitrosourea (ENU) zijn giftig voor de mens; gammastraling of ultraviolet (UV) stralingsmutagenese vereist speciale apparatuur; en transpos....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. De bouw van de LED-verlichting

LET OP: De benodigde LED-apparatuur wordt samengevat in de lijst van materialen. De gehele LED setup is klein en kan overal in het laboratorium worden geplaatst, hoewel we aan in een donkere kamer aan licht blootgesteld worms 4 controle worden geplaatst.

  1. Sluit de LED aan een controller met kabels (Figuur 1A, D).
  2. Sluit de stuureenheid om een digitale functiegenerator / versterker met een BNC kabel (Figuur 1A, C, D).
  3. Bevestig het LED-lampje 10 cm boven het podium met een aangepaste houder (Figuur 1A).
    LET OP: We hebben de houder ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We voerden een voorwaartse genetische screen met CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) met behulp van 30 minuten blootstelling aan licht na het standaardprotocol in de afdelingen 2 en 3 beschreven onder 60 F 1-platen die overeenkomt met 120 gemutageniseerde haploïde genomen, vonden we 8 F 1 platen met F 2 wormen weergave zichtbaar fenotypes zoals lichaamsgrootte defect (Figuur 3B), ongecoördineerde beweging (figuur 3C),<.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een gedetailleerde procedure van optogenetic mutagenese met behulp van His-MSOG tot uitdrukking in de kiembaan en geven een voorbeeld van een kleinschalige forward genetische screen. Vergeleken met standaard chemische mutagenese, deze optogenetic mutagenese werkwijze heeft verschillende voordelen. Ten eerste is het niet-toxisch, daarmee had het laboratoriumpersoneel verwijderd van toxische chemische mutagenen zoals EMS, ENU en trimethylpsoraleen met ultraviolet licht (TMP / UV). Ten tweede kan de exp.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk wordt ondersteund door HHMI. We danken onze labledenden voor hun hulp bij het testen van het protocol en het herzien van het manuscript.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ultra High Power LED-lichtbronPrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± 5 nm
LED-controllerPrizmatixUHPLCC-01
Digitaal functiegenerator/versterkerPASCOPI-9587CPI-9587C is niet langer verkrijgbaar. Het vervangende product is PI-8127.
BNC-kabel mannelijk/mannelijkTHORLABSCA3136
USB-TTL-interfacePrizmatixOptioneel
FotometerTHORLABSPM50 en Model D10MM
FilterpapierWhatman1001-110
StereomicroscoopLeicaMZ95
NGM-plaatLos 5 g NaCl, 2,5 g Pepton, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol op in 1 L H2O. Voeg na het autoclaveren 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6,0) toe. 
Lyse-oplossing10 mM Tris (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetische mutageneseLED opstellingforward genetische screeningROS generatiekoperchloridekiembaanexpressietransgeen integratielichtbehandeling

Gerelateerde artikelen