Methodenartikel

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14 november 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foreward genetisch screening in modelorganismen is de werkpaard om functioneel belangrijke genen en routes in veel biologische processen te ontdekken. Bij de meeste mutagenese-gebaseerde screeningsmethoden hebben onderzoekers vertrouwd op het gebruik van giftige chemicaliën, carcinogenen of bestraling, wat gespecialiseerde apparatuur, veiligheidsopstelling en/of verwijdering van gevaarlijke materialen vereist. We hebben een eenvoudige aanpak ontwikkeld om erfelijke mutaties in C. elegans te induceren door gebruik te maken van in de kiemcellen tot expressie gebrachte histone-miniSOG, een licht-induceerbare krachtige generator van reactieve zuurstofsoorten. Deze mutagenesemethode is vrij van giftige chemicaliën en vereist minimale laboratoriumveiligheid en afvalbeheer. De geïnduceerde DNA-modificaties omvatten enkele nucleotidenveranderingen en kleine deleties, en vullen die aan die veroorzaakt door klassieke chemische mutagenese. Deze methodologie kan ook worden gebruikt om de integratie van extrachromosomale transgenen te induceren. Hier bieden we de details van de LED-opstelling en protocollen voor standaard mutagenese en transgenintegratie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetische screens zijn op grote schaal gebruikt om genetische mutanten verstoren diverse biologische processen in modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1 genereren. Analyses van dergelijke mutanten leiden tot de ontdekking van functioneel belangrijke genen en hun signaalwegen 1,2. Traditioneel mutagenese in C. elegans wordt bereikt met mutagene chemicaliën, straling of transposons 2. Chemicaliën zoals ethylmethaansulfonaat (EMS) en N-ethyl-N -nitrosourea (ENU) zijn giftig voor de mens; gammastraling of ultraviolet (UV) stralingsmutagenese vereist speciale apparatuur; en transposon-actieve stammen, zoals mutator stammen 3, kan onnodige mutaties veroorzaken tijdens onderhoud. We hebben een eenvoudige benadering van erfelijke mutaties met behulp van een genetisch-gecodeerde fotosensibilisator 4 induceren ontwikkeld.

Reactive oxygen species (ROS) kan DNA 5 beschadigen.De mini-singlet zuurstof Generator (miniSOG) is een groen fluorescerend eiwit van 106 aminozuren dat werd ontworpen door de LOV (licht, zuurstof, en Voltage) domein van Arabidopsis phototropin 2 6. Bij blootstelling aan blauw licht (~ 450 nm), miniSOG genereert ROS zoals singlet zuurstof met fl avin mononucleotide als cofactor 6-8, die in alle cellen. Construeerden wij een His-fusie-eiwit door MSOG tagging miniSOG aan de C-terminus van histon-72, een C. elegans variant van Histon 3. We genereerden een losse transgene 9 tot en met His-MSOG drukken in de kiemlijn van C. elegans. Onder normale kweekomstandigheden in het donker, het His-MSOG transgene wormen normale broedsel grootte en levensduur 4. Bij blootstelling aan blauw LED-licht, het His-MSOG wormen produceren erfelijke mutaties onder hun nageslacht 4. Het spectrum van geïnduceerde mutaties omvat nucleotide veranderingen, zoals G: C tot T: A en G: C C: G, en kleine chromosome deleties 4. Dit mutagenese procedure is eenvoudig uit te voeren, en vereist een minimale veiligheid lab setup. We beschrijven hier de LED verlichting setup en procedures voor optogenetic mutagenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. De bouw van de LED-verlichting

LET OP: De benodigde LED-apparatuur wordt samengevat in de lijst van materialen. De gehele LED setup is klein en kan overal in het laboratorium worden geplaatst, hoewel we aan in een donkere kamer aan licht blootgesteld worms 4 controle worden geplaatst.

  1. Sluit de LED aan een controller met kabels (Figuur 1A, D).
  2. Sluit de stuureenheid om een digitale functiegenerator / versterker met een BNC kabel (Figuur 1A, C, D).
  3. Bevestig het LED-lampje 10 cm boven het podium met een aangepaste houder (Figuur 1A).
    LET OP: We hebben de houder met metalen onderdelen.
  4. Bedek de LED-verlichting setup gedeeltelijk, maar vermijd warmteaccumulatie (Figuur 1B), die wormen ziek maakt.
    LET OP: We maken gebruik van een op maat gemaakte hard plastic hoes met open boven- en onderkant (Figuur 1A). Het deksel is niet vereist voor de mutagenese zelf, maar wordt gebruikt to beperken onnodige blootstelling van het blauwe licht naar de omgeving. Wij adviseren om de LED-setup geheel (Figuur 1B) om te voorkomen dat oververhitting van de wormen niet dekken.
  5. Draag laser-beschermende bril.
    LET OP: Wij dragen laser-beschermende bril, omdat het licht is heel helder. Zonnebril kan net zo goed werken.
  6. Zet de hendel van de LED-controller 'Int.' voor continue belichting (figuur 1D) en instellen op 65% van het maximale vermogen (figuur 1C).
  7. Gebruik een fotometer om de blauwe lichtintensiteit te meten op het podium waar de wormen worden geplaatst met behulp van het protocol van de fabrikant. De setup geeft 2,0 mW / mm 2 onder continue belichting.

2. Blue Light Treatment

OPMERKING: Gebruik de stam CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III 4 De stam is beschikbaar. bij de Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Handhaving van de His-MSOG stam in het donker op standaard nematode groeimedium (NGM) platen met E. coli OP50 na een standaardprotocol 10,11.
    LET OP: Onder omgevingslicht, hoeft juSi164 bevattende stammen geen mutatie snelheid boven een spontane tarief 4 weer te geven. Routine stam passage met een dissectie scope met een halogeenlamp algemeen geen mutaties eveneens veroorzaken. Toch moet ervoor worden gezorgd dat onnodige blootstelling aan licht, bijv vermijden, het bijhouden van de stammen in een standaard donker binnen incubator, of met betrekking tot de stammen met folie. Het is aangeraden om hoeveelheden van de stam te bevriezen na ontvangst in het geval van onnodige mutaties zich ophopen in de tijd.
  2. Pick gravid jonge volwassene (ongeveer 12 uur na L4) dieren met een worm te halen 11.
    OPMERKING: Jongere dieren vertonen minder mutageen effect 4, terwijl de oudere dieren lagere broed omvang kunnen hebben.
  3. Snijd een filter paper te passen een 60 mm plaat met een 25 mm x 25 mm vierkante gat en leg op een ongeplaatste plaat (figuur 1E).
    OPMERKING: Een vierkant stempel kan worden gebruikt, maar de grootte van de stempel hoeft niet precies te zijn.
  4. Drop 100 pi van 100 mM CuCl 2 op het filter papier gelijkmatig wormen binnen het vierkant gat op de plaat te beperken.
  5. Pick gewenste aantal zwangere jonge volwassen hermafrodieten (zie stap 3 voor een voorbeeld) en over te brengen naar het centrum van het CuCl 2 plaat.
  6. Draag laser beschermende bril.
  7. Schakelaar op de LED en de functie generator.
  8. Zet de hendel van de LED-controller 'Ext.' om het te controleren door de functie generator (figuur 1D).
  9. Stel de vluchtleider van 65% van het maximale vermogen en de functie generator sinusgolf, 4 Hz (figuur 1C).
  10. Plaats de CuCl 2 plaat uit stap 2,5 zonder deksel op het podium onder LED (Figuur 1A </ Strong>).
  11. Verlichten de dieren met blauw licht gedurende 30 minuten.
  12. Transfer gezond uitziende wormen naar een zaadjes plaat als P 0.
    Opmerking: Het gewenste aantal P 0 is afhankelijk van het soort scherm. Zie stap 3 voor een voorbeeld. De P 0 wormen kunnen verschijnen ongecoördineerd onmiddellijk na de lichtbehandeling te zijn en zal herstellen in de tijd.
  13. Houd wormen bedekt met behulp van folie in een couveuse of in het donker; en volg de standaard procedure om te beginnen met het screenen van de gewenste fenotypes onder hun nageslacht 2,10.

3. Voorbeeld van een Forward Genetic Screen

Opmerking. Dit is een voorbeeld van het scherm met klonale 120 haploïde genoom te controleren of de LED en druk werken Figuur 2 toont een schema van de procedure.

  1. [Day1] Na blauw licht behandeling, pick vijf gezond uitziende wormen op een NGM plaat met OP50 als P 0, bewaar ze in een 20 ° C incubator, en laat ze eieren leggen voor 1d ( 'Dag 1' plaat).
  2. [Day2] Transfer P 0 op een nieuwe zaadjes plaat ( 'Day2' plaat).
  3. [Day3] Pick en dood P 0 op de 'Dag 2' plaat door ze te verbranden.
  4. [Day4] Oogst 30 zwangere jonge volwassen F 1 van de 'Dag 1' bord en zet ze op afzonderlijke platen (30 F 1 platen voor 'Dag 1').
  5. [Day5] Herhaal stap 3.4 voor de 'Dag 2' plaat (30 F 1 platen voor 'Dag 2').
  6. [Day7-9] Bekijk de abnormale morfologie en / of het gedrag van F 2 wormen in vergelijking met de WT stam (figuur 3A) in het kader van een standaard stereomicroscoop wanneer ze volwassen zijn.
    OPMERKING: een erfelijke mutatie geeft ongeveer een kwart van wormen met hetzelfde fenotype onder F2 wanneer het recessieve hoge penetrantie. Echter, sommige mutanten langzaam groeien en / of tonen gedeeltelijke penetrantie. Daarom is het mogelijk dat minder dan een kwart van de mutanten kan worden gevonden op eenbord.
  7. Pick wormen met zichtbare fenotypes individueel en controleer de erfelijkheid van het fenotype in de volgende generatie.

4. Voorbeeld van een extrachromosomaal transgenintegratie

  1. Injecteer het DNA van belang in CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) uiteenzetten en transgene wormen met een lage overdrachtssnelheid (10-30%) na een standaard injectie protocol 12,13.
    LET OP: U kunt gevestigde extrachromosomaal arrays worden gekruist in de juSi164 stammen. Om genotypering voor juSi164 voorkomen, kan juSi164 heterozygoten worden gebruikt als P 0 hoewel efficiëntie kan worden verminderd. De genotyperingsmethode voor juSi164 wordt beschreven in hoofdstuk 5.
  2. [Day1] Behandel ~ 20 transgene dieren als P 0 met blauw licht, zoals beschreven in stap 2.
    OPMERKING: Meer P 0 wormen zijn naar gelang van de tr ansmission tarief. Transgenen kunnen worden geïdentificeerd door fenotypes of co-injectie marker 12,13.
  3. Pick 10 gezond uitziende P 0 op afzonderlijke platen, bewaar ze in een 20 ° C incubator, en laat ze eieren leggen voor een paar dagen (P 0 platen)
  4. [Day4] Single uit 20 transgene F 1 wormen uit elk P 0 plaat op afzonderlijke platen en laat ze eieren leggen. (20 F 1 x 10 P 0 platen = 200 F 1 platen in totaal.)
  5. [Day7] Zoek F 1 platen met> 75% F 2 met transgenen.
  6. Pick vijf transgene dieren uit de> 75% overdrachtssnelheid F 1-platen (F 2 platen).
  7. [Dag 10] Houd F 2 platen met 100% overdrachtssnelheid als potentiële geïntegreerde lijnen.
  8. Outcross het potentieel geïntegreerd lijnen met behulp van een standaard procedure 10 om de Mendeliaanse segregatie te controleren en om potentiële achtergrond mutaties te verwijderen.
le "> 5. Genotypering

  1. Lyse 20 outcrossed F 2 wormen in lysisbuffer behulp van een standaard protocol 14.
  2. Voer PCR met de primers voor het inbrengen MosSCI 9, juSi164, (tabel 1) met een hybridisatietemperatuur van 58 ° C volgens een standaard protocol 14.
    LET OP: Het is onnodig om unc-119 (ED3) genotype omdat unc-119 (ED3) door ongecoördineerde gedrag na het verwijderen van het redden van transgene (juSi164) in de volgende stappen 5.4 en 5.5 kan worden gedetecteerd.
  3. Run agarosegelelektroforese 15 en onderzoekt de bandgroottes (tabel 1) bij de WT juSi164 vinden.
  4. Onderzoeken of de F2 nakomelingen wormen verlamd door de aanwezigheid van unc-119 (ED3).
  5. Als ongecoördineerde wormen gevonden in stap 5,4, één enkele nonuncoordinated wormen nonuncoordinated alle wormen in de volgende generatie te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We voerden een voorwaartse genetische screen met CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) met behulp van 30 minuten blootstelling aan licht na het standaardprotocol in de afdelingen 2 en 3 beschreven onder 60 F 1-platen die overeenkomt met 120 gemutageniseerde haploïde genomen, vonden we 8 F 1 platen met F 2 wormen weergave zichtbaar fenotypes zoals lichaamsgrootte defect (Figuur 3B), ongecoördineerde beweging (figuur 3C),<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een gedetailleerde procedure van optogenetic mutagenese met behulp van His-MSOG tot uitdrukking in de kiembaan en geven een voorbeeld van een kleinschalige forward genetische screen. Vergeleken met standaard chemische mutagenese, deze optogenetic mutagenese werkwijze heeft verschillende voordelen. Ten eerste is het niet-toxisch, daarmee had het laboratoriumpersoneel verwijderd van toxische chemische mutagenen zoals EMS, ENU en trimethylpsoraleen met ultraviolet licht (TMP / UV). Ten tweede kan de exp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk wordt ondersteund door HHMI. We danken onze labledenden voor hun hulp bij het testen van het protocol en het herzien van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ultra High Power LED-lichtbronPrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± 5 nm
LED-controllerPrizmatixUHPLCC-01
Digitaal functiegenerator/versterkerPASCOPI-9587CPI-9587C is niet langer verkrijgbaar. Het vervangende product is PI-8127.
BNC-kabel mannelijk/mannelijkTHORLABSCA3136
USB-TTL-interfacePrizmatixOptioneel
FotometerTHORLABSPM50 en Model D10MM
FilterpapierWhatman1001-110
StereomicroscoopLeicaMZ95
NGM-plaatLos 5 g NaCl, 2,5 g Pepton, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol op in 1 L H2O. Voeg na het autoclaveren 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6,0) toe. 
Lyse-oplossing10 mM Tris (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868(2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041(2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271(2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316(2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetische mutageneseLED opstellingforward genetische screeningROS generatiekoperchloridekiembaanexpressietransgeen integratielichtbehandeling

Gerelateerde artikelen