Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Momenteel is het mogelijk om recombinante vormen van verschillende virussen, zoals humaan immunodeficiëntievirus 1 (HIV-1) en hepatitis C-virus (HCV), te construeren die vreemde genen, zoals een reporter- of markereiwit, in hun genomen dragen. Deze recombinante virussen bootsen meestal getrouw de levenscyclus van het oorspronkelijke virus in geïnfecteerde cellen na en vertonen dezelfde gastheerbereiksafhankelijkheid. De ontwikkeling van een recombinant virus maakt de efficiënte screening van remmers en de identificatie van specifieke gastheerfactoren mogelijk. Tot op heden is de constructie van recombinant hepatitis B-virus (HBV) echter moeilijk geweest vanwege verschillende experimentele beperkingen. De belangrijkste beperking is de compacte genoomgrootte van HBV, en een redelijk strikte genoomgrootte die 1,3 genoomgroottes niet overschrijdt, die in virionen moet worden verpakt. Dus de grootte van een te plaatsen vreemd gen moet kleiner zijn dan 0,4 kb als er geen verwijdering van het genoom-DNA plaatsvindt. Daarom is om deze groottebeperking te overwinnen, de verwijdering van een deel van HBV-DNA vereist. Hier rapporteren we de constructie van recombinant HBV dat een reportergen codeert om het vroege stadium van de HBV-replicatiecyclus te monitoren door een deel van de HBV-kerncodegebied te vervangen met het reportergen door een deel van de HBV pol-codegebied te verwijderen. Detectie van recombinante HBV-infectie, gemonitord door de reporteractiviteit, was zeer gevoelig en goedkoper dan detectie met behulp van de momenteel beschikbare conventionele methoden om HBV-infectie te evalueren. Dit systeem zal nuttig zijn voor een aantal toepassingen, waaronder high-throughput screening voor de identificatie van anti-HBV remmers, gastheerfactoren en virus-gevoelige cellen.
Inleiding
Chronische infectie met hepatitis B-virus (HBV) is een belangrijke risicofactor voor chronische leverziekten 1. Hoewel de huidige therapeutische strategieën gebaseerd op nucleotide analogen die HBV pol functie en / of de toediening van type I interferon dat immuunresponsen bij geïnfecteerde individuen geactiveerd als indirect onderdrukt HBV proliferatie doorgaande interferon gestimuleerde genfuncties 2 remmen, kunnen deze behandelingen niet HBV elimineren DNA volledig 3. Bovendien is de opkomst van HBV die resistent zijn tegen anti- pol middelen zijn baart 4. De toediening van gecombineerde antivirale middelen direct gericht de verschillende stappen van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) of hepatitis C virus (HCV) levenscyclus bleek succesvol onderdrukken of uitroeien virus (sen). Soortgelijke dit idee, de ontwikkeling van anti-HBV middel (en) die direct aan de verschillende stadia van de H handelenBV life cycle is van belang voor de vaststelling van de toekomstige HBV therapieën.
In het algemeen, het opzetten van een eenvoudige in vitro kweeksysteem van het doelwit virus vergemakkelijkt de ontwikkeling van anti-virus middelen. Er zijn echter ten minste twee belemmeringen voor de ontwikkeling van in vitro kweeksystemen voor het screenen van anti-HBV middelen. De eerste is het ontbreken van een geschikt in vitro celkweeksysteem voor HBV-infectie / proliferatie. In tegenstelling tot andere virussen, zoals HIV en HCV, die zijn gekweekt in gevestigde cellijnen, is het moeilijk om HBV kweken in vitro door experimentele beperkingen waaronder een smal gastheerbereik. Het gebruik van specifieke celkweek systemen zoals het humane hepatoma cellijn HepaRG, dat gevoelig is voor HBV-infectie, 5, 6, 7 zijn ontwikkeld om deze problemen te overwinnen. Bovendien PXB cellen, geïsoleerd van urokinase-type plasminogeenactivator transgene / SCID-muizen geïnoculeerd met primaire humane hepatocyten (PHH), bleken gevoelig voor HBV-infectie en replicatie 8 te zijn. Echter, HBV replicatie niveaus HepaRG zijn afhankelijk van de celdifferentiatie toestand na cultuur die inconsistent en reproduceerbare resultaten van HBV-infectie / replicatie niveaus veroorzaken. PXB wordt gebruikt voor HBV-infectie experimenten maar is beperkt door de beschikbaarheid. Een tetracycline induceerbare HBV expressie cellijn HepAD38 is ook op grote schaal gebruikt voor HBV replicatie studie, maar dit systeem staat slechts evaluatie na transcriptie en niet instaphulp HBV infectie 9. Onlangs heeft de identificatie van natriumtaurocholaat (Ntcp) als een functionele receptor voor HBV kon de ontwikkeling van een variabele HBV kweeksysteem 10. Inderdaad, NTCP expressie in niet-gevoelige hepatocarcinoma cellen zoals Huh7 enHepG2 maakt HBV-infectie 10 en derhalve is de keuze van HBV gevoelige cellijnen uitgebreid, oplossen vele experimentele beperkingen. Het tweede probleem is het gebrek aan een eenvoudig testsysteem HBV-infectie en replicatie evalueren. Evaluatie van HBV-infectie wordt gewoonlijk uitgevoerd door het analyseren van HBV DNA, RNA en eiwitten. Echter, kwantificering van deze markers virus is tijdrovend, duur en vaak niet altijd eenvoudig. Daarom is de ontwikkeling van een eenvoudig testsysteem, zoals het gebruik van een reportergen, kunnen problemen met HBV testsystemen overwinnen.
Omdat het genoom grootte die kan worden verpakt in een HBV capside beperkt - minder dan 3,7 kb 11 - de grootte van een reportergen moeten zo kort mogelijk zijn. Bovendien is de aanwezigheid van meerdere cis- elementen verspreid door het genoom, die essentieel zijn voor virale replicatie, beperkt de beschikbare functies in insertie van het reportergen in het genoom. Verscheidene rapporten hebben geprobeerd om vreemde genen, waaronder HIV-1 Tat, groen fluorescerend eiwit, en DsRed invoegen in het HBV genoom 11, 12, 13. Echter, deze recombinante HBV niet bruikbaar voor het screenen van HBV-infectie / replicatie of voor high-throughput screening van factoren die HBV-infectie / replicatie. Dit komt voornamelijk door de lage productiviteit van recombinante virussen en de verminderde intensiteit van reportergenexpressie veroorzaakt door inefficiënte virusproductie.
Om deze problemen te overwinnen, geconstrueerd we een reporter HBV met een hoge opbrengst van virusproductie. Dit virus is zeer gevoelig voor de controle van de vroege stadia van de replicatiecyclus HBV, from entry transcriptie. Hiervoor NanoLuc (NL) gekozen als een merkergen omdat het een klein (171 aminozuren) ontworpen luminescente reporterclass = "xref"> 14. Bovendien NL is ongeveer 150 maal helderder dan vuurvlieg en Renilla luciferase, en de luminescente reactie ATP-onafhankelijk, wat suggereert dat de valse hit rate laag is voor high-throughput screening zal zijn. De productie-efficiëntie van het recombinante HBV ongeveer 1/5 van de bovenliggende HBV en soortgelijke niveaus over de voorbije HBV recombinante virussen; De helderheid van NL overwint productiviteit virus problemen zodat het kan worden gebruikt voor de massale screening van anti-HBV middelen.
Screening van anti-HBV middelen gebruikmakend van primaire hepatocyten kan HepaRG, HepAD38 en NTCP getransduceerde hepatocyten bruikbaar voor het screenen van anti-HBV middelen met gebruikelijke methode (en). De hier beschreven systeem heeft diverse voordelen, zoals eenvoudige bediening, hoge gevoeligheid en lage kosten voor screening. Deze voordelen zijn geschikt voor high throughput assays te ontwikkelen en identificeren van nieuwe HBV middelen voor therapeutische doeleinden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Productie van recombinant HBV coderen de reporterproteïne
- Bereiding van HepG2-cellen
- Bereid celkweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 100 U / ml niet-essentiële aminozuren).
- Plaat 4 x 10 6 HepG2 cellen in een 10-cm-collageen gecoate schaal in 10 ml kweekmedium de dag voor transfectie. Incubeer HepG2 cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
Opmerking: Als er ongeveer 4 x 10 6 HepG2-cellen uitgeplaat in 10 cm-collageen gecoate schaal in 10 ml kweekmedium, worden ze 70-90% confluent de volgende dag.
- transfectie
- Transfecteren HepG2 cellen met 5 ug pUC1.2HBV delta epsilon 15 en 5 ug pUC1.2HBV / NL 15 transfectie met eenreagens volgens de instructies van de fabrikant.
- De volgende dag, verwijder het kweekmedium en voeg 10 ml vers kweekmedium.
- Eén week na transfectie, breng het kweekmedium dat het recombinante HBV een ml-buis 50 en verder met stap 1.3.1. Voeg 10 ml vers kweekmedium aan de plaat die de getransfecteerde cellen.
OPMERKING: Productie van de recombinante HBV wordt gedurende 4 weken. Het kweekmedium dat recombinant HBV gedurende 1 maand opgeslagen bij 4 ° C.
- Zuivering van recombinant HBV
- Celafval te verwijderen uit het kweekmedium dat recombinant HBV door centrifugatie (2300 g gedurende 5 minuten).
- Passeer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 urn membraanfilter.
- Voeg een gelijk volume van 26% PEG / 1,5 M NaCl (polyethyleenglycol 6000: 130 g NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 en 5 ml 1 M HEPES pH 7,6 in 500 ml) aan het kweekmedium die recombinanteHBV en meng voorzichtig. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Centrifugeer bij 2300 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en los de pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Verwijder de resten door centrifugatie bij 2300 xg gedurende 5 minuten.
- Load 0,5 ml TNE die recombinante HBV op 0,8 ml van 20% sucrose in TNE.
- Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 3 uur bij 15 ° C.
- Gooi zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk, en bewaar de pellet. Resuspendeer in 1 ml serumvrij DMEM per 40 ml kweekmedium starten.
- Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Filtreer door een 0,45 pm filter. Bereid 0,5 ml porties en bewaar bij -80 ° C.
LET OP: Als reporter eiwit verontreiniging van het oorspronkelijke virus monster wordt waargenomen, te zuiveren van het virus door dichtheidsgradiënt ultra-centrifugeren van 5-30% sucrose in TNE bij 100.000 xg gedurende 2 uur, of CsCl dichtheid evenwicht gebracht centrifugeren weerm 1,1-1,6 g / ml bij 150.000 xg gedurende 50 uur.
2. Infectie van Recombinant HBV
- Cultuur HepG2-cellen stabiel tot expressie NTCP (HepG2 / NTCP) 15 die vatbaar zijn voor HBV-infectie in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 250 ug / ml G-418 en 100 U / ml zijn essentiële aminozuren bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
- Een dag voor infectie, plaat van ongeveer 5 x 10 4 HepG2 / NTCP cellen 14 in een 96-well collageen beklede plaat in 0,1 ml kweekmedium.
- Dooi recombinant HBV in een 37 ° C waterbad totdat er een klein stukje in de injectieflacon ijs.
- Bereid het medium voor infectie door het volgende te combineren: 10 pl 40% PEG8000 in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2 pl dimethylsulfoxide (DMSO), 10 gl recombinant HBV en 78 pl vers kweekmediumper putje van een 96-wells plaat.
- Voeg 100 gl recombinant HBV oplossing een putje van de 96-well plaat.
- Eén dag na infectie was de geïnfecteerde cellen 3 maal met 300 pi PBS per putje om de verontreinigende reporter eiwit van het virus fractie te verwijderen.
- Incubeer geïnfecteerde cellen in 200 gl kweekmedium dat 2% DMSO gedurende één week of minder.
3. Analyse
- Eén week na infectie was de geïnfecteerde cellen 3 maal met PBS.
- Voeg 50 ul lysisbuffer aan de geïnfecteerde cellen.
- Rock de cultuur plaat gedurende 5 minuten, en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 minuten.
- Voeg 50 ul van de verslaggever substraat in de luminometer plaat.
- Voeg 20 ul cellysaat een luminometer plaat die het reporter substraat. Meng door vortexen kort.
- Plaats de plaat in de luminometer en start het lezen van 15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont een schema van het HBV genoom getranscribeerd RNA, virus eiwitten en hun coderende gebied op het genoom. Het reportergen en de ligging in het genoom zijn ook aangegeven. Figuur 2 toont de HBV reporterplasmide en helper plasmide dat het reporter gen. De pUC1.2HBV / NL reporter werd geconstrueerd door het verwijderen van nucleotideposities 223-811 van de transcriptie initiatie site van de precore mRNA van pUC1.2HBV 16...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het HBV genoom vier belangrijke open leesramen (ORF's), waaronder de kern, polymerase, oppervlak en X ORF (Figuur 1). Transcriptie van deze vier HBV ORF wordt strak gereguleerd door vier initiatiefnemers: de precore / kern promoter met enhancer II, S1 promotor, S2 promotor en X promoter met enhancer I 18. De 3,5 kb en 3,4 kb mRNA's worden vertaald in PreCore en Core eiwitten, respectievelijk. De grote envelop-eiwit (L) wordt geproduceerd uit de grootste subgenomische mRNA...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het onderzoeksprogramma over hepatitis van de Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) en door subsidies voor wetenschappelijk onderzoek van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT) van Japan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/L EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5x Buffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | - | - | Referentie 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | - | - | Referentie 15 |
| pUC1.2HBV/NL | - | - | Referentie 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | - | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
Referenties
- Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
- Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
- Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
- Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
- Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
- Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
- Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
- Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306(2013).
- Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
- Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
- Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
- Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
- Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
- Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
- Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
- Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
- Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
