Vein Interpositie Model: Een geschikt model om te studeren Bypass Graft Patency

Summary

Deze video demonstreert een model om de ontwikkeling van myointimale hyperplasie na veneuze interpositiechirurgie bij ratten te bestuderen.

Abstract

Bypass-grafting is een gevestigde behandelmethode voor coronaire hartziekte. De open blijvendheid van de grafts blijft de achilleshiel van safenvenegrafts. Onderzoeksmodellen voor bypass-graftfalen zijn essentieel voor een beter begrip van de pathobiologische en pathofysiologische processen tijdens het verlies van open blijvendheid van de grafts. Grote diermodellen, zoals varkens of schapen, lijken op menselijke anatomische structuren maar vereisen speciale faciliteiten en apparatuur. Deze video beschrijft een rattenvene-interpositiemodel om het verlies van open blijvendheid van de venegrafts te onderzoeken. Ratten zijn goedkoop en gemakkelijk te hanteren. Vergeleken met muismodellen, maakt de geschikte grootte van ratten betere handelbaarheid mogelijk en biedt het de mogelijkheid om voldoende materiaal te verkrijgen voor verdere diverse analyses. In het kort, de inferieure epigastrische vene van een donorrat wordt geoogst en gebruikt om een segment van de femorale ader te vervangen. Anastomose wordt uitgevoerd via enkele steken en verzegeld met fibrinekleefstof. De open blijvendheid van de grafts kan niet-invasief worden gemonitord met behulp van duplex-sonografie. Myointimale hyperplasie, de belangrijkste oorzaak van open blijvendheid van grafts, ontwikkelt zich geleidelijk en kan worden berekend aan de hand van histologische dwarsdoorsneden.

Introduction

Coronaire ziekten en hun complicaties behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Huidige therapeutische strategieën gericht op het herstel van de bloedstroom, hetzij door het verwijden van de vernauwde vat of door het creëren van een bypass. Coronaire bypass (CABG) met behulp van veneuze autografts werd voor het eerst beschreven in 1968 en is verfijnd door de jaren heen. Naast de revascularisatie van de linker anterieure dalende kransslagader, worden saphena leidingen meestgebruikte ^1. Echter, graft doorgankelijkheid blijft de achilleshiel van vene transplantaten (SVG). Een jaar na de operatie, graft doorgankelijkheid is 85%, gedaald tot 61% na tien jaar ^2,3. Onthulling van de pathofysiologische mechanismen en oorzaken van SVG doorgankelijkheid verlies is dan ook een belangrijke taak.

Deze video toont een rat ader tussenkomst model om veneuze graft verlies te onderzoeken. De algemene doelstellingen van deze methode zijn om de onderliggende pathobiological verkennenen -fysiologische processen tijdens progressie van de ziekte en een geschikt model voor het geneesmiddel of therapeutische optie testen te ontwikkelen. Door het transplanteren van de oppervlakkige epigastrische ader in het arteriële systeem, dit model nauw bootst de klinische setting van een coronaire bypass operatie. Chirurgisch trauma, ischemie, en de muur stress zijn belangrijke triggers van pathologische vasculaire veranderingen en worden nagebootst in de beschreven model.

Verschillende modellen en soorten zijn beschikbaar om veneuze graft doorgankelijkheid verlies te onderzoeken. Grote diermodellen, zoals varkens ^{4, 5} schapen, honden ^{6, 7} en apen, lijken van menselijke vaten en anatomische structuren en aldus mogelijk maken complexe therapeutische strategieën, zoals bypass stenting of nieuwe chirurgische technieken te testen ^8. Echter, speciale behuizing, apparatuur en personeel nodig. Bovendien hoge kosten en de noodzaak voor een extra anesthesist tijdens chirurgie belemmeren het bredere toepassing. Smalle dieren, met inbegrip van ratten, zijn gemakkelijk te hanteren, geen speciale behuizing vereisen, en hebben beheersbare kosten. Vergeleken met muismodellen ^9,10, ratmodellen het voordeel van betere bedienbaarheid en dus minder variabiliteit in het resultaat. Ratten zijn fysiologisch en genetisch meer vergelijkbaar met de mens dan muizen ^11,12. Daarnaast hebben de meeste wild-type muizen zich alleen ontwikkelen beperkte myointima ^13, die muismodellen gevoelig zijn voor II typefouten te maken. De histologie van de muis belangrijkste aderen zoals de vena cava inferior, slechts uit enkele cellagen en maakt vroegtijdige evaluatie ¹³ moeilijk. Een verder nadeel is de kleine hoeveelheid weefsel beschikbaar voor verdere analyse na transplantatie herstel.

De in deze video beschreven model is reproduceerbaar, goedkoop en gemakkelijk uit te voeren en kan snel en betrouwbaar worden vastgesteld. Het is vooral geschikt om te beoordelen dure experimentele therapeutische middelen, zoals virale vectorenvoor gentherapie, op een economische wijze.

Protocol

Dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de Gids voor de beginselen van proefdieren, opgesteld door het Institute of Laboratory Animal Resources en gepubliceerd door de National Institutes of Health. Alle dieren protocollen zijn goedgekeurd door de bevoegde lokale overheid ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Bureau voor Gezondheid en Consumentenbescherming) Hamburg").

1. Animal Care

1. Verkrijgen van Lewis ratten (LEW / Crl) ratten en ROSA / luciferase-LEW transgene ratten met een gewicht van 300-350 g van het Instituut van proefdieren.
2. Houd de ratten onder gebruikelijke voorwaarden in geventileerde kasten en hen voeden standaard rat chow en geautoclaveerd water ad libitum.
3. Voer een graft transplantatie met behulp van de ROSA / luciferase-LEW transgene ratten als donoren en de syngene LEW / Crl ratten als de ontvangers.

2. Voorbereiding van de Donor Rat

1. Gebruik een inlaation kamer naar een rat met isofluraan (2,5-3%) verdoven.
2. Plaats de rat op zijn rug en de anesthesie met een masker over de mond en neus handhaven. Controleer of er voldoende diepte van de anesthesie door knijpen de achterpoten en de controle op de afwezigheid van reflexen. Breng wat vet zalf om de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
3. Spreid de achterpoten en hun positie te bepalen met behulp van tape.
4. Scheer de lies haar met een tondeuse en ontsmet het hele gebied met behulp van povidonjood, gevolgd door 80% ethanol. Herhaal de desinfectie stap tweemaal.
   LET OP: De chirurgische gebied, gaas en chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd. Zorg voor een steriele veld gedurende de procedure en slijtage eenmalig gebruik, steriele chirurgische handschoenen, maskers, en petten.
5. Onder een microscoop, het uitvoeren van een verticale insnijding langs de linea inguinalis. Gebruik twee tang om voorzichtig scheiden van de onderhuidse weefsels en bloot de oppervlakkige epigastrische ader van zijn origin de femorale ader. Zorgvuldig isoleren epigastrische oppervlakkige ader van de omliggende weefsels.
6. Stop bloedstroom in de ader oppervlakkige epigastrische met twee micro klemmen.
7. Oogst een ongeveer 0,5 tot 1 cm segment van de ader door voorzichtig optillen van de geïsoleerde ader met een tang en snijden door het vat met microscissors. Laat de micro klemmen op het vaartuig stomp om bloedverlies te voorkomen. Leg het verwijderde stukje ader op steriel gaasje. Plaats voorzichtig een 30 G naald in het ene uiteinde van de geoogste ader en spoel het vat met heparine (50 eenheden / ml).
   LET OP: Behandel de ader met zorg en beschadiging tijdens het heffen, snijden, en blozen te vermijden. Zorg ervoor dat u het transplantaat te spoelen met de juiste hoeveelheid heparine.
8. Houd het segment schip in 1% lidocaïne op ijs tot transplantatie in de ontvanger rat een schip kramp te voorkomen.
9. Euthanaseren de donor rat door het verhogen van de narcose tot 5% isofluraan. Na 2-3 minuten, open de buik langs de linea alba, dwars door het middenrif, en verwijder het hart om de circulatie te stoppen.

3. Voorbereiding van de ontvanger Rat

1. Verdoven en bevestig de ontvanger rat op dezelfde manier als de donor rat.
2. Scheer de mediale zijde van de benen met een tondeuse en ontsmet driemaal met gebruikmaking van povidon-jood en 80% ethanol.
3. Bewaken van de diepte van de anesthesie en ervoor te zorgen dat het voldoende is door controle op de afwezigheid van reflexen als knijpen de achterpoten.
4. Voer een mediane dijbeen insnijding van de knie tot de lies plooi. Onder een microscoop gebruikt 2 tang om de femorale arterie gescheiden van zijn omgeving.
5. Gebruik micro klemmen om de bloedstroom te stoppen. Plaats de proximale klem, gevolgd door het distale klem.
6. Knip een korte segment van de geklemde dijbeenslagader met microscissors en gooi deze weg. Kort de resterende arteriële stomp met microscissors, het creëren van een kloof die is1-2 mm groter dan de ader graft. Spoel de arteriële stomp met heparine met behulp van een 30 G naald.
   OPMERKING: Als de adventitia steekt iets buiten het schip stomp, een tang om het iets te trekken over het einde van het vat en verwijderen van een stuk.
7. Plaats de geoogste ader uit stap 2.8 tussen de arteriële stompen en de lengte aan te passen, zodat deze voldoende past in het gat. Let op de richting van de ader.
8. Voer de proximale anastomose eerst met behulp van een 10-0 prolene hechtdraad. Gedrag enkele steken in de getoonde (figuur 1D) orde. Begin met een hechting aan elke zijkant voor het toevoegen van drie hechtingen aan de buikzijde. Daarna plaatst drie steken aan de rugzijde van het vaartuig de anastomose te voltooien.
9. Sluit het distale vaten met het transplantaat gebruikmaking van dezelfde techniek als de proximale anastomose bij stap 3.8. Nogmaals, te beginnen met een hechting aan elke zijkant en leg drie hechtingen aan de ventrale side en de rugzijde.
10. Plaats twee 1-mL spuiten met fibrinelijm component 1 en 2. Til het transplantaat met een tang en drop ongeveer 100 ul van fibrinelijm component 1 in het kader van het transplantaat, gevolgd door component 2.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de onderdelen 1 en 2 worden toegepast in een verhouding 1: 1.
11. Plaats het implantaat terug op zijn plaats en drop een extra 100 pi componenten 1 en 2 boven het transplantaat. Zorg ervoor dat de lijm heeft zowel betrekking op het transplantaat en de anastomose om anastomotisch insufficiëntie en over-uitzetting van de ader graft te voorkomen.
12. Open voorzichtig de distale klem, gevolgd door de proximale.
13. Bevestig een succesvolle operatie door te controleren op een zichtbare puls in de getransplanteerde ader en slagader distaal van het transplantaat.
14. Verwijder overtollige lijm, die sluiting huid belemmert. Gebruik een tang om de uitgeharde lijm te tillen en verwijder de overtollige met microscissors. Sluit de lagen huid met 5-0 Prolene hechtingen.
15. Injecteren 4-5 mg / kg Carprofen subcutaan alvorens de rat om wakker te worden. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Houd het dier in een kooi totdat deze volledig is hersteld.
16. Voeg Metamizool aan het drinkwater (50 mg Metamizool per 100 ml) als pijnstillers voor de volgende 3 dagen en dagelijks toezicht het dier.

4. Duplex Sonography

LET OP: Gebruik duxplex echografie om de bloedstroom te visualiseren non-invasief bij ratten ^14.

1. Verdoven een rat in een inductie kamer (isofluraan 2%). Plaats de rat op zijn rug en anesthesie te onderhouden met een gezichtsmasker voor de neus.
2. Gebruik tondeuses en ontharingscrème om het haar rond het gebied van de dij te verwijderen.
3. Toepassen ultrasoongel de dij. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen. Acquire duplex echografie beelden met behulp van een MS 400 transducer (midden frequentie: 30 MHz) met een beeldsnelheid van 230-400 frames / sec.

5. Histopathologie

LET OP: Oogst en vlekken op het schip met Masson's trichroomkleuring voor morfometrische analyse ^15.

1. Bevestig de geoogste vat in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht en dehydrateren in toenemende concentraties ethanol. Insluiten het monster in paraffine en snijd het in 5 micrometer dikke plakken met behulp van een microtoom.
   OPMERKING: Paraformaldehyde is giftig en moet met speciale zorg worden behandeld.
2. Deparaffinize de dia's alvorens ze te kleuren met trichroomkleuring oplossing. Dehydrateer de gebrandschilderde dia's, verwijder ze met xyleen, en zet ze in de montage medium. Na het drogen van de dia's, bekijk de monsters met een microscoop.

6. Bioluminescentie Imaging (BLI)

LET OP: De postoperatieve transplantaat werd gevolgd in de tijd in vivo door het meten van lichtgevende signaal ¹6.

1. Los 1 g D-luciferine kaliumzout in 22 ml PBS en injecteren intraperitoneaal in de ratten (375 mg / kg lichaamsgewicht). Wacht 15 min voor de luciferine circuleren in het dier.
2. Plaats de rat in een real-time bioluminescente kwantificering systeem en toegang tot de bioluminescentie signaal.

Results

De ader tussenkomst rat model is geschikt voor de ontwikkeling van myointima hyperplasie en veneuze graft falen bestuderen. Dieren goed herstellen van de operatie en toon uitstekende fysieke conditie na de operatie. Figuur 1 toont de belangrijkste operatiestappen. Nadat de huid incisie langs de linea inguinalis, de epigastrische oppervlakkige ader en liesslagader geïdentificeerd (Figuur 1A). Het oogsten van het transplantaat moet zorgvuldig worden uitgevoerd zonder beschadiging van het ...

Discussion

Deze video toont een rat ader tussenkomst model te onderzoeken vein graft verlies en om voor de exploratie van de onderliggende pathologische processen en het testen van nieuwe geneesmiddelen of therapeutische opties.

Anesthesie is een cruciaal aspect van chirurgische procedures. Een continue inhalatieve anesthesie wordt aanbevolen, aangezien dit een veilige en eenvoudige methode, vooral tijdens langdurige operaties. Dit kan van groot belang zijn tijdens de trainingsfase Indien de operatie d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizol
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocaïne
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	Fibrine lijm
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		Bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment