Methodenartikel

Transient midden cerebrale slagader occlusie Model van Neonatale Stroke in P10 Rats

10.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54830

⸱

21 april 2017

 , 
1Department of Pediatrics, University of California, San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

Neonatale beroerte is een belangrijke oorzaak van vroege hersenbeschadiging die een translationeel model vereist met consistente focale letselpatronen en hoge reproduceerbaarheid om onderzoek mogelijk te maken. Dit onderzoek beschrijft de gedetailleerde chirurgische procedure voor het creëren van een niet-hemorragische, unilaterale focale ischemie-reperfusieletsel bij full-term-equivalente knaagdieren.

Samenvatting

Er zijn een aantal diermodellen gebruikt om hypoxisch-ischemische schade, traumatische schade, globale hypoxie of permanente ischemie te bestuderen in zowel de onvolwassen als volwassen hersenen. Beroertes komen vaak voor in de perinatale periode bij mensen, en transiente ischemie-reperfusie is de meest voorkomende vorm van beroerte bij pasgeborenen. De reperfusiefase is een kritische component van de progressie van de schade, die zich over een periode van dagen tot weken voordoet, en van het endogeen respons op schade. Dit rattenmodel op postnatale dag 10 (p10) van transiente middelste cerebrale arteriële occlusie (tMCAO) creëert een unilateraal, niet-hemorragische focale ischemie-reperfusie-schade die kan worden gebruikt om de mechanismen van focale schade en herstel in de voldragen equivalent-hersenen te bestuderen. Het schadepatroon dat wordt geproduceerd door tMCAO is consistent en zeer reproduceerbaar en kan worden bevestigd met MRI of histologische analyses. De ernst van de schade kan worden gemanipuleerd door veranderingen in de occlusietijd en andere methoden die zullen worden besproken.

Inleiding

Beroerte tijdens de neonatale periode is een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit, die zich in maar liefst 1 op de 2300 levendgeborenen 1. Dit leidt tot een veranderde centrale ontwikkeling van het zenuwstelsel en verhoogde morbiditeit op lange termijn, met inbegrip van verhoogde incidentie van epilepsie, hersenverlamming, mentale retardatie, en andere vormen van motorische of cognitieve stoornissen. De levenslange gevolgen van de vroege slag maken translationele diermodellen van essentieel belang voor de behandeling van de mechanismen van de schade en reparatie in deze populatie, met inbegrip van strategieën om de gewonde hersenen te beschermen of om de reparatie te verbeteren.

Verschillende ischemie modellen zijn gebruikt om hersenletsel bij volwassen dieren bestuderen, en terwijl de rijst-Vannucci (Modified Levine) procedure 2 wordt gewoonlijk gebruikt hypoxisch-ischemisch letsel in de zich ontwikkelende hersenen bestuderen focale ischemie-reperfusie een goede letselmechanisme waardoor focale verwonding, een gewonde kern en penuMBRA en uninjured remote weefsel. De Koizumi 3 en 4 Longa zijn uitgewerkt bij volwassen ratten tijdelijke midden-cerebrale slagaderocclusie bereiken via de carotis communis (CCA) en uitwendige halsslagader (ECA), respectievelijk. In beide modellen, permanente ligatie en cauterisatie van slagader takken zijn belangrijk om het bloeden te minimaliseren en om de chirurgische procedure, die ook schadelijke effecten heeft op het vermogen van het dier te voeden en om gewicht na letsel krijgen stroomlijnen. Verder zijn er verschillende mechanismen schade in de onrijpe hersenen en specifieke patronen schade gezien als resultaat.

Meer recent zijn fototrombotisch beroerte (Rose-Bengal methode) 5 en permanente MCA ligatie 6 is gebruikt om te studeren neonatale en volwassen beroerte. Zowel fototrombotisch beroerte en MCA ligatie creëren permanente veranderingen in cerebrale bloeddoorstroming die resulteren in een gebrek aan reperfusion. Reperfusie is een essentieel onderdeel van de ontwikkeling en progressie van focale verwonding, met verhoogde excitotoxiciteit, vorming van vrije radicalen en stikstofoxide leidt tot vertraagde celdood die inhoudt signalerende cascades die verschilt van de ischemische fase 7 zijn. Hypoxie-ischemie behelst permanent eenzijdige carotis ligatie gevolgd door globale hypoxie, die ook verschilt van de oorzaak van hypoxisch-ischemisch letsel bij mensen en niet consistent focale patroon van verwondingen veroorzaken, waardoor studie van de verwonde kern en penumbra moeilijker.

We hebben eerder beschreven niet-hemorragische ischemie-reperfusie beroertemodel in de onrijpe ratten middels tijdelijke midden-cerebrale slagaderocclusie (MCAO) 8, 9, 10. Dit is een minder invasieve methode die toegang afsluit en de MCA via de carotis interna zonder blijvende ligatiof cauterisatie. Dit verschaft een model van verwonding vergelijkbaar met de meest voorkomende oorzaak van een beroerte in de perinatale periode 11, 12. Deze ischemie-reperfusie model van het letsel leidt tot schade aan de ipsilaterale striatum en parieto-temporale cortex. Dit model maakt het ook tMCAO controle over de ernst van de schade die variëren van de duur van de occlusie. Onderzoek van signaalroutes en histologische veranderingen in de verwonde kern en penumbra en in de niet-beschadigde ipsilaterale en contralaterale weefsel kan het mechanisme van verwonding en herstel verder te ontrafelen in de onrijpe hersenen. Deze studie zal dit belangrijke letsel model voor de ontwikkeling van de hersenen aan te tonen.

Protocol

Alle dierlijke onderzoek werd goedgekeurd door de Universiteit van Californië, San Francisco Comité voor de onderzoek en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (US Department of Health and Human Services, publicatie nr 85-23, 1985 ). De dieren werden op de voet gevolgd door dierenartsen van de UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), geaccrediteerd door AAALAC. Een vrouwelijke Sprague-Dawley ratten met een 8 dagen oude nest (10 jongen per nest) werd verkregen. De moeder en haar pups kregen voedsel en water ad libitum en is gehuisvest in een temperatuur- en licht-gecontroleerde dier zorginstelling met dagelijkse verrijking, per IACUC protocol, totdat de pups 10 dagen oud. Alle chirurgische instrumenten die in deze procedure werden geautoclaveerd om de steriliteit te waarborgen. Steriliteit van instrument tips behouden over de operatie.

1. midden cerebrale slagader occlusie

  1. Weeg de pup en ensure dat het de juiste gewicht (19-21 g). Verdoven de pup in 3% isofluraan in 100% O2 en zorgen dat er geen reactie op een voet knijpen. Handhaaf het lichaamsoppervlak temperatuur tussen 35,5 ° C en 37 ° C met behulp van een verwarmingselement onder de chirurgische fase.
  2. Verzeker het dier in liggende positie met tape in de schoudergebieden. Met steriele wattenstaafjes wattenstaafje de voorste cervicale met povidon-joodoplossing, gevolgd door een uitstrijkje van 70% ethanol in dubbel gedestilleerd water, afwisselend elke oplossing vier swabs totaal.
  3. Lokaal infiltreren 0,25% bupivacaine in de geplande incisie. Met behulp van een stereoscoop, maak een middellijn 5-7 mm anterior cervicale incisie gemeenschappelijke halsslagader (CCA) bloot te leggen. Plaats 2-4 oprolmechanismen om de holte open en de slagader bloot te houden.
  4. Plaats de interne halsslagader (ICA), occipitale slagader (OA) en uitwendige halsslagader (ECA). Verzorg de slagaders om een ​​duidelijk beeld te krijgen. Be autoeful niet de nervus vagus verstoren.
    LET OP: Voor pseudo-geopereerde pups, de inicision wordt opengelaten en de slagaders zijn blootgesteld, waarna de incisie gesloten wordt gehecht. De totale narcose tijd is gelijk aan die van de occlusie operatie.
  5. 1,5 cm gesneden van 6-0 zijde gevlochten hechtdraad. Unbraid de hechtdraad, trekken enkele strengen. Zorg ervoor dat de enkele strengen zijn netjes en niet gerafeld.
    OPMERKING: Indien nodig, gladstrijken de rafels door dompelen de enkele streng in steriel water en het verzorgen van de streng met pincet tips.
  6. Terwijl u de hechtdraad met 45 graden tang, bewegen de tang in een vegende boog beweging om te gaan onder het ICA, zodat de pincet tips ontstaan ​​tussen de ICA en OA.
    OPMERKING: Als de dissectie goed wordt gedaan, zal deze stap relatief eenvoudig zijn. Indien de ICA en OA elkaar raken, pas dan de slagaders scheuren bij gebruik van de forceps om de ICA isoleren. Als bloeden optreedt, druk uit op de slagader met de tang tothet bloeden stopt. Absorberen het bloed met een steriel wattenstaafje.
  7. Pak het einde van de hechtdraad die wordt vastgehouden door de tang en trek het zo dat het einde is gemakkelijk te bereiken. Laat de strengen van de tang en de tang en terug onder de ICA, de beweging in stap 1.5 (Figuur 1A) omkeren.
  8. Bind een tijdelijke ligatuur rond de ICA aan de basis, in de buurt waar het scheidt van de CCA.
    Opmerking: Het is van belang om de knoop zodat het uiteinde van de streng die wordt getrokken om de knoop te verwijderen lang genoeg is (groter dan 1 mm, minder dan 3 mm) gemakkelijk grijpen met een tang, met dien verstande dat er een geschikte hoeveelheid hechtdraad aan de andere zijde van de knoop terugtrekken.
  9. trekken voorzichtig ICA zijdelings en gebruik een clip om de streng overtollige huid beveiligen nabij de oksel gebied aan de zijde tegenover de incisie. Zorg ervoor dat deze terugtrekkende streng strak genoeg is om de bloedstroom te stoppen alvorens de volgende stap,minimaliseren van het risico van ongecontroleerde bloeden. Zien dat de slagader vlak en bleek.
    LET OP: Niet te schuiven, want het kan een gedeeltelijke of volledige scheur van de ICA veroorzaken. Het terugtrekken kan worden ingesteld net voordat de arteriotomie door aan de draad aan de zijde tegenover de clip.
  10. Met 45 ° tang om een ​​gevlochten hechtdraad en loop onder en rond de ICA grijpen, zoals in stap 1.5. Position dit onderdeel lateraal aan de terugtrekking streng (Figuur 1B).
    LET OP: Deze stap kan ook voorafgaand aan het terugtrekken worden gedaan. Bij twijfel over de kwaliteit van het terugtrekken, kan deze knoop zeer losjes worden vastgebonden voordat de volgende stap.
  11. Snijd een 0,2 mm arteriotomie halverwege tussen de gebonden en ongebonden ligaturen, dwalende dichter bij het gekoppelde ligatuur.
    Opmerking: Het bloed dat in de ader afgebonden kunnen legen via slagaderincisie maar mag niet meer bedragen dan 5 pl. Indien de bloeding voortduurt, trek de terugtrekking streng terugtrekking verhogen voorzichtig om eenvoid beschadiging van de ader van overmatige spanning.
  12. Gebruik een metrische liniaal de afsluitende sutuur en snijd de hechtdraad met een extra toelage van 2-3 mm voor de verwijdering van de afsluiter tijdens reperfusie. Houd de occlusie-inrichting met 45 graden tang en gebruik direct een tang om een ​​bocht op de juiste lengte te creëren om de MCA te bereiken, het markeren van een stopplaats voor vooruitgang.
    Opmerking: Een 10 mm occlusie lengte vanaf het siliconen uiteinde aan de bocht wordt gebruikt voor P10 Sprague Dawley of Long Evans ratten in deze gewichtsklasse.
  13. Gebruik 45 ° tang, voeden de polysiloxaan beklede nylon occlusie voorziene hechtdraad in de arteriotomie en vooraf de hechtdraad de bocht die de vooraf bepaalde afstand markeert het MCA (figuur 1C). Zorg ervoor dat de vooruitgang voelt glad; onmiddellijk te stoppen vooruitgang als de weerstand wordt gevoeld. Gedurende het vooruit, richt de hechtdraad in een richting die evenwijdig is aan de CC / ERK, naar de kop.
    OPMERKING: Als de hechting is geavanceerde dorsaal, in de richtingruggengraat van het dier, kan het uit te voeren in de pterygopalatine slagader (PTA). Als weerstand wordt gevoeld na 3-5 mm van de vooruitgang, is de hechting van de PTA kruising raakte. Terug de afsluiter uit de slagader tot de siliconenhoofd nabij de arteriotomie voordat u de voortbewegingsrichting. Het is niet nodig om de occlusie inrichting van de slagaderincisie volledig te verwijderen.
  14. Zet de afsluiter door binden tijdelijk ligatuur, met de streng uit stap 1.10 (Figuur 1D).
  15. Verwijder het oprolmechanisme clip. Snijd de strengen van beide tijdelijke ligaturen zodanig dat de streng van de knoop die wordt getrokken om de knoop te verwijderen is eenvoudig te begrijpen met rechte tang en is langer dan de streng die wordt getrokken om de knoop vast te zetten.
    OPMERKING: De strengen moet kort genoeg zijn, zodat ze niet in de war raken in de holte na de sluiting.
  16. Verwijder het oprolmechanismen en sluit de holte via 6-0 gevlochten zijden om 03:57 onderbroken hechtingen te maken.
  17. Verwijder het pupanesthesie en plaats het op een verwarmingselement in de kamer lucht. Bewaken van de pup tot hij voldoende bewustzijn borstligging te behouden en ervoor te zorgen dat deze volledig is hersteld alvorens terug te keren naar de dam heeft herwonnen. Zorgen dat de pup handhaaft een lichaamsoppervlak temperatuur tussen 35,5 ° C en 37 ° C.
  18. Tijdens occlusie, kan diffusie-gewogen magnetische resonantie beeldvorming (DW-MRI) onder isofluraan anesthesie worden gebruikt om de juiste inductie van schade te controleren. Figuur 2 toont lopende ischemisch letsel door DW-MRI gedetecteerd tijdens tMCAO 9.
    OPMERKING: Diffusie-gewogen spinecho planaire beeldvorming wordt uitgevoerd 10-15 minuten voorafgaand aan reperfusie. De gehele hersenen is afgebeeld met seriële 2-mm dikke coronale secties met de volgende pulsreeks instellingen: TR / TE = 5000/60 ms, 4 gemiddelden gezichtsveld = 35 mm, datamatrix = 128x128, diffusiegradiënt duur = 20 ms, scheiding = 29,7 ms, amplitude = 70mT / m, en b-factor = 1045 s / mm2.Dieren vertonen een gebrek aan corticale aantasting of atypische ischemische letsel, zoals in de hersenstam, zijn uitgesloten.

2. reperfusie

OPMERKING: Occlusie wordt uitgevoerd gedurende 3 uur aan een matige tot ernstige hoeveelheid trauma van het striatum en cortex veroorzaken.

  1. Ongeveer 2 uur en 50 minuten na occlusie van de MCA, verdoven de pup in 3% isofluraan in 100% O2. Handhaaf een lichaamsoppervlak temperatuur tussen 35,5 ° C en 37 ° C met behulp van een verwarmingselement onder de chirurgische fase.
  2. Verwijder de onderbroken hechtdraden uit stap 1,16 en zoek de verbinding, aangegeven door de twee ligaturen en het uiteinde van de afsluitende sutuur.
    OPMERKING: schijn-geopereerde dieren worden geïnduceerd en blijft onder narcose voor een gelijke tijdsperiode om het afgesloten dieren. De incisie wordt weer geopend en gehecht gesloten. Voor pseudo-geopereerde dieren verder met stap 2.11.
  3. zorgvuldig untiede laterale knoop eerder gebonden in stap 1.14 door aan de langere streng.
    OPMERKING: Indien er weerstand ontkoppeling van de knoop, stoppen zodat de correcte streng van de knoop wordt getrokken. Als de weerstand blijft, Vergroting verhogen voor een beter zicht. Wees voorzichtig bij het ontkoppelen, aangezien het mogelijk is om de slagader beschadigen tijdens deze stap.
  4. Verwijder de hechtdraad uit de holte.
  5. Om precies 3 uur na MCA-occlusie, langzaam terug de afsluitende hechtdraad uit de slagader. Er zal geen weerstand.
    LET OP: In de meeste gevallen zal er geen bloeden zijn. Indien een kleine hoeveelheid bloeden optreedt, druk uit op de slagader op de arteriotomieplaats.
  6. Tang om druk op de arteriotomie, als volgende stap herstelt ICA bloedstroom voor reperfusie.
  7. Voorzichtig los de mediale knoop op dezelfde manier als in stap 2.3.
  8. Verwijder de hechtdraad uit het lichaam en pas een hemostatisch middel aan de arteriotomie te stoppen met bloeden.
  9. Zorg ervoor dat het bloeden is gestopt.
    LET OP: Terugkeer van de oorspronkelijke vorm van de slagader en rode kleur bevestigt dat ICA bloedstroom is hersteld.
  10. Verwijder het oprolmechanismen en sluit de holte met 3-4 onderbroken hechtingen van 6-0 zijde gevlochten.
  11. Verwijder de pup uit verdoving en plaats het op een verwarmingskussen kamerlucht. Monitor totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging te behouden en te zorgen voor volledig herstel alvorens terug te keren naar de dam. Zorgen dat de pup handhaaft een lichaamsoppervlak temperatuur tussen 35,5 ° C en 37 ° C.
  12. Inspecteer de pups per dag gedurende 5 dagen. Recprd hun gewichten en inspecteren de incisie plaatsen nauw passende genezing. Verwijder de hechtingen na 7-14 dagen. Post-tMCAO letsel kan worden afgebeeld met MRI, indien gewenst, 9.
    LET OP: De dieren mogen verliezen tot 1 g gewicht op de eerste dag, maar zal meestal weer het gewicht zonder interventie en binnen een vergelijkbare wegent scala aan controles door dagen 4-5. In zeldzame gevallen kan een pup veel gewicht te verliezen of hebben moeite met het voeden, waarbij orale sondevoeding feeds voor 2-3 dagen.
  13. Op P21, kan schade betrouwbaar worden beoordeeld met sensorimotorische gedragstesten, zoals roterende staaf of cilinder fokken. Cognitieve tests kunnen worden uitgevoerd zodra 4-6 weken oud gebruikt assessments zoals nieuwe objectherkenning of de Morris water maze 13.
  14. Euthanaseren de rat door intraperitoneale injectie van Euthasol (50 mg / kg) voor de hersenen oogst 11, 12.
  15. Histologische analyse te beoordelen letsel volume of reactie op ingrepen kan worden uitgevoerd met cresyl violet of H & E kleuring (Figuur 3) 10.

Resultaten

De ernst van letsel veroorzaakt door tMCAO is in hoge mate afhankelijk is van zowel de occlusie tijd en de ervaring van de chirurg. Een 90-minuten occlusie levert vaak een lichte tot matige verwonding patroon, terwijl 3 uur produceert matige tot ernstige verwondingen. De ernst van de verwondingen kan worden beoordeeld door een verscheidenheid van methoden, waaronder MRI, histologie, of op korte of lange termijn gedrags-analyses. Figuur 2 toont een voorbeeld van de DW-MRI uitgevoerd 75 min in een 90 min occlusie, bevestigt ischemische trauma van de ipsilaterale hemisfeer. Diffusie gewogen beeldvorming demonstreert verhoogde diffusie in het ipsilaterale striatum en de meerderheid van de ipsilaterale cortex, zonder contralaterale verandert tijdens de acute ischemische fase. Dit correleert met een gematigd niveau van de lange termijn letsel waarbij zowel de cortex en de diepe grijze stof.

Occlusie van de MCA resultaten inceldood die begint in het striatum voor minder ernstige verwondingen en ontwikkelt verslechtering corticale en hippocampus blessure voor langere occlusie tijden en meer ernstige verwondingen. Tijdens optimalisering van de chirurgische techniek, zoals het bepalen van de hechting insteeklengte, MRI wordt sterk aanbevolen, omdat het zorgt voor de bevestiging van een goede hechting plaatsing en visualisatie van oedeem en schade progressie tijdens afsluiting 14, 15, 16. Als MRI niet beschikbaar is, H & E of cresyl violet vlekken zijn eenvoudige en betrouwbare methoden voor histologische schade morfologie bepalen en kan worden gebruikt zowel vroege als late tijdstippen na de tMCAO. Figuur 3 toont een matige tot ernstige verwondingen patroon op histopathologisch onderzoek na 3 uur occlusie, waaruit kystevorming en het volume in het ipsilaterale striatum en de cortex.

Aanbevelingen stereologische kwantificering van cresyl-violet-gekleurde coupes van de verhouding van ipsilaterale tot contralaterale hemisfeervolume berekenen bevestigt ipsilaterale ischemische reperfusieletsel. Wordt na het verdoven van het dier met Euthasol, werden de hersenen geoogst door transcardiale perfusie in 0,1 M PBS met 4% paraformaldehyde. Na overnacht postfixatie en equilibratie in 30% sucrose, werd de gehele hersenen in secties van 50 urn intervallen en elk twaalfde sectie werd geselecteerd gemonteerd en gekleurd met cresyl violet 10.

Zelfs met een lichte blessure, bewegingsapparaat veranderingen, zoals het omcirkelen en hemiparesis, worden geconstateerd tijdens de occlusie periode. Met meer ernstig letsel, zullen deze wijzigingen blijven bestaan ​​na reperfusie. Aanvullende gedragstesten kunnen worden gebruikt om de ernst van de verwonding en de roterende staaf of cilinder fokken testen van sensomotorische functie en de Morris water maze te beoordelencognitieve functie 13.

figure-results-1
Figuur 1: Leef Chirurgische Beelden van de tMCAO Procedure. (A) Het eerste hechtdraad wordt een lus rond de ICA, zoals beschreven in stap 1.6. (B) De eerste tijdelijke ligatuur wordt gebonden en de ICA wordt teruggetrokken. De tweede hechtdraad wordt een lus rond de ICA, lateraal van de eerste hechtdraad, zoals beschreven in stap 1.9. (C) De siliconencoating occlusie hechtdraad wordt in de arteriotomieplaats, zoals beschreven in stap 1.12. (D) de tweede tijdelijke ligatuur is gekoppeld aan de afsluiter vast te zetten, zoals beschreven in stap 1.14. Schaal bar = 1 mm.

figure-results-2
Figuur 2: MRI tijdens Occlusion Toont de Passende Eenzijdige Injury. Anterior-posterior, coronale beeldvlakken van de DW-MRI, uitgevoerd gedurende 90 minuten occlusie, die een verhoogde diffusie waarbij de ipsilaterale hemisfeer (pijlen), hetgeen consistent is met aanhoudende ischemische schade in de acute fase. Overgenomen met toestemming van Stroke 11. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Eenzijdige trauma van het striatum en Cortex bij 4 weken na tMCAO. Posterior naar anterior,-cresyl-violet gekleurde coronale hersensecties (elk 50 urn) geoogst van P38 dieren tonen tamelijk ernstig letsel (pijlen geven de ipsilaterale cysten en verminderde corticale enstriatale volume) na 3 uur tMCAO bij P10. Het ronde gat aan de linkerzijde de contralaterale hemisfeer identifier. Schaal bar = 5 mm. Overgenomen met toestemming van Neurobiologie van de ziekte 12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Kritische stappen in het protocol

Ten eerste is het belangrijk om normothermia vanaf het begin van de anesthesie te handhaven tot volledig herstel, want er zijn bekend bij zowel hypothermie 17 en hyperthermie 18 op de progressie van hersenletsel bij zowel onvolwassen en volwassen dieren. Ten tweede, terwijl daarnaast het dier en het terugtrekken van de insnijding optimale positionering ademhaling volgen en ervoor te zorgen dat de luchtpijp vrij compressie essentieel. Ten derde, vermijd knijpen of strekken van de nervus vagus, omdat deze veranderingen in de hartslag met vagale stimulatie kan veroorzaken. Ten vierde, omdat het terugtrekken van de ICA nodig is om het bloeden onder controle tijdens de slagaderincisie, aandacht moet worden tijdens het terugtrekken besteed aan de mate van spanning om te voorkomen dat schade aan de slagader. Als de slagader scheurt uit terugtrekken, of als er een slechte slagaderincisie incisie, het dier moet worden uitgesloten van de analyse vanwege het risicobloeding en slechte reperfusie.

Wijzigingen en het oplossen van problemen

MRI gebruikt als richtlijn kan de hechtdraad lengte worden geoptimaliseerd opdat de siliconen tip goed afsluit MCA de focale ischemie maken. Als MRI niet beschikbaar is, kan pups worden gedood voordat reperfusie voor dissectie om de plaatsing van de hechtdraad te visualiseren. Pas de hechting benodigde lengte. De jonggewicht sterk correleert met de afsluitende sutuur lengtevereisten. De occlusie tijd kan worden aangepast aan de mate van ernst van de verwonding aan te passen.

Bovendien hechtdraad vorm en lengte kritisch. Voor P10 Sprague-Dawley en Long Evans ratten met een gewicht 19-21 g, 10 mm is de optimale lengte van insertie in onze ervaring. Het verder insteken van de afsluitende sutuur kan leiden tot perforatie van het MCA. Bovendien zal de consistentie in de vorm van het afsluitende filament per operatie resulteren in een toegenomen consistentie van letsel pattern 19, 20. Om deze reden raden we het gebruik van professioneel vervaardigde hechtingen voor dit specifieke doel. Het is ook belangrijk om op te merken dat de schade patroon kan verschillen tussen de beoefenaars als gevolg van schijnbaar minieme verschillen in techniek.

Beperkingen van de techniek

Het uitvoeren van deze techniek in een klein, het ontwikkelen van knaagdier vereist aanzienlijke ervaring. Indien correct uitgevoerd, de chirurg is in staat om een ​​zeer consistent patroon van verwondingen aan de overkant van dieren van verschillende grootte veroorzaken en het bereiken van een overlevingspercentage van meer dan 95%. Bovendien, een goede chirurgische instrumenten zijn van essentieel belang. Chirurgische instrumenten moeten goed worden onderhouden om ervoor te zorgen dat alle instrument tips goed te benaderen.

Betekenis van deze techniek met betrekking tot bestaande of alternatieve methoden

Hoewel hypoxie-ischemie, of de Rice-Vannucci model 2 , wordt het meest gebruikt om hypoxisch-ischemische schade in de ontwikkeling van de hersenen te bestuderen, is het belangrijk om op te merken dat dit model van tMCAO verschilt van HI in dat er sprake is van voorbijgaande focale ischemie zonder globale hypoxie, gevolgd door een reperfusie fase waarin de obstructie wordt verwijderd en de bloedstroom wordt hersteld. Dit veroorzaakt een meer consistente en reproduceerbare letsel en is klinisch translationeel door letsel tot gevolg patroon vergelijkbaar met dat waargenomen bij voldragen pasgeborenen beroerte. Dit maakt de studie van focale letselpatronen en compenserende responsen in niet-verwonde weefsel.

Toekomstige toepassingen na het beheersen van deze techniek

Dit model lijkt op de meest voorkomende oorzaak van een beroerte in humane pasgeborenen, een tijdelijke occlusieve trombus die tijdens de perinatale periode 11, 21. De etiologie is niet geheel duidelijk en is het meest waarschijnlijk multifactoriële, maar aangenomen wordt in de meeste gevallen to resultaat van emboli passeren van de placenta 11. Daarnaast zijn veel pasgeborenen met veronderstelde perinatale beroerte vaak aanwezig bij latere toevallen of subtiele focale neurologische afwijkingen examen 22. Dit maakt het gebruik van een consistente, translationeel letsel model om mechanismen van letsel progressie en mogelijke therapeutische strategieën cruciaal te identificeren.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering werd verstrekt door de NIH K08 NS064094 en UCSF REAC-subsidies. De auteurs willen Nikita Derguin, Zinalda Vexler en Joel Faustino bedanken voor hun hulp bij de ontwikkeling van deze techniek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IsoflouraneHenry Schein50033anesthetisch middel, bij 3% 
Trinoculair SurgioscopeWorld Precision InstrumentsPSMT5N
VerwarmingskussenSunbeam000731-500-000lage tot medium stand
IR ThermometerExtech Instruments72-5270
Retractieset voor kleine dieren Fine Science Tools18200-20
CermaCut SchaarFine Science Tools14958-09
Dumont #5SF PincetFine Science Tools112522-002x
Dumont #5/45 PincetFine Science Tools11251-352x
B-2 Micro KlauwFine Science Tools00398-02
Pincet voor Klauw ApplicatieFine Science Tools00072-14
Micro Vannas SchaarFine Science Tools15000-032mm snijkant
Occlusie HechndradenDoccol602123PK10701712PK5Re
LineaalFine Science Tools
Hemostatisch Middel AviteneDVL1010590
6-0 Perma-Hand Zijde Omgekeerd SnijdendeHechtdraadEthicon769G
EuthasolVirbac7101010.22 mL/kg
WattenstaafjesHenry Schein100-9249
LaboratoriumtapeVWR89097-990

Referenties

  1. Grunt, S., et al. Incidence and outcomes of symptomatic neonatal arterial ischemic stroke. Pediatrics. 135 (5), 1220-1228 (2015).
  2. Rice, J. E., Vannucci 3rd, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  3. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8 (8), (1986).
  4. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  5. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
  6. Renolleau, S., Aggoun-Zouaoui, D., Ben-Ari, Y., Charriaut-Marlangue, C. A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat: morphological changes indicative of apoptosis. Stroke. 29 (7), 1454-1460 (1998).
  7. Perlman, J. M. Intervention strategies for neonatal hypoxic-ischemic cerebral injury. Clin Ther. 28 (9), 1353-1365 (2006).
  8. Derugin, N., Ferriero, D. M., Vexler, Z. S. Neonatal reversible focal cerebral ischemia: a new model. Neurosci Res. 32 (4), 349-353 (1998).
  9. Gonzalez, F. F., et al. Erythropoietin increases neurogenesis and oligodendrogliosis of subventricular zone precursor cells after neonatal stroke. Stroke. 44 (3), 753-758 (2013).
  10. Larpthaveesarp, A., Georgevits, M., Ferriero, D. M., Gonzalez, F. F. Delayed erythropoietin therapy improves histological and behavioral outcomes after transient neonatal stroke. Neurobiol Dis. , (2016).
  11. Rutherford, M. A., Ramenghi, L. A., Cowan, F. M. Neonatal stroke. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 97 (5), 377-384 (2012).
  12. van der Aa, N. E., Benders, M. J., Groenendaal, F., de Vries, L. S. Neonatal stroke: a review of the current evidence on epidemiology, pathogenesis, diagnostics and therapeutic options. Acta Paediatr. 103 (4), 356-364 (2014).
  13. Gonzalez, F. F., et al. Erythropoietin sustains cognitive function and brain volume after neonatal stroke. Dev Neurosci. 31 (5), 403-411 (2009).
  14. Dudink, J., et al. Evolution of unilateral perinatal arterial ischemic stroke on conventional and diffusion-weighted MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 30 (5), 998-1004 (2009).
  15. Derugin, N., et al. Magnetic resonance imaging as a surrogate measure for histological sub-chronic endpoint in a neonatal rat stroke model. Brain Res. 1066 (1-2), 46-56 (2005).
  16. Dzietko, M., Wendland, M., Derugin, N., Ferriero, D. M., Vexler, Z. S. Magnetic resonance imaging (MRI) as a translational tool for the study of neonatal stroke. J Child Neurol. 26 (9), 1145-1153 (2011).
  17. Mancuso, A., Derugin, N., Hara, K., Sharp, F. R., Weinstein, P. R. Mild hypothermia decreases the incidence of transient ADC reduction detected with diffusion MRI and expression of c-fos and hsp70 mRNA during acute focal ischemia in rats. Brain Res. 887 (1), 34-45 (2000).
  18. Kasdorf, E., Hyperthermia Perlman, J. M. Inflammation, and Perinatal Brain Injury. Pediatric Neurology. 49 (1), 8-14 (2013).
  19. Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412 (3), 185-190 (2007).
  20. Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
  21. Kirton, A., deVeber, G. Paediatric stroke: pressing issues and promising directions. Lancet Neurol. 14 (1), 92-102 (2015).
  22. Nelson, K. B. Perinatal ischemic stroke. Stroke. 38, 742-745 (2007).

Herprints en machtigingen

Tags

Neonataal berotemodelP10 ratmodelfocale ischemie reperfusiedemonstratie van chirurgische procedurearteriotomietechniekplaatsing van occlusiehechtingreperfusieprotocoldiffusieweging MRIhistologische analyse
Transient midden cerebrale slagader occlusie Model van Neonatale Stroke in P10 Rats
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.