Biofilms op oppervlakken kunnen effectief en snel worden verwijderd door gebruik te maken van een periodieke straal van kooldioxide-aerosols zonder stikstofzuivering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Biofilm verwijderen Met behulp van Carbon Dioxide aerosols zonder stikstofspoeling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Biofilms kunnen ernstige problemen veroorzaken in veel toepassingen. Ze kunnen niet alleen economische verliezen veroorzaken, maar ook een gevaar vormen voor de volksgezondheid. Daarom is het zeer wenselijk om biofilms van oppervlakken te verwijderen. Veel studies over CO2 aerosol reiniging hebben stikstof purges gebruikt om de efficiëntie van biofilm verwijdering te verhogen door de voch Condensatie die tijdens het reinigen wordt gegenereerd te verminderen. Echter, in deze studie werden periodieke jets van CO2 aerosolen zonder stikstof purges gebruikt om Pseudomonas putida biofilms van gepolijste roestvrijstalen oppervlakken te verwijderen. CO2 aerosolen zijn mengsels van vaste en gasvormige CO2 en worden gegenereerd wanneer hoogdruk CO2 gas adiabatisch wordt uitgebreid door een spuitmond. Deze hogesnelheid aerosolen werden aangebracht op een biofilm die 24 uur was gekweekt. De verwijderingsefficiëntie varieerde van 90,36% tot 98,29% en werd geëvalueerd door de fluorescentie-intensiteit van de biofilm te meten terwijl de behandelingstijd varieerde van 16 seconden tot 88 seconden. We hebben ook experimenten uitgevoerd om de verwijderingsefficiënties met en zonder stikstof purges te vergelijken; de gemeten biofilm verwijderingsefficiënties waren niet significant verschillend van elkaar (t-test, p > 0,55). Daarom kan deze techniek worden gebruikt om verschillende biologisch vervuilde oppervlakken binnen een minuut te reinigen.
Inleiding
Biofilms zijn complexe bacteriële gemeenschapsstructuren waarin bacteriële cellen zijn ingebed in zelfgeproduceerde matrices van extracellulaire polymere stoffen, bijeen gehouden en beschermd tegen de externe omgeving. Biofilms kunnen een risico voor de volksgezondheid vormen en economische verliezen veroorzaken omdat ze zich op verschillende oppervlakken kunnen vormen, inclusief medische implantaatmaterialen en apparaten, voedselverwerkende apparatuur en warmtewisselaars. In feite is gebleken dat biofilms geassocieerd zijn met 65% van alle bacteriële infectieziekten bij mensen, volgens de Centers for Disease Control and Prevention1.
Autoclaven en desinfectiemiddelen zoals chloor zijn algemeen gebruikt voor de inactivering van biofilms. Echter, het gebruik van een autoclaaf is beperkt voor oppervlakken die noch hoge temperatuur stoom kunnen weerstaan, noch in de autoclaaf kunnen worden geplaatst. Desinfectiemiddelen zijn niet geschikt voor oppervlakken die gevoelig zijn voor chemische behandeling of geneigd zijn om giftige oxidatieproducten te verzamelen2. Bovendien moet de biofilm niet alleen worden ingeactiveerd, maar ook worden verwijderd om te voorkomen dat nieuwe cellen zich aan het oppervlak hechten en zo een nieuwe biofilm vormen3. Het is echter moeilijk om biofilms te verwijderen met methoden die gebaseerd zijn op viskeuze vloeistofschuifspanning omdat de stroomsnelheid nabij het oppervlak bijna nul is en de schuifkracht meestal niet de hechtingskrachten van micro- en submicrometergrootte kan overwinnen. Bovendien is bekend dat de biofilmmatrix fungeert als een fysische en chemische barrière1.
Er zijn veel fysische en mechanische technieken ontwikkeld om biofilms van oppervlakken te verwijderen, inclusief ultrasone vibratie1, elektrische stromen4, laserbestraling5 en hogedruk waterstralen6. Elke techniek heeft zijn eigen voor- en nadelen. Ultrasone vibratie en elektrische stroom kunnen worden gebruikt om biofilmvorming te controleren; echter, ze vereisen een specifieke configuratie en geleidende oppervlakken, respectievelijk, waardoor aanvullende schuifbevochtiging vereist is1, 4. Laserbestraling kan worden toegepast op een beperkt gebied en op harde oppervlakken; echter, er blijven enkele levende en dode cellen op het oppervlak achter5. Hogedruk waterstralen verwijderen biofilms effectief; echter, hun hoge momentum kan schade aan zachte substraten veroorzaken6.
Biofilmverwijdering met behulp van CO2 aerosolen is eerder voorgesteld. Het heeft veelbelovende resultaten getoond, met hoge verwijderingsefficiënties binnen een korte tijd7-11. CO2 aerosolen worden gegenereerd door adiabatische expansie van een hoogdruk CO2 gas door een mondstuk, en ze worden toegepast op de oppervlakken die besmet zijn met een biofilm. Deze reinigingstechniek maakt gebruik van de momentumoverdracht van vaste CO2 deeltjes en de oploswerking van de gesmolten CO2 vloeistoffen, gevolgd door de aerodynamische schuifbevochtiging van het CO2 gas12. In vergelijking met hogedruk N2 gasstralen, zijn CO2 aerosolstralen bij dezelfde stagnatiedruk veel effectiever in het verwijderen van E. coli biofilms7. Bovendien, hoewel het momentum van het vaste CO2 dat aan de bacteriën wordt afgegeven aanzienlijk hoog is, is het momentum van de totale aerosolstraal toegepast op het vaste oppervlak aanzienlijk lager dan dat van waterstralen. Daarom is schadevrije reiniging mogelijk met behulp van deze CO2 aerosoltechniek.
In dit protocol werden periodieke CO2 aerosolstralen zonder stikstof purges gebruikt om Pseudomonas putida biofilms van een gepolijst roestvrij staal oppervlak te verwijderen. In feite zijn stikstof purges in veel CO2 aerosolstudies gebruikt om de verwijderingsefficiëntie te verhogen door de vochtcondensatie die tijdens het reinigen wordt gegenereerd te verminderen, ook al zijn verwarming met een heet plaatje of infraroodlampen en het gebruik van droge dozen ook toegepast12. De biofilmvorming op het oppervlak en de geoptimaliseerde reinigingsprocedures worden hieronder beschreven. De verwijderingsefficiëntie werd beoordeeld door de fluorescentie-intensiteit van de biofilm op het oppervlak te meten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de Surface voor Biofilm Formation
- Gesneden 1 mm dikke 304 roestvrij stalen platen tot chips (10 x 10 mm2) met een mechanische cutter.
- Voer ultrasone reiniging van de chips in aceton, methanol, en gedeïoniseerd (DI) water achtereenvolgens gedurende 10 minuten elk. Gebruik een oplosmiddelbestendige bak van stoffen zoals glas, organische verontreiniging te verwijderen.
- Spoel de chips met stromend DI water gedurende 3-5 sec.
- Droog de chips met behulp van N2 gasstroom 3-5 sec.
2. Bereiding bacteriekweek
- Neem een P. putida KT2440 (ter beschikking gesteld door Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Zuid-Korea) voorraad opgeslagen in een -80 ° C diepvriezer.
- Ontdooien bij kamertemperatuur na 1 min, en de bovenste laag van de bevroren voorraad oplossing wendt zich tot slush. Dompel een lus in de gesmolten laag van de voorraadoplossing.
- Gebruik deze lus om streak de bacteriën op een Luria-Bertani (LB) platen die 1,5% agar.
- Incubeer de plaat overnacht bij 30 ° C om de bacteriële kolonies groeien.
- Kies een enkele kolonie van de plaat met behulp van een nieuwe lus.
- Inoculeer 10 ml LB-bouillon in een 50 ml conische buis met de lus met de enkele bacteriële kolonie.
- Incubeer de bouillon in een schudincubator gedurende 16 uur bij 30 ° C en 160 rpm.
3. Biofilm Formation op de Surface
- Pak elk van de bereide chips met een pincet en zal die in 70% ethanol 5 maal gedurende 1-2 seconden elk, om het oppervlak van elke chip steriliseren. Zorg ervoor dat de chips worden gehouden met een pincet tijdens het dompelen.
- Dip elke chip in geautoclaveerd DI-water en in LB bouillon sequentieel, 5 keer voor 1-2 seconden per stuk, om de resterende ethanol te verwijderen.
- Plaats deze chips in 6-well kweekplaten met 2 chips en 5 ml LB-bouillon per putje.
- Verdun de bacteriekweek tot de concentratie in LB bouillon bereikt8 x 10 8 cellen / ml (optische dichtheid bij 600 nm golflengte: ~ 0,8).
- Wordt geënt in elk putje met 50 ul van de verdunde bacteriecultuur.
- Incubeer de platen bij 30 ° C zonder schudden gedurende 24 uur voor de vorming van biofilms.
4. CO 2 Aerosol Cleaning
- Dompel de biofilm gevormd chips in 10 mM ammoniumacetaat buffer (volatiele) 5 tijden te verwijderen losjes verbonden en planktonische bacteriën.
- Droog deze chips in een bioveiligheid kast, waar de lucht stroomt mild.
- Meteen na het drogen plaats een chip op de laadplaats, die 20 mm van de CO 2 mondstuk langs de as van de straal. Kantel de jet-as een hoek van 40 °.
- Stel de stagnatie druk van CO 2 en N 2 gas aan 5,3 MPa en 0,7 MPa, respectievelijk, met behulp van gas-drukregelaars.
- Breng de aërosolstraal op het midden van de chip. Witte aerosolen met inbegrip van de vaste CO 2 moetzichtbaar. "Aan" de magneetklep voor de CO 2 gedurende 5 seconden, en zet hem dan "off" voor 3 seconden (cyclus: 8 sec) regelmatig met een handbediende schakelaar. Als een stikstofspoeling gebruikt moet worden, zet de elektromagnetische klep voor een continue aanvoer van N 2.
- Behandel de chips met CO 2 spuitbussen voor 16, 40 en 88 seconden met en zonder stikstofspoelingen. Behoud chips zonder behandeling als negatieve controles.
5. Analyse voor Removal Efficiency
- Bereid 1 uM groene fluorescentie nucleïnezuur vlek (golflengte excitatie / emissie: 480/500 nm) in DI water om bacteriële cellen op de controle en-aerosol behandelde chips vlekken.
- Plaats de chips in de kleuroplossing.
- Incubeer de chips in een incubator zonder licht bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Na de incubatie, voorzichtig spoel de chips met stromend DI water aan overmatige fluorescerende kleurstof te verwijderen.
- Droog de chips with N 2 gas flow.
- Neem Fluorescentiemicroscopische beelden van 5 willekeurige gezichtsveld (321 × 240 micrometer 2) voor elke chip met behulp van een epifluorescentiemicroscoop, een 40X objectief, en een CCD-camera.
- Het verkrijgen van de fluorescentie-intensiteit voor elk beeld met behulp van een beeld processing software zoals ImageJ. In ImageJ, gebruik dan de "Aftrekken Background" functie in het menu "Actie", en selecteer "Integrated density" in het venster "Set Metingen" in de "Analyze" menu. Doe de "Meting" in de "Analyze" menu om de fluorescentie-intensiteit te verkrijgen.
- Bereken de biofilm verwijderingsefficiëntie volgens de volgende formule: 100% x (I stuurchips - I behandelde chips) / (I stuurchips), waarin I de berekende fluorescentie-intensiteit.
- Het verkrijgen van de gemiddelde verwijdering efficiëntie en standaarddeviaties. gebruik opminstens 4 chips voor elke zaak.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
CO 2 spuitbussen werden gebruikt om de P verwijderen putida biofilms uit SUS304 oppervlakken (figuur 1). De meeste oppervlakken zijn bedekt met de biofilm na 24 uur groei. De meeste van de biofilm werd verwijderd gebruikend CO 2 aerosolen (figuur 2). Zoals verwacht, Figuur 3 toont een verhoging van biofilms efficiëntie CO 2 aerosol behandelingstijd verhoogd. Voor de behandelingstijd van 88 seconden werd de verwijderings...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerder voerden we optimalisatiestudies uit op CO2 gasdruk, straalhoek en afstand tot het vaste oppervlak bij CO2 aerosol reiniging7. In tegenstelling tot onze eerdere studies, werd in de huidige studie geen stikstof purge opgenomen in de aerosol (Figuur 1). Bovendien werd 304 roestvrij staal gebruikt in dit protocol, omdat dit een van de meest voorkomende roestvrij staalsoorten is en veel wordt gebruikt in de voedingsindustrie. Het gepolijste oppervlak is gunstig voor flu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het programma voor fundamenteel wetenschappelijk onderzoek via de Nationale Onderzoeksstichting van Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (# 2015R1A2A2A01006446).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 304 roestvrij staal | Stalen (Zuid-Korea) | Gepolijste en gesneden exemplaren | |
| Ultrasoon reinigingsapparaat | Branson (VS) | 5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (VS) | 244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (VS) | 214010 | 500 g |
| 6-well kweekplaat | SPL Life Sciences (Zuid-Korea) | 32006 | |
| Ammoniumacetaatbuffer | Sigma-Aldrich (VS) | 667404 | 10 mM |
| Dubbele gaseenheid | Applied Surface Technologies (VS) | K6-10DG | Een mondstuk voor CO2 gas & 8 mondstukken voor N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (VS) | Invitrogen | Excitatie: 480 nm Emissi: 500 nm |
| Epifluorescentiemicroscoop | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objectieflens | Nikon (Japan) | Plan Fluor | NA: 0,75 |
| CCD-camera | Photometrics (VS) | Cool SNAP HQ2 | Monochroom |
Referenties
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
