Gewijzigd MicroSecure Vitrificatie: Een veilige, eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatie Procedure for Human Blastocysten

Summary

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Abstract

Klinische embryo verglazing geëvolueerd met de ontwikkeling van unieke verglazing apparaten in de 21 ^ste eeuw en met de misvatting dat ultra-snelle koeling in een 'open' systeem (dat wil zeggen, direct LN ₂ contact) was een noodzaak om vitrificatie succes te optimaliseren. Het dogma rond het belang van het koelen van de tarieven leidde tot onveilige praktijken onderworpen aan technische variatie en tot de oprichting van verglazing apparaten die belangrijke kwaliteitscontrole factoren (bijvoorbeeld, gebruiksgemak, herhaalbaarheid, betrouwbaarheid, veiligheid etikettering en opslag veiligheid) buiten beschouwing gelaten. Inzicht in de kwaliteitscontrole gebreken van andere apparatuur toegestaan ​​voor de ontwikkeling van een veilig, veilige, herhaalbare en betrouwbare mS-VTF methode gericht op intra- en inter-technicus variatie te minimaliseren. Net zo belangrijk is, combineerde de beschikbaarheid van twee bestaande FDA-compatibele apparaten: 1) een 0,3-mL ionomere hars embryo stro met geïnternaliseerde, dual-gekleurd, tamper-pdak labeling met herhaalbare las zegel potentieel; en 2) verkort, veelgebruikte, 300-um ID steriele flexipettes direct het embryo (en) te laden om een ​​zeer effectieve globale verglazing apparaat. Net als andere aseptische, gesloten verglazing systemen (bijvoorbeeld High Security Vitrificatie (HSV), Rapid-i, en VitriSafe) effectief gebruikt in de reproductieve geneeskunde, microSecure Vitrificatie (mS-VTF) heeft bewezen dat het een hoge post-warming overleven en zwangerschap kunnen bereiken uitkomsten met zijn aandacht voor eenvoud, en minder technische variant. Hoewel de 0,3 ml embryo stro met een intern hydrofoob plug commercieel werd vervangen door een standaard sperma rietje bezit katoen polyvinylpyrrolidon (PVP) stekkers, handhaafde de ionomere hars samenstelling te lassen sluiting te waarborgen. Echter, de katoen stekkers lont uit de vloeistof-embryo inhoud van de flexipettes bij contact. Een gemodificeerd pS-VTF methode werd aangepast om een ​​extra interne las omvattendichten alvorens de stekker van het apparaat laden kant. De toegevoegde technische stap naar de microsiemens-VTF procedure heeft geen invloed op haar succesvolle toepassing, zo hoog overlevingskansen (> 95%) en zwangerschap tarieven blijven vandaag.

Introduction

Vitrificatie is de meest invloedrijke geassisteerde reproductieve technologie in de in vitro fertilisatie (IVF) industrie sinds de ontwikkeling van intracytoplasmatische sperma-injectie. Vandaag de dag, blastocysten zijn gecryopreserveerd zonder verlies in levensvatbaarheid van het embryo eerder in verband met conventionele langzaam invriezen methoden ^1. Met betrouwbare post-warming embryo te overleven, is de onvruchtbaarheid industrie transformeren in de gewenste gebruik van gecryopreserveerde embryo transfer cycli, die vergelijkbaar of hoger zwangerschapsuitkomsten dan de traditionele verse embryo transfer opleveren. In samenwerking met blastocyst biopsie en pre-implantatie genetische screening (PGS), is verglazing uitgegroeid tot een belangrijk klinisch hulpmiddel om gezonde live-geboorte resultaten te optimaliseren via euploid single embryo transfer ^{2, 3.}

Muizen-embryo verglazing werd ontwikkeld in het midden van de jaren 1980 ^{4, 5} en aangepast aan de veeteelt in 1990 ^6. Gebaseerd op de vooronderstelling dat oplossingen voor vitrificatie vormen een metastabiele toestand glasseous, zonder beschadiging ijs- kristalvorming, heeft bewezen de totale cellulaire integriteit van embryo efficiënter behouden. Interessant, heeft de veelbelovende acceptatie van vitrificatie in de menselijke embryologie niet beginnen te realiseren tot de 21 ^ste eeuw. Vroege publicaties bevorderen van verglazing samenviel met de ontwikkeling van unieke "open" systeemapparaten ^{7, 8, 9.} Echter, de goedkeuring van vitrificatie in de klinische praktijk was traag, zoals het kwam op een moment dat verbeteringen in slow blastocyst invriezen werden ook optreedt. Succesvolle conventionele langzame snelheid invriezen, naast verglazing, in lijn gebracht met verbeteringen in kweeksystemen embryo, en met de incorporation van blastocoel-instortende benaderingen, die zowel de totale overleving van trophectoderm verbeterd en vervolgens ¹⁰ implantatie.

In het laatste decennium, heeft verglazing technologie snel verdrongen conventionele bevriezing praktijken. Grotendeels, dit te wijten aan de ontwikkeling van gespecialiseerde inrichtingen verglazing. Sommige van deze apparaten zijn de algemene veiligheid, efficiëntie en effectiviteit van de klinische verglazing gehandicapt door het introduceren inherent ontwerpfouten naar apparaten die worden gebruikt in de IVF-industrie ^11. Inderdaad, de nuances van verschillende voorzieningen teneinde aanzienlijke technische verschillen tussen programma's, meestal aangeduid als "technische handtekeningen" ^12. Zo, wetenschappelijke tijdschriften, zoals het Journal of Gevisualiseerde Experiments (JoVE), kan dienen als een waardevolle bron voor het aantonen van de technische details, die zal bijdragen tot het resultaat variatie te verminderen. Een ander permanent probleem is dat some embryologen blijven worden geïnformeerd, zelfs vandaag de dag, op basis van beweringen dat de "ultra-snelle afkoeling van embryo's of eicellen in een 'open verglazing system' (dat wil zeggen, direct embryo contact met vloeibare stikstof (LN ₂₎₎ is een voorwaarde voor het optimaliseren slagingspercentages. " Duidelijk dat deze overtuiging onjuist is, gebaseerd op het bewezen succes van aseptische gesloten systemen ^{13, 14, 15.}

Gebaseerd op de principes van cryobiological verglazing, de effectiviteit van vitrificatie is sterk afhankelijk opwarmsnelheden dan bij een koelsnelheid van ^{16, 17, 18.} In het algemeen, onafhankelijk van de verglazing apparaat gebruikt, de snelheid van opwarmen moet de afkoelsnelheid overschrijden hoge overleving te verzekeren. Hoge opwarming zoveel mogelijk te beperken de mogelijkheid voor elke ijs groei (dwz de Recrystallization van kernen onzuiverheden in cryo-oplossingen) tijdens de ontglazing fase van de opwarming van de aarde. Toegegeven, kan de stabiliteit van de oplossing voor vitrificatie (dat wil zeggen de soort en concentratie van cryoprotectieve middelen toegepast) een verstorend effect, maar dit is in een afzonderlijk ¹¹ publicatie. Gezien de cooling-warming rate issues, MicroSecure Vitrificatie (mS-VTF) is ontwikkeld in 2008 als een goedkope, niet-commerciële, FDA-compliant methode die het kwaliteitssysteem aspecten van vitrificatie geoptimaliseerd. Het was uniek in dat het aangeboden tamper-proof, geïnternaliseerd, dual-gekleurde labeling. Verder kan door het laden en opslaan van de embryo's direct in het steriele flexipette voor pipetteren (dus zonder pipetteren een secundaire inrichtingoppervlak) en met ionomere hars rietjes die volledig las afdichting een geautomatiseerd sealer, technische variatie is effectief geëlimineerd.

Bij de beoordeling van de completeness van verglazing apparaten voor potentieel gebruik, zijn er verschillende kwaliteitscontrole factoren waarmee rekening moet worden gehouden, waaronder: 1) Het labelen van potentiële -Kan labels goed worden nageleefd? Zijn ze Tamperproof? Bieden ze dual-color identificatie potentieel? Is het een secundaire etiket vereist, en kan het etiket eenvoudig worden verwijderd voor administratieve doeleinden (dat wil zeggen, de patiënt verificatie) post-warming? 2) Technische gemak -Kan embryo's gemakkelijk worden geladen in / op het apparaat in een tijdig en eenvoudig geïdentificeerd en opgespoord post-warming? 3) Procedurele eenvoud / herhaalbaarheid -Heeft de verglazing methode aanbod eenvoud en betrouwbaarheid die gemakkelijk maakt voor de herhaalbaarheid, die de variatie tussen de technici (intern) en programma's (extern) minimaliseert? 4) LN ₂ opslagcapaciteit eenvoudig en veilig -Kan de apparaten worden behandeld en geïdentificeerd? Is hun stowoeden potentiële ruimte efficiënt? Heeft het apparaat bieden veiligheid en zekerheid van fysieke schade of eventuele verontreinigingen als een aseptische gesloten systeem? 5) Herstel potentieel / Overlevingsvermogen -Is het apparaat ontwerp gevoelig zijn voor mogelijke problemen in de gegarandeerde herstel van de embryo's, en zullen ze betrouwbaar verglazen en onderhouden volledige cellulaire integriteit post-warming? De laatste specifieke kwaliteit van zorg, de recovery rate, daadwerkelijk is verrassend geminimaliseerd gepubliceerde rapporten; Dit wordt gedaan door het algemeen het verbergen van de ongunstige uitkomst (dwz verloren embryo of ei) in typisch goede overlevingskansen. Elk apparaat vatbaar voor inconsistent herstel (<99%) is ernstig gebrekkig en vormt een procedurele verplichting.

Onze aseptische, gesloten mS-VTF methode is strategisch ontwikkeld om rekening te houden voor elke kwaliteitscontrole maatregel. Echter, na 5 jaar van het klinisch succes en validatie ¹⁴ De procedure had to worden gewijzigd. De originele 0,3-mL embryo rietjes (het bezit van een hydrofobe plug) werden uit de IVF-industrie verwijderd en vervangen door een 0.3-mL sperma stro het bezit van een standaard katoen / PVP plug (dwz opnieuw gelabeld als een sperma / embryo stro). Deze procedurele document schetst de specifieke stappen en strategieën die nodig zijn om veilig, eenvoudig en effectief te implementeren mS-VTF. Verder hebben we aandacht voor de modificatie (s) die nodig is om op betrouwbare wijze rekening te houden met het aanbod beperkingen, totdat een alternatief ideale stro container terug in het klinisch laboratorium opnieuw ingevoerd.

Protocol

De ontwikkeling van de uS-VTF procedure werd uitgevoerd als onderdeel van een goedgekeurde Institutional Review Board (IRB) studie in 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) op de menselijke eicellen en embryo cryopreservatie. De procedure is inmiddels routinematig toegepast op de klinische behandeling van onvruchtbaarheid patiënten die informed consent formulieren hebben ondertekend.

1. Kwaliteit-control Overwegingen

1. Gebruik verschillende kleuren (bijvoorbeeld, pennen, labels, of identificatie (ID) staven of pluggen) om patiënten te onderscheiden of cryopreserveren meer dan één groep van embryo's in een dag.
2. Gebruik verschillende gerechten en pipetten voor elke patiënt. Minimaliseer het volume van het medium overgedragen bij het verplaatsen van de blastocysten van de ene oplossing naar de andere.
3. Cryopreserve één blastocyst per rietje of apparaat. Handhaaf aseptische / steriele techniek en voldoen aan alle veiligheidsvoorschriften.
4. Bevestig de Physicians 'Referral Form en toestemming patiënt ondertekend voor initiating van de procedures. Controleer de plaatsing van de embryo (s) van de patiënten in de inventaris.
5. Gebruik een "release van aansprakelijkheid en Toestemming voor het vervoer" als de blastocysten zullen worden overgedragen aan een andere faciliteit. Zorg ervoor dat alle handtekeningen onsite of notariële worden gezien.
6. Bevestig een goede kwaliteitscontrole maatregelen voor de middellange en de eiwitsupplementen, in voorkomend geval, met inbegrip van bioassays, endotoxine bepalingen, en de vervaldatum / lotnummer verificatie en tracking.
7. Vaststellen van kritische grenswaarden (dat wil zeggen, een laag niveau van zorg) voor de klinische cryopreservatie outcome monitoring en evaluatie, zoals gegevens over de opbrengst: <95%, overlevingscijfers: <80%, en klinische zwangerschap tarieven met behulp van single-euploid blastocysten: <50%.

2. Cryopreservatie Procedure

1. Voorbereiding
   1. Vullen de juiste papieren, met inbegrip van het invoeren van gegevens in de werkbladen en de cryopreservatie database en inventaris log(S).
   2. Bereid verse cryopreservatie oplossingen of gebruik maken van een commerciële bron (het naleven van de aanbevolen opslag- en houdbaarheid voorwaarden van de fabrikant).
   3. voorbereiding stro.
      1. Open de etikettering van het geïndividualiseerde steriele pakketten. Maak de vulpistool vinden op de traditionele 0.3-mL embryo stro door vast te pakken tegen de verpakking en gedeeltelijk te tillen en naar buiten te trekken het stro; dit zal het label einde aan de omgevingsomstandigheden bloot te leggen, terwijl het stro rust aseptisch in de plastic verpakking.
         1. (Modificatie) voor 0,3 ml sperma / embryo rietjes, duw de stekker omlaag van 0,5 cm. Breng een binnenpakking voor katoen-PVP voorzichtig door gebruik van een basisch tafelblad impuls sealer.
         2. Stel de druppel op het Teflon oppervlak van de elektrode, tegenover de plug. Druk de hendel om de warmte te activeren. Laat de hendel wanneer het rode licht verschijnt. Om een ​​volledige afdichting lassen, warmte op een temperatuur die voldoende flatte waarborgenns de tegenover elkaar gelegen oppervlakken, draai het dan over 180 ° en sluit het tegenoverliggende oppervlak ¹⁹ als dat nodig is.
   4. Met behulp van een cryomarker, labelen elk stro / apparaat en cryogoblet met de patiënt naam, een uniek ID-nummer (bv, SSN, DOB, of de patiënt ID-nummer) en de datum van invriezen. Ook een uniek nummer voor elk rietje / mechanisme (bijvoorbeeld 1, 2, 3, enz.).
      1. Bevestig de label (bij voorkeur gekleurd) op een kleur-gewogen ID stang te worden ingebracht en verzegeld in een 0,3 ml embryo stro. Terug het stro om de individuele steriele verpakking tot gebruik.
         Opmerking: Als slechts 30-mm-color gewogen ID staven zijn, kunnen de extra insertie van twee kogellagers nodig, grenzend aan elke zijde van de stang ID.
   5. Identificeer elk riet met een unieke Inscribed ID-nummer. Identificeer een LN ₂ opslagtank nummer en een bus nummer waar de specimen (s) van elke patiënt kunnen zijn stORed op lange termijn.
   6. Bereid verse cryo gerechten (100 mm) door het merken van het bodemoppervlak met de naam van de patiënt, solution ID en embryo / houden druppel ID (Figuur 1A). In het bijzonder, het opzetten van 4 rijen van druppels: isotone HEPES-gebufferd medium (boven), V1 (equilibratie-oplossing (ES)), V2 (tussenoplossing (IS)), V3 (vitrificatie-oplossing (VS); onderaan). Schrijf het embryo-ID op de rechtsboven met gelabelde kolommen.
      Opmerking: Een reeks van 25- tot 50-pl wassen druppeltjes (n = 3) wordt gebruikt om te garanderen dat elk individu laatste 10 tot 15 pl met druppel / oplossing type (bijv V1, V2 of V3) is zuiver en onverdund. Met deze benadering tot vijf individuele embryo's met verglaasd met één schotel. Houd elk gerecht bedekt wanneer niet in gebruik om het even welke kamertemperatuur verdamping / uitdroging van de druppels te voorkomen.
   7. Bereid steriele flexipettes door snijden 3 cm van hun basiseinde (aangeduid als "VTF tips"). Plaats ze op individuelepipetten (vastgesteld op 3 pi) en stel de pipet-VTF tips rechtop in een piepschuim buis rek (Figuur 1B).
2. embryo Selection
   1. Bevestig patiënt / specimen identificatie.
   2. Onder toepassing van een omgekeerde microscoop (200 - 400 x vergroting), rang en classificeren blastocysten volgens de Gardner beoordelingssysteem ^20, met een numerieke classificatie van 1 tot 6 voor vroeg uitgekomen blastocysten, respectievelijk, en een A, B of C klasse toegekend aan de binnenste celmassa (ICM) en trophectoderm (tE).
      Opmerking: Als voorbereiding op blastocyst biopsie en euploidy analyse de zona pellucida vooraf uitbroeden laserablatie op dag 3 aan het begin van de hernia TE bevorderen en vereist dus een aangepaste indeling indeling ^2. In het kort, Grade 3 volle blastocysten exposeren tot 10% TE discushernia, Grade 4 uitgebreid blastocysten zijn 10-50% uitgekomen, en Grade 5 uitbroeden blastocysten hebben> 50% TE extrusion (Figuur 2A-C).
      Let op: Onze voorkeur gaat uit naar cryopreserve graad 3 of hoger blastocysten van ≥BB kwaliteit op dag 5 of 6. Echter, verglaasd blastocysten van mindere kwaliteit (C) en post-verdichting embryo's in eerdere stadia (inclusief de late morula tot graad 1 of 2 blastocysten ) kan zeker overleven opwarming volledig intact en de opbrengst levensvatbare embryo's kunnen bereiken levendgeborenen.
   3. Samenvouwen blastocoel van iedere blastocyst voorafgaand aan het begin van de cryodilution proces micropuncturing een trophectoderm kruising of door het uitvoeren van een laserpuls ablatie van een trophectodermal cel ²¹ bij gebruik van lage-molariteit oplossingen voor vitrificatie (<6,5 M of 40% v / v).
      Opmerking: De noodzaak om de blastocysten instorten apparaat niet afhankelijk. In onze eigen vroege ontwikkeling van pS-VTF (2008), we in eerste instantie gebruikt ethyleen glycol (EG) / DMSO-oplossingen met succes met eicellen (1 op 1 voldragen zwangerschap), maar een sub-optimale (<80%)survival / ontwikkeling van de muis blastocysten ¹⁶ werd ervaren door anderen ^21. Aangezien hoge mol-glycerol gebaseerde oplossingen (meer dan 7,9 M) worden gebruikt in onze huidige VTF systeem (sinds 2009), fysieke blastocoel instorting is niet nodig. De selectieve uitkomen uitgekomen blastocysten raadzaam algemeen.
3. Cryodilution en Blastocyst Loading
   1. Verwijder de patiënt cultuur schotel uit de incubator en bevestig de patiënt / specimen identificatie met een andere persoon (dat wil zeggen, getuige door een secundaire bron) voordat u de embryo (s) te worden verglaasd.
   2. Bevestig blastocyst ontwikkeling per stap 2.2.2, het actualiseren van de cryo data sheet, en, onder stereomicroscopie, pipet blastocyst (s) van de cultuur schotel in een isotone Holding druppel van de cryo gerecht.
   3. Beweeg elke blastocyst in individuele deelneming druppeltjes met de verglazing flexipette (dat wil zeggen, de VTF tip).
   4. Beweeg elkeblastocyst in V1 (ES) oplossing.
      1. Prefill de flexipette V1 oplossing (3 uL) en plaats de helft van de inhoud op het embryo.
      2. Zuig het embryo en te verplaatsen naar de eerste van drie V1 wash druppeltjes (in stap 2.1.6 genoemd), pipet de embryo 2-3 maal rond de omtrek en de inhoud pipet duidelijk in de druppel (het vermijden van de vorming van luchtbellen) of buiten op het schaaloppervlak.
   5. Vul het VTF tip met de volgende V1 wasbeurt druppel en herhaal het streven van de embryo (s). Herhaal dit voor de derde keer en verplaats de blastocyst (s) aan een individu V1 Holding druppel. De verwatering / wasstappen moet nemen 30 tot 45 s. Pre-load elk VTF tip met de volgende oplossing (bijvoorbeeld V2), plaatst u de pipet in een rek, en gebruik de volgende pipet (volgens de setup in stap 2.1.7) (Figuur 1B).
      Let op: Omdat het totale belichtingstijd in niet-dimethylsulfoxide (DMSO) met V1 en V2-oplossingen is 5 minuten elk, het pipetteren van inddual blastocysten wordt gelijkmatig gespreid binnen dat interval, gezien het feit dat de laatste V3 stap ten minste 1 min per blastocyst zal nodig hebben om uit te voeren. Bijvoorbeeld als er 4 blastocysten in een verglazing groep pipet blastocysten # 1-2-3-4 op 75-s intervallen.
      Opmerking: De Innovative Cryo Enterprises (ICE) verdunning protocol hierboven beschreven is duidelijk anders dan de meeste andere commerciële vitrificatie procedures, die over het algemeen-DMSO bevattende oplossingen te betrekken. Die protocollen te bereiken dezelfde stapsgewijs verdunningen door middel van een geleidelijke, maar minder gecontroleerd, het samenvoegen van wasoplossing (dat wil zeggen, isotone medium), ES, en de VS.
   6. Herhaal stap 2.3.4 en 2.3.5 met behulp van V2 (IS) oplossingen.
   7. Herhaal stap 2.3.4 en 2.3.5 met behulp van V3 (VS) oplossingen.
   8. Bij het plaatsen van elk blastocyst in de V3 houden druppel, duidelijk de resterende oplossing en bellen uit de VTF tip (buiten de druppel), en dan volledig te vullen het topje met schone V3 rond het embryo. Expel ongeveer een derde van het volume (1 ui) en pipetteer de blastocyst (s) en de resterende V3 volledig in de VTF tip.
   9. Verwijder de VTF tip van de pipet, veeg de tip van de resterende droge V3 aan de buitenkant met behulp van een steriel gaasje, en steek het uiteinde-eerst in het open einde van de pre-gelabelde stro. Een "dry tip" is van cruciaal belang voor het voorkomen van mogelijke innerlijke stro therapietrouw.
   10. Keren de stro (label eindigen naar beneden), acht de tip aan de binnenste plug of zegel, en veilig afdichten van het open einde met 1 cm van het luchtruim. Gebruik bij voorkeur een automatische afsluiting apparaat (bijv Syms I) aan de technische variatie te elimineren.
       Opmerking: Het voordeel van rietjes die bestaan uit een ionomere hars plastic (bijvoorbeeld HSV of uS-VTF) dat met behulp van een goed bediende smeltlassen apparaat een betrouwbare "las" verbinding, zoals in stap 2.1.3.1.
   11. Eenmaal afgesloten, storten de gesloten rietje direct in LN ₂ in een roestvess staal Dewar kolf en plaats het rietje (s) in de open beker gekoppeld aan riet van de patiënt voor opslag.
       Let op: Omdat mS-VTF rietjes gebruiken 40-mm gewogen ID staven om het drijfvermogen van de met lucht gevulde stro te compenseren, het gebruik van omgekeerde bekers of lege cryovials aan het monster (s) is niet vereist, tenzij het vervoer betrokken is te dekken.
4. Warming en Cryo-oplossing Elutie / Verwatering
   1. Bevestig de Physicians 'Referral Form over verglaasd embryo transfer datum, geplande tijd, en de embryo gegevens (nummer te ontdooien / overdracht, specifieke embryo nummer als PGS getest, etc.).
   2. Bereid verse warming-oplossingen (1,0 M sucrose voorraad-oplossing) en / of gebruik maken van een commerciële bron (aanbevolen 1 week 1 maand houdbaar eenmaal in gebruik is, 4 ° C opslag).
      1. Aliquot 17,1 g sucrose in 50 ml steriele kolven bij eerste opening (bijvoorbeeld wekelijks voedingsbron) wegens de risico endotoxine accumulatie in sucrose granules na herhaalde blootstelling omgevingstemperatuur.
      2. Meng vooraf gewogen korrels sucrose in oplossing (1,0 M voorraad = 3,42 g / 10 ml HEPES-gebufferde menselijke eileider fluïdum [H-HTF]) en verwarm de oplossing tot 37 ° C de oplosbaarheid van de korrels te verhogen. Herhaaldelijk keren de container om de snelheid omhoog te helpen en te voltooien de finale mixing.
         Opmerking: Filtration (0,22-um filter) uitgevoerd met behulp van positieve druk filtratie-eenheden wordt aanbevolen voor viskeuze oplossingen (> 0,5 M sucrose) of hoge volumes. Hand druk pompen zijn voldoende en goedkoop, terwijl een elektrische pomp maakt lawaai, veroorzaakt trillingen, en het is gewoon niet nodig.
   3. Warm (37 ° C) een 10 ml tube elk van 1,0 M sucrose-oplossing en H-HTF medium per patiënt pS-VTF warming bad gebruiken.
   4. Vers bereid ontdooien schotels (6-well plaat) door het merken van de oppervlaktebedekking de naam van de patiënt en de oplossing IDs.
      Opmerking: In dit geval hebben we gebruikt: (1) T1 was (200 μ; L zonder olie bekleding, (2) T1 (100 ui) met 1 ml olie, (3) T2 (100 ui) met olie, (4) T3 (100 ui) met olie, (5) T4 (100 ui) met olie, en (6) T5 / 200 ul HEPES gebufferde isotone medium met 10% humaan serum albumine (HSA) of 20% serum vervanging zonder olie overlay. Breng een universele sucrose oplossing step-down protocol-T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M en T4 = 0,125 M-als de ICE of een andere commerciële bron niet beschikbaar is, zoals voorgesteld voor slow-ingevroren embryo's ²² . Bovendien op dat de initiële T1 wassen en de uiteindelijke T5 vereveningen kan worden uitgevoerd in 30 mm petrischalen en 4-putjes gebruikt voor stappen 2-5 hierboven, waarbij een olie overlay.
   5. Ontdooien embryo (s) in één patiënt tegelijk.
      1. Controleer de Physicians 'Referral Form en bevestig de cyclus voor het verwarmen van het aangegeven aantal (dat wil zeggen, 1 of 2 blastocysten); evalueren survival / vermoedelijke levensvatbaarheid door het observeren van osmotische veranderingen (dat wil zeggen, shrinkage en rehydratatie), en waarvan de vliezen, en zo twijfelachtig, contact opnemen met de arts en / of de patiënt vóór het opwarmen andere blastocyst.
   6. Bevestig patiënt / specimen identificatie met een collega (dat wil zeggen, getuige door een secundaire bron).
   7. Plaats de patiënt riet in een dewarvat gevuld met LN ₂ en isoleren identificeren stro op te warmen.
   8. Breng de 6-well verdunning schotel naar het midden van de stereomicroscoop fase. Het plaatsen van een 60-mm petrischaal aan één kant (dwz, afhankelijk van de linker of rechter voorkeur van de technicus), voeg de verwarmde sucrose (1,0 M) en H-HTF oplossingen een 0,5 M sucrose verwarmen creëren bad (onbedekt).
      Opmerking: VTF tips zijn alleen verwarmd in 0,5 M sucrose-oplossingen als een QC bescherming, het behoud van embryo levensvatbaarheid te verzekeren in het zeldzame geval dat een embryo wordt uitgestoten bij snelle opwarming ^22.
   9. Houdt het rietje afdichting boven vloeistofniveauom de identiteit te bevestigen, en dan te begrijpen en zet het stro onder de interne plug met behulp van Mayo schaar (de VTF tip moet nog steeds worden ondergedompeld in LN _2).
      1. tikt u stevig de schaar op de Dewar kolf (een paar keer) aan de VTF tip uit de binnenste stro zijwand als een QC voorzorg te verwijderen; als de VTF tip is aanhangend, het tikken zorgt ervoor dat de tip basis daalt tot de verzegelde einde tegenover de gelabelde einde, waardoor een luchtruimte in de buurt van de stekker einde.
   10. Til het rietje met een schaar in omgevingslucht horizontaal (naast of onder de stereoscoop oppervlak) en grijpen de niet-gelabelde uiteinde (label aan de rechterkant). Snijd het stro op de binnenste plug of af te dichten en te tillen boven de opwarming bad gerecht. Giet de VTF tip in het warme bad sucrose in een hoek van 60 ° tot het volledig geëxtrudeerd en snel is opgewarmd (> 6.000 ° C / min); de basis van de flexipette rusten boven de schotel zijwand.
       1. Laat de VTF tip om vrije val in het bad. Tik voorzichtig de bovenste stro oppervlakte als het topje niet meteen naar voren. Als het alleen maar lijkt gedeeltelijk, te helpen bij de extrusie door grijpen de schacht van de flexipette met de schaar of fijne tang.
   11. Na 5-10 s, pakt u de pipet basis en in te voegen in een wegwerp pipetteren inrichting; een gat in de lamp werkt om de druk bij het inbrengen. Bedek de lamp gat met een wijsvinger en knijp de lamp aan het verglaasde blastocyst in de T1 wasbeurt los (# 1) tijdens het bekijken van stereomicroscopie. Eenmaal bevestigd, schakelt de resterende oplossing V3 (VS) en bellen door positieve druk, het evacueren van de inhoud in het centrum, ongebruikte verwerp ook. Start een 5-minuten timer.
       Opmerking: Alle sucrose verdunning stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (21 ± 2 ºC).
   12. Verwijder VTF tip en plaats het op een pipet. Ga verder door het verplaatsen van de embryo in T1 # 2 onder de olie voor de resterende tijd (ongeveer 3-4 minuten).
       1. Als er een tweede blastocyst is vereist voor overdracht, onmiddellijk warm een ​​tweede stro en VTF tip (herhalen van de stappen 2.4.9 - 2.4.11) van de patiënt voor het begin van stap 2.4.12. Zet beide blastocysten samen minste elutie in T1 (1,0 M sucrose) van ten minste 3 min.
   13. Pre-vul de flexipette met de volgende oplossing, en dan bewegen en verdun de blastocyst (s) in T2, T3 en T4 3-min intervallen. Als de zona pellucida niet eerder laser ablatie (dat wil zeggen, gearceerd), doe dat dan in T4. Zet de schaal op het podium van een omgekeerde microscoop maakt van het embryo op een computerscherm. Lijn de zona binnen een aangewezen rode cirkel en activeren 2 of 3 impulsen van een diodelaser (vanaf de rand van de perivitelline ruimte naar de buitenrand) een opening ^{2, 19} maken.
   14. Equilibreren de blastocysten in T5 (dwz isotoon medium) gedurende 5 min op een warm oppervlak (37 ° C).
   15. Beoordeel de eerste embryo te overleven op basis van de overheersende aanwezigheid van intacte celmembranen met nog, doorschijnend cytoplasma zonder pyknotische verduistering. Plaats de embryo (s) in de cultuur voor 2-6 uur voor embryotransplantatie, op welk moment, de ontwikkeling van het embryo / survival moet opnieuw worden geëvalueerd en gedocumenteerd.
       Opmerking: Als er meer dan 1 levensvatbaar blastocyst bestaat op het moment van overdracht en de patiënt kiest om door te gaan met slechts 1 blastocyst, de aanvullende blastocyst kan dan met succes opnieuw verglaasd (rVTF) door het herhalen van stappen 2.3.3 - 2.3.11. We hebben verschillende bevestigd levendgeborenen na enkele rVTF evenementen.
       Opmerking: rVTF is experimenteel uitgevoerd tot 5 keer zonder een significant effect op de overleving / levensvatbaarheid van aneuploidy menselijke blastocysten verglaasd in een metastabiele-glycerol gebaseerde oplossing.

Results

1341 verglaasd blastocysten werden opgewarmd tussen 2012 tot juni 2014, en 1341 embryo's gewonnen (100%), terwijl 1316 overleefde (98,1%). Biopsie blastocysten ervaren meer dan 99,5% overleving. Bij het overbrengen van voornamelijk single, genetisch getest, euploid, verglaasd embryo's, waren we in staat om een aantal van de hoogste implantatie tarieven en live geboortecijfers in de Verenigde Staten, onafhankelijk van de leeftijd te bereiken (figuur 3) ^20, volgens recente nationale statistieken door het Centrum gemeld for Disease control en de Society for Assisted Reproductive Technologies (tabellen 1 en 2). Het evalueren van een goede prognose patiëntenpopulatie (minder dan 35 jaar oud) voor gecryopreserveerd cycli alleen (tabel 1), ons laboratorium beter gepresteerd dan het nationale gemiddelde voor zowel implantatie tarieven (dat wil zeggen, de efficiëntie van een embryo om een zwangerschap te vestigen) en uiteindelijk leven geboortecijfers met meer dan 30%. Daarnaast is de initiële validatie / verificatie van onze gewijzigde opslag rietjes in mid-2014 met behulp van 70 onderzoek goedgekeurde, re-verglaasd aneuploïd blastocysten resulteerde in 100% herstel en 100% overleving.

Figuur 1. MicroSecure VTF Setup. De VTF schotel (A) wordt geassembleerd met 3 verschillende rijen oplossingen voor vitrificatie die 3 druppels wash gebruiken vóór de introductie in afzonderlijke, genummerde bedrijf druppeltjes. Bovendien afzonderlijke pipetten met verkorte VTF uiteinden (dat wil zeggen 300-um ID flexipettes) zijn bevestigd en georganiseerd piepschuim buisrek (B), die kan worden geroteerd behoren werd gebruikt. Merk op dat een vertegenwoordiger van het besteedbaar micropipet bulb pipetteren assemblage rust op de piepschuim rek. arget = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Gemodificeerde Blastocyst Grading System. Onze aangepaste Gardner blastocyst beoordelingssysteem is goed voor de geïnduceerde hernia van TE cellen blastocyst biopsie te vergemakkelijken. De modificatie beschouwt de voortijdige uitkomen van volledige blastocysten (A: Grade 3 = minder dan 10% hernia) en geëxpandeerde blastocysten (B: Grade 4 = tot 50% hernia), terwijl een broed blastocyst (C) heeft van meer dan 50% herniatie ^16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

54871fig3.jpg "/>
Figuur 3. Vergelijkende zwangerschapsuitkomsten. Over een cumulatieve 1,5 jaar verricht, werden zwangerschap data vergeleken met de effecten van de overdracht-verglaasd opgewarmd euploid blastocysten beoordelen (n = 172 cycli / 144 transfers) in vergelijking met niet-PGS cycli (n = 160 cycli / 153 transfers) met voornamelijk verse overdraagt ^18. Voor onze experimentele doeleinden, deze gegevens duidelijk blijkt dat biopsie blastocysten verglaasd door de microsiemens-VTF procedure hun levensvatbaarheid te behouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Databron	# Cycles	Bedoel # van embryo's	Implantatie tarieven (%)	Live geboortecijfers (%)
NB Lab *	144	1.2	74.00%	74.50%
Nationaal gemiddelde	20.423	1.7	39,60%	44.10%
* De gegevens werden gemiddeld op basis van de 2014 prestaties van Orange County Vruchtbaarheid, Zuid-Californië Fertility Center en de Zuid-Californië Centrum voor Reproductieve Geneeskunde clinics met de huidige Ovation Vruchtbaarheid laboratorium (NB Lab), die de microSecure vitrificatie procedure in 2008 opgericht.

Tabel 1. 2014 CDC Assisted Reproductive Statistics. Bevroren embryo transfer zwangerschap gegevens van vrouwen jonger dan 35 jaar oud uit drie rapportage arts klinieken met behulp van onze NB Lab vergelijking met de VS 2013 nationale gemiddelde van meer dan 450 rapportage klinieken.

SART nationale gemiddelden
Clinic - Staat	Vrouw	Vrouw	Vrouw	Vrouw
	<35 jr	35-37 yrs	38-40 yrs	41-42 yrs
SCCRM-CA *	63,1%	58,3%	40,6%	32,3%
CCRM-CO *	64,7%	61,5%	40,4%	32,2%
RMA-NJ *	63,2%	59,7%	34,6%	18,7%
Nationaal gemiddelde	48,6%	38,3%	24,3%	12,3%
SCCRM-Southern California Center for Reproductive Medicine; CCRM-Colorado Center for for Reproductive Medicine; en RMA-Reproductive Medicine Associates
* Deze vooraanstaande klinieken hebben alle voornamelijk uitgevoerd verglaasd embryo transfer cycli, in samenwerking met pre-implantatie genetische testen, in hun standaard praktijk van de zorg voor de patiënt om live geboorte succes per embryo getransplanteerd te optimaliseren.

Tabel 2. 2014 Cumulatieve levende geboortecijfers, zoals gerapporteerd door de Society for Assisted Reproductive Technologies (SART), voor de SCCRM Clinic met behulp van onze Ovation Vruchtbaarheid Lab in Newport Beach, CA, in contrast met een aantal andere gerespecteerde programma's, alsook met de SART nationale gemiddelden.

Discussion

Tegenwoordig is er een hoge verwachtingen van het bereiken van volledige blastocyst overleving (> 95%) en het bereiken implantatie succes vergelijkbaar met die van verse embryo. Sommige groepen hebben gesuggereerd dat de live geboortecijfers van verglaasd embryo transfer cycli zijn misschien zelfs hoger dan verse blastocysten wanneer de intacte gecryopreserveerd embryo is getransplanteerd in een gezonde, niet-hormonaal gestimuleerde baarmoeder. Onze gegevens geven duidelijk aan dat vitrificatie effectief en betrouwbaar de levensvatbaarheid van de verse embryo. Verder hebben we aangetoond dat onze aseptische, gesloten methode, genaamd MicroSecure verglazing (uS-VTF), een optimaal resultaat vergelijkbaar met of groter dan de commerciële standaarden (dwz geopend apparaatsystemen) van de IVF industrie kan bereiken.

Variant wordt geassocieerd met technische herhaalbaarheid en betrouwbaarheid tussen individuen met een veelvoud van de verglazing apparaten / methoden. Op zijn beurt heeft dit geleid tot inconsistencies tussen programma's toe te passen verglazing. Daarom is het niet verwonderlijk dat apparaat vertrouwdheid een belangrijke factor is met betrekking tot laboratorium vaardigheid en succesvolle resultaten. Het is dit concept van "technische signature" ^11, dat verklaart waarom herhaalbaarheid tussen programma's problematisch kan zijn. heeft niet alleen de ontwikkeling van meer dan een dozijn commerciële apparaten ingewikkeld dit verschijnsel, heeft het creëerde kwaliteitscontrole zorgen. Gelukkig verglazing gesloten systemen, zoals uS-VTF, Rapid-I en VitriSafe, nu blijken even effectief systemen inrichting ^{12, 13, 14} open zetten.

MicroSecure VTF is een roman, aseptische verglazing techniek ontwikkeld met technische gemak, betrouwbaarheid en cryo-veiligheid in het achterhoofd. Door het combineren van het gebruik van twee eerder goedgekeurde, FDA-compatibele apparaten, het is een niet-commercieel verglazing systeem wet de duidelijke voordeel van een gevestigde goedkope, in tegenstelling tot gespecialiseerde machines. Daarnaast zijn unieke tamperproof en geïnternaliseerd dual-gekleurde labeling-systeem, evenals tal van andere kwaliteitscontrole voordelen hebben gemaakt mS-VTF een aantrekkelijke wereldwijde optie ^11. Als een niet-commerciële VTF apparaat, echter, het wijdverbreide industrie applicatie wordt langzaam evolueert. Alleen door de voortdurende publicatie van de veiligheid, beveiliging en klinische effectiviteit zal mS-VTF gain groeiende gebruik.

In augustus 2014 wanneer geconfronteerd met het onvermogen om de oorspronkelijke 0,3 ml embryo stro vervaardigd met een inwendige, niet-absorberende hydrofobe plug verkrijgen, konden we de pS-VTF methode betrouwbaar wijzigen. In het kort werden de nieuwe 0.3-mL sperma / embryo rietjes met hun katoenen-PVP pluggen effectief aangepast. Dit was gewoon bereikt door het creëren van een binnenste afdichting voor de katoen stekker, waardoor het voorkomen van contact en vocht wicking met deopen einde VTF tip (dat wil zeggen, de flexipette met het embryo of de eieren). Bovendien, als 40-mm ID staven zijn niet toegankelijk, het drijfvermogen probleem in verband met de lichtere 30-mm staven kunnen worden contragewichten met twee kogellagers.

Deze extra maatregelen hebben de techniek iets minder eenvoudige zeer effectief gemaakt, maar toch. Vandaag de dag, de economie en de werkzaamheid worden steeds belangrijker problemen, zoals biopsie blastocysten meestal individueel worden verglaasd totdat hun euploidy status wordt bevestigd op een genetica rapport. Blastocysten met een bevestigde niet-levensvatbare aneuploidy staat meestal krijgen weggegooid, met toestemming van de patiënt, binnen enkele weken. Zo kan een meerderheid (> 50%) van de VTF apparaten worden weggegooid na korte termijn opslag, het veroorzaken van een escalerende jaarlijkse kosten bij het gebruik van commerciële apparaten. Overall, uS-VTF is een zeer effectieve, betrouwbare en reproduceerbare werkwijze voor cryopreservatie van menselijke blastocysten. De superieure kwaliteit-control design securely labels en veilig opgeslagen embryo's / eicellen terwijl het elimineren van herstel mislukking en het optimaliseren van de post-warming overleven en de levensvatbaarheid, die het gebruik van het systeem als een universele benadering van embryo verglazing rechtvaardigt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cane	IVM	XC055
Ball bearings, 3/32"	VXB.com	KIT15977	stainless steel
CBS semen/embryo straw, 0.3 mL	CryoBioSystems	25292	individual sterile
Color, ID rods, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	weighted
Culture tubes, 15 mL	Falcon	352099	Conical
Culture tubes, 10 mL	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter, 250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 μm
Flasks, Tissue Culture 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes, 300 μm ID	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Sterile, 20/pack
Forcep, Large	Miltex	6-30TC
Forcep, Splinter - fine	Miltex	17-305
Goblet	IVM	PA003
Heat Sealer, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V or 220 V with adapter
Hepes-buffered media	Life Global or	LGGH-100; 100 mL, or	stored at 2 - 8 ºC
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 mL	with non-essential AA's
Labels, Cryo	GA International	CL-23T1	Various colors
Liquid Nitrogen Tank, 40 L	MVE or Taylor Warton	various	liquid storage
LN2; Dewar flask, 0.5 L	Hampton Research	HR4-695	Stainless steel
6-well Custer Dishes	Biogenics	015/020	plasticware by case
Pipette Bulb, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Hole on bulb apex
Petri Dishes, 35 mm	Falcon	351006
Petri Dishes, 58 mm	Nunc	150288
Petri Dishes, 100 mm	Falcon	351029
Pipette Tips, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μL
Pipet Aid	Drummond or Falcon	various	rechargeable
Pipetting Device, Stripper	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipettes, Serological 1 mL	Falcon	357521
Pipettes, Serological 2 mL	Falcon	357507
Pipettes, Serological 5 mL	Falcon	357543
Pipettes, Serological 10 mL	Falcon	357551
Scissors, Surgical Mayo	Miltex	5-SC-16
Stereomicroscope	Nikon, Olympus, Leica	various
Sterile Gauze pads, 4" x 4"	Kendall Healthcare	6939
Synthetic serum	Life Global, or	LGPS-20; 20 mL, or	stored at 2 - 8 ºC
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 mL	purchase low endotoxin lot
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Aliquot into 50 mL flasks, 1 year; 17.1 g/flask + Medium to 50 mL; makes a 1 M solution; Filter with 0.22 µm unit
Timer	Nalgene	5016-001
Thawing Solution	Innovative Cryo Enterprises	BL-TS (≤1.0 M Sucrose)	T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening
Vitrification Solution*,**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (≥7.9 M [Glycerol/EG])	V1, V2, V3; stored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate
** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property.