Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Samenvatting

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Samenvatting

Een beperkende factor van transgene muismodellen van mamma-adenocarcinoom is dat de primaire tumorbelasting in het mammaweefsel typisch de eindpunten van het onderzoek bepaalt. Daarom zijn onderzoeken die zich richten op het verduidelijken van mechanismen van late-stage de novo metastase gehinderd, net als onderzoeken die de effectiviteit van antikankertherapieën onderzoeken die zich richten op mediatoren van metastase in de adjuvante setting. Er zijn talloze muismodellen voor mammakanker ontwikkeld door gerichte expressie van dominante oncoproteïnen naar mamma-epitheelcellen, waardoor modellen ontstonden die histopathologische en transcriptome-gedefinieerde borstkankersubtypen die bij vrouwen vaak voorkomen, variabel nabootsten¹. Hoewel er veel is geleerd over de biologie van mammacarcinogenese met deze modellen, is hun nut in het identificeren van moleculen die de groei van late-stadiummetastasen reguleren, beperkt omdat muizen typisch op vroegere tijdstippen worden geëuthanaseerd vanwege een significante primaire tumorbelasting. Bovendien, aangezien een aanzienlijk percentage vrouwen dat met borstkanker wordt gediagnosticeerd adjuvante therapie ontvangt na chirurgische resectie van primaire tumoren en vóór de aanwezigheid van detecteerbare metastatische ziekte, zijn preklinische modellen van de novo metastase dringend nodig als platform om nieuwe therapieën te evalueren die zijn gericht op het targeten van metastatische foci. Om deze tekortkomingen aan te pakken, ontwikkelden we een muismodel van de novo mammakankermetastase, waarbij primaire mammatumoren chirurgisch worden verwijderd en metastatische foci zich vervolgens ontwikkelen gedurende een periode van 115 dagen na de operatie. Deze lange latentie biedt een hanteerbaar model om functioneel significante regulatoren van metastatische progressie te identificeren bij muizen zonder primaire tumor, evenals een model om de preklinische therapeutische effectiviteit van agenten te evalueren die zijn gericht op het blokkeren van functioneel significante moleculen die helpen bij het overleven en de groei van metastatische tumoren.

Inleiding

Vrouwen in Noord-Amerika hebben een levensduur van 12% voor het ontwikkelen van borstkanker ² ; Een meerderheid van deze personen zullen primaire tumoren hebben verwijderd via de operatie, en afhankelijk van het subtype van kanker, krijgen dan gerichte, endocriene, chemo- en / of stralingstherapie in de adjuvante instelling ³ . Voorbeelden zijn onder meer vrouwen met hormoonreceptor-positieve kanker die anti-oestrogeen therapieën ontvangen en vrouwen met HER2-positieve tumoren die HER2-gerichte therapieën ontvangen met straling / chemotherapie, terwijl er nog geen gerichte therapieën beschikbaar zijn voor drievoudige negatieve tumoren ³ . Ondanks de vooruitgang in straling, chemotherapie, gepersonaliseerde en hormoon gebaseerde therapieën die chirurgische resectie aanvullen, komt de ziekte terug bij 30-70% van de vrouwen die gediagnosticeerd zijn met fase II of III-ziekte ⁴ , aangezien therapieën grotendeels ondoeltreffend zijn bij het uitroeien van metastatische ziekte in verre organen, waaronder Long, bot, bRegen en / of lever ⁵ . Dit is vooral belangrijk gezien het feit dat wanneer metastatische ziekte optreedt bij afwezigheid van primaire tumor hergroei, dit impliceert dat verspreide kwaadaardige cellen waarschijnlijk al in secundaire organen aanwezig waren op het moment van definitieve operatie. Dientengevolge zijn therapieën die de groei van metastatische tumoren kunnen uitroeien of vertragen, dringend nodig.

Terwijl de novo- muismodellen van mammary carcinogenese opvallend informatief zijn bij het onthullen van mechanismen die neoplastische progressie ¹ regelen, hebben bestaande modellen ook verschillende beperkingen. Een hiervan is het feit dat transgenische modellen van de novo doorgaans primaire tumoren ontwikkelen in meervoudige borstklippen, waarbij de primaire tumorbelasting de duur van de studies beperkt. Terwijl primaire tumorcel ontsnappen en metastatische zaaien zich waarschijnlijk vroeg in neoplastische progressie in deze modellen voordoen, komt de franke ontwikkeling van metastatische tumoren te vroeg voor en hangt er af van oN het muismodel en de achtergrond van de stam, is vaak gedeeltelijk penetrant ¹ . Dit beperkt verder het nut van de novo modellen voor het ontdekken van moleculen die de metastase reguleren in secundaire organen en voor het evalueren van de preclinische werkzaamheid van de therapeutica in de adjuvante omgeving.

Om deze beperkingen te omzeilen, ontwikkelden we een de novo autochthonisch model van mammary carcinoom metastase naar longen. Oudertransgene vrouwen ( dwz MMTV-PyMT op de FVB / n-stamachtergrond voor studies die hierin beschreven zijn) met een latere stadium de novo- mammatumoren zijn ouder tot ~ 100 dagen ⁶ , op welk punt hun primaire tumoren chirurgisch worden gerececteerd en enzymatisch gedisocieerd in Enkelcel suspensies. Suspensies (1 x 10 ⁶ cellen) worden op hun beurt orthotopisch geëxplanteerd in 6-7 weken oude ontvanger syngeneuze vrouwelijke muizen, waar enkele primaire mammertumoren zich ontwikkelen over een periode van 38 tot 60 dagen ( Figuur 1A). Bij een gedefinieerde tumorgrootte (172 tot 450 mm ³ ) worden ontvanger muizen verdoofd en worden primaire tumoren chirurgisch geresecteerd, zodat tumorhergroei op de chirurgische plaats minimaal is, consistent met de operatie bij vrouwen ( aanvullend figuur 1 ). Op de FVB / n stamachtergrond ontwikkelen muizen histologisch detecteerbare metastatische foci in de longen met 45% penetratie door ~ 115 dagen na de operatie ( Figuur 1B ). Met deze uitgebreide latentie van metastatische tumorgroei is het model uniek gepositioneerd voor adjuvante therapieafgifte en voor het ophelderen en evalueren van onderliggende biologie die de metastatische progressie beïnvloeden na chirurgische verwijdering van primaire tumoren.

Protocol

Dieren die in het volgende protocol worden gebruikt, worden gedekt door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Oregon Health & Science University (IACUC), die is ontworpen om te voldoen aan de wetgeving inzake dierenwelzijnsregels en het PHS-beleid.

Onderhoud van steriele omstandigheden: Steriliseerde instrumenten moeten gebruikt worden en tussen muizen schoon worden met steriel gaas, gespoeld in PBS, gevolgd door sterilisatie met 70% ethanol desinfectiemiddel gedurende tenminste 15 minuten. Een chirurgische pet, een facemask, een toga en een handschoen moet gedragen worden voor overlevingsoperaties. Pre-operatieve voorbereiding van het dier voor overlevingsoperaties is opgenomen in het volgende protocol. Raadpleeg tabel 1 voor een lijst met reagentia en apparatuur.

1. Isolatie en bereiding van enkelcelsuspensies uit primaire mammamomentoren

1. Verdoof donorvrouw 100 dagen oude transgene MMTV-PyMT (FVB / n) muizen en onderhouden onder cOntwijkende sedatie door toediening van 2% isofluraan via een verdovingsmasker. Bevestig dat de muis goed verdoofd is met een afwezig voetreflexreflex.
2. In een steriele omgeving reserveert u primaire mammatumoren uit 100-dagen oude transgene vrouwelijke MMTV-PyMT (FVB / n) muizen door het uitdelen van de borsttumor van de overliggende huid en het omliggende vetweefsel en / of lymfeklieren door middel van steriele scharen. Euthanize de verdoofde muizen door cervicale dislocatie.
3. Met steriele schaar of een scalpel, maalgewassen primaire tumoren handmatig in kleine stukken (~ 1,0 mm ³ ). Plaats tumor stukken in 3,0 mg / ml collagenase A en 4,0 U / ml DNase I opgelost in DMEM. Gebruik ~ 10 ml van het bovenstaande verteermedium per 1,0 cm diameter tumor.
   1. Voer de spijsvertering uit in een steriele 25 ml fles met een steriele roerbalk bij ~ 125 rpm en 37 ° C gedurende 40 minuten.
4. Stop de spijsvertering door foetaal runder serum (FBS) toe te voegen tot een uiteindelijke verdunning van 10% en plaats het gehele mengsel op wEt ijs waar het wordt gehandhaafd.
5. Filter de verteerde tumor suspensie door een 0,7 μm nylon zeef in een 50 ml conische buis en wis eventuele resterende tumor in de zeef. Centrifugeer het supernatant bij 300 xg bij 4 ° C.
6. Resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM per 1,0 cm tumor en herfilter door een 0,7 μm nylon filter. Tel celconcentratie, centrifugeer vervolgens bij 300 xg bij 4 ° C.
7. Resulteer pellet in 10% dimethylsulfoxide met 90% FBS bij een concentratie van 2 x ¹⁰⁷ levende cellen / ml. Bewaar single-cel suspensies van hele primaire tumor bij -80 ° C.

2. Orthotopic Injection of Mammary Tumor

1. Gedeeltelijk ontdooide bevroren primaire tumor suspensies bij 37 ° C totdat de bevroren pellet uit de cryogene buis in 20 ml DMEM kan worden vrijgelaten en de cellen tellen. Centrifugeer bij 300 xg bij 4 ° C en resuspendeer cellen in een 1: 1 DMEM: groeifactor gereduceerde gesolubileerde keldermembraanpreparatie extracted van de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma bij een concentratie van 1 x 10 ⁷ cellen / ml (zie tabel of Materials).
2. Plaats de verdovende ontvanger van de vrouwelijke syngeneuze muis ventrale zijde omhoog en onderhoud onder continue sedatie door 2% isofluraan via een verdovingsmasker toe te dienen.
3. Steriliseer de juiste 4e borstklier injectieplaats met behulp van aerosolized 70% ethanol en aanbrengen van Poly (vinylpyrrolidon) -Iodine met een steriele katoenwabber.
4. Spuit 100 μL (1 x 10 ⁶ levende cellen uit bevroren primaire tumorsuspensies) in de rechterkant van de 4e dikke klier van de 6 tot 10 week oude vrouwelijke FVB / n muis met een 29 G 0,3 ml insulinspuit.

3. Chirurgische Resectie van Orthotopische Mammary Tumor

1. 38-60 dagen na de injectie van de tumorcel, euthaniseren muizen die geen orthotopische tumorvolumes vertonen, variërend tussen 172 en 450 mm ³ in volume [lengte x (breedte ² ) / 2] (ongeveer 75% geïnjecteerde muizen).
2. Plaats verdoofde muizen die de juiste tumorgrootte ventrale zijde laten zien onder continue sedatie door 2% isofluraan via een verdovingsmasker toe te dienen en bevestig dat de muis goed verdoofd is met een afwezig voetreflexreflex. Breng de vetsalf aan de ogen aan om droogte te voorkomen tijdens de sedatie.
3. Spuit 70% ethanol om het chirurgische gebied rond de primaire tumor te steriliseren, en voeg dan Poly (vinylpyrrolidon) -Iodine toe met een steriele katoenwabber.
   OPMERKING: Haarverwijdering op de chirurgische plaats leidde tot huiduitkalkingen en / of infecties bij ~ 5% muizen en werd derhalve uitgesloten van deze stap (gegevens niet getoond).
4. Zoals getoond in Figuur 1C , maak een eerste huidinsnijding met behulp van stompe schaar mediale-caudale aan de tumor.
5. Vervolgens maak je een superieure excisie van de huid ( Figuur 1C ) mediaal aan de tumor. Let op de noodzaak om vasculature feHet opbrengen van de tumor die op de huid ligt voordat u de incisie uitstrekt.
6. Ga de huidinsnijding lateraal (achter de tumor) door, en maak dan een superieure huiduitsnijding (lateraal naar tumor) en mediale excisie (superieur aan tumor) ( Figuur 1C ).
7. Nadat de huid omtrekt rond de tumor is gesneden ( Figuur 1C ), lig de overliggende huid aan de tumor vast aan de hand van de tang, terwijl de tumor onduidelijk wordt verwijderd van de buikwandmuskulatuur en de membraan intact blijft.
8. Identificeren (door stompe dissectie) en dichtschroeien grote vaten die door de ^4de en ^5de borstklieren.
9. Accijns ongeveer de helft van de ^4de en ^5de borstklieren aan de cauterisatie site om de tumor te bevrijden bovenliggende huid, en segmenten van de melkklieren (figuur 1C).
10. In geval van bloedingen, identificeer actief bloedenSchepen en onmiddellijk cauterize ze. Als meer dan 250 μL bloed verloren gaat, sluit de muis de studie uit en verwijder hem.
11. Sluit excisiesites met wondklemmen met behulp van een wondclip applicator ( Figuur 1C ).
    OPMERKING: Verwijder de wondklemmen 10 dagen na de operatie met een wondklemverwijderaar.
12. Geef warm steriele zoutoplossing subcutaan (4% van het lichaamsgewicht van het dier) en houd het dier warm met een warmtelamp. Controleer de dieren elke 5-10 minuten tijdens herstel van verdoving.
    OPMERKING: Toediening van bupivacaïne of lidocaïne verhoogde postoperatieve sterfte (data niet getoond). Muizen die tekenen van pijn toonden (hunching, onwillig om te verhuizen, niet-bruidegom) 1 uur na de operatie werden geëuthaniseerd.
    1. Zodra de muis volledig is hersteld, geef het terug naar het bedrijf van andere muizen.

4. Isolatie en verwerking van bloed en long voor flowcytometrie en histologie

1. Berei bij de eindpunten van de muizen muizen op voor verschillende histopathologische evaluaties indien gewenst. 90 minuten voor euthanasie geven elke muis een intraperitoneale injectie van bromodeoxyuridine (BrdU, 50 μg / g muisgewicht) bij een concentratie van 6,25 μg / μL in 1x PBS.
   OPMERKING: Bevroren voorraden opgeloste bromodeoxyuridine worden binnen 1 maand na de bereiding gebruikt.
2. 10 minuten voor euthanasie, met de muis verdoofd, verzamelen retroorbital bloed (> 500 μL) met behulp van gehardiniseerde capillaire buizen, en vervolgens overbrengen naar buizen die bedekt zijn met dicalium EDTA op ijs.
3. Longen en resterende borstweefsel te verwijderen, maak een middellijn incisie met een schaar van de onderbuik de mond naar de borst- en peritoneale holten (figuur 2A) bloot te leggen, en schil de huid lateraal ook bloot overblijvende juiste ^4e en ^5e mammaire klieren.
4. Accijns de resterende borstkankerweefsel en controleer ikT het terugdringen van de primaire tumor herwinnen door middel van seriaal gescheiden formalin-vast paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel door hematoxyline en eosin (H & E) kleuring te beoordelen ( aanvullend figuur 1 ).
5. Om de longen te verwijderen, open de buikwand naar het diafragma met een schaar en verwijder het dier dan door de buikorta te snijden om bloed uit te spoelen voor de perfusie van de longen ( Figuur 2B -2C ).
6. Knip het diafragma langs de ribbekap uit een buikbenadering, zodat u de long en het hart vermijdt. Ontsteek dan de thorax door de laterale zijden van de ribbeek te snijden ( Figuur 2D ).
7. Met een 23-gauge naald op een 20 ml spuit, perfuse longen met ~ 5,0 mL DPBS (~ 10 mL / min) door de rechter hart van de hart tot de longen helemaal wit worden ( Figuur 2E -2F ). Snijd het hart onmiddellijk van het hoofdvlees afZo wordt bloed niet opnieuw in de long geperfuseerd.
8. Voor het vaststellen en verwerken van longweefsel voor histopathologische beoordelingen, injecteer ~ 1,0 ml 10% formaline bij 4 ° C in de blootgestelde trachea-schuine zijde naar de longen met behulp van een 23-gauge naald ( Figuur 2G - 2H ). Stop de injectie zodra de longen volledig zijn uitgebreid en gevuld met fixatief ( Figuur 2I ).
9. Accijns lung lobbe uit luchtpijp, en emersie fix longweefsel in neutraal gebufferde formaline voor daaropvolgende paraffine inbedding of OCT-bevriezing medium, per standaard histopathologische procedures.
10. Kwantitatief evalueren de metastatische last in de longen door middel van seriële sectie van FFPE longweefsel en evalueren microtome secties (100 μm, dertien secties), door H & E-kleuring ( Figuur 1B ).

Resultaten

Meer dan 75% van de ontvangende muizen die 1 x 10 ⁶ cellen van primaire borsttumoren van MMTV-afgeleid PymT muizen ontwikkelen interne mammaire adenocarcinoom variërend in grootte 172-450 ^mm3 binnen 38-60 dagen (gegevens niet getoond). Muizen die in aanmerking komen voor randomisatie worden dan ingevoerd in studiegroepen na chirurgische resectie van primaire tumoren zoals getoond ( Figuur 1C ). Primaire tumor hergroei werd geïdentificee...

Discussie

Wijzigingen en probleemoplossing:

Wanneer de tumor uit de buikwand los komt, kan de tumor aan de buikwand vasthouden. Dit werd waargenomen bij <5% muizen geïnjecteerd met tumor (gegevens niet getoond). Voor muizen met tumoren die aan de buikwand hechten, moet de muis worden geëuthaniseerd, omdat resectie moeilijk is zonder primaire tumor hergroei.

Beperkingen van model / techniek:

Terwijl andere on...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isofluoraan	Piramal Healthcare	N/A	Voorschriftbevel
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex-fles	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetaal bovien serum	Atlanta Bio	S11150
0,7 µm nylon zeef	Corning	352350
50 mL kegelbuis	VWR	89039-658
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Groeifactor-verminderde Matrigel	BD	354230	Groeifactor-verminderde gesolubiliseerde basaalmembraanvoorbereiding geëxtraheerd uit de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muissarcoom
Poly(vinylpyrrolidon)-joodcomplex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0,3 mL insulinespuit	BD	324702
Klein vaatcauterisatieset	FST	18000-00
Wondclips	Texas Scientific	205016
AutoClip wondclipapplicateur	BD	427630
AutoClip wondclipverwijderaar	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Geheparineerde capillaire buisjes	Fisher	22362566
Microtainerbuisjes met dikalium EDTA	BD	365974
20 mL spuit	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-bevriezingsmedium	VWR	25608930
Formaline, gebufferd, 10% (fosfaatbuffer)	Fisher	SF100-4
23g naald	Fisher	14-826-6B
FVB/n-muis	Jackson Laboratories	001800