Methodenartikel

Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers

22.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54880

⸱

31 december 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol geeft een werkwijze voor de morfologische herstel van neuronen patched tijdens elektrofysiologische opnames via biocytine vullen en immunohistochemische latere nabewerking. We laten zien dat dikke-biocytine gevuld secties die werden gekleurd en afgedekt kunnen worden restained met een tweede primair antilichaam dagen of maanden later.

Samenvatting

Elektrofysiologische registraties van cellen met behulp van de patch clamp techniek hebben geleid tot de identificatie van verschillende neuronale types gebaseerd op afvuren patronen. De opname van biocytine / neurobiotin in de registratie-elektrode maakt post-hoc terugwinning van morfologische gegevens, die benodigd zijn om dendritische arborization en het doelwit van de axonen van de neuronen opgenomen gebieden bepalen. Echter, gezien de aanwezigheid van morfologisch vergelijkbaar met verschillende neuronen neurochemische identiteit en functie, immunohistochemische kleuring voor celtype-specifieke eiwitten essentieel definitief neuronen te identificeren. Netwerkverbindingen behouden worden hersensecties voor fysiologische opnames bereid bij een dikte van 300 urn of meer. Echter, deze dikte belemmert vaak immunohistologische postprocessing te wijten aan problemen met antilichaam penetratie, noodzakelijk de resectioning van het weefsel. Resectioning plakken is een uitdagende kunst, vaak resulting in het verlies van weefsel en morfologie van de cellen waaruit elektrofysiologische gegevens zijn verkregen, waardoor de gegevens onbruikbaar. Sinds het herstel van de morfologie zou het verlies van gegevens en gids bij de selectie van neuronale markers te beperken, hebben we een strategie voor het winnen van celmorfologie eerste plaats, gevolgd door secundaire immunokleuring aangenomen. We introduceren een praktische benadering van biocytine vullen tijdens fysiologische opnames en de daaropvolgende periodieke immunokleuring voor het herstel van de morfologie, gevolgd door het beitsen van secties om de neurochemische identiteit vast te stellen. Wij rapporteren dat delen die waren gevuld met biocytine, gefixeerd met paraformaldehyde (PFA), gekleurd en afgedekt kunnen worden verwijderd en restained met een tweede primair antilichaam dagen later. Dit beitsen is de verwijdering van het dekglaasje, het wassen van onderdelen in een bufferoplossing, en de incubatie van primaire en secundaire antilichamen tegen de neurochemische identiteit bekend. De werkwijze is voordelig voor het elimineren DATeen verlies als gevolg van een onvermogen om de morfologie te herstellen en voor het verkleinen van de neurochemische markers te testen op basis van de morfologie.

Inleiding

De hersenen staat bekend om de diversiteit in de structurele en functionele kenmerken van de individuele neuronale elementen. Inzicht in de rollen van verschillende neuronale types in de hersenfunctie en pathologie vereist karakterisering en ondubbelzinnige identificatie van neuronen. Structureel, de morfologische kenmerken gedefinieerd door somato-dendritische locatie te bepalen de mogelijke ingangen die een bepaalde neuron ontvangt, terwijl het patroon van axonale arborization identificeert potentiële postsynaptische targets. De structurele diversiteit van neuronen is gewaardeerd sinds de dagen van Ramón y Cajal's rudimentaire histologische studies 1. De komst van single-cell opnametechnieken bleek dat structureel verschillende neuronen verschillen in afvuren patronen en synaptische kenmerken tonen ook. De diversiteit in de structuur en fysiologie is vooral duidelijk in GABAergic remmende neuronen 2,3. Bovendien, is het steeds duidelijker geworden dat structurally vergelijkbaar neuronen kunnen verschillende neurochemische merkers en tonen overeenkomstige functionele 4 verschillen uit te drukken. Ook neuronen met dezelfde neurochemische merkers kunnen verschillende structuren en functies 5-10 hebben. Dus in de praktijk, de analyse van de functionele eigenschappen van neuronen en hun rol in het netwerk vereist de definitie zowel de morfologische en neurochemische identiteiten. Zelfs met de komst van reporter muizenlijnen gericht op specifieke neurochemische markers, is het vaak noodzakelijk om de morfologie en subtype identiteit bepalen op basis van immunohistochemische 11.

De standaard methode gebruikt om cellen die in acute hersenen plakjes te karakteriseren is om ze te vullen met biocytine of neurobiotin tijdens de opname, de secties in paraformaldehyde (PFA) na de opnames vast te stellen, en het gebruik van immunohistochemie om de morfologie en neurochemie onthullen. Aangezien de dikte van de punten voor segment fysiologie typisch 300 urnof meer, en omdat de meeste antilichamen niet helemaal doordringen die diepte, moeten de segmenten opnieuw worden coupes te 60 micrometer om gelijktijdige immunokleuring voor biocytine en neurochemische merkers 12-14. Helaas, resectioning is bewerkelijk; riskeert het verlies van weefsel tijdens het snijden; en kan leiden tot differentiële weefsel krimp, complicerende morfologische reconstructies. Bovendien kan de voorkennis van de morfologie helpen beperken de kandidaat markers die waarschijnlijk door de cellen tot expressie te brengen zijn. We hebben de standaard biocytine immunohistologie protocollen aangepast om seriële verwerking van afdelingen mogelijk eerst voor het herstel van de morfologie en vervolgens voor de identificatie van mogelijke neurochemische markers.

Immunohistochemie is de studie van antigeen verdeling in weefsels en cellen en kan worden gevisualiseerd met behulp van een enzym, fluorescerende labels, radioactieve elementen of colloïdaal goud partikels 15. De procedure involves behulp primaire antilichamen specifiek amplificeren label en één of meer antigenen, gevolgd door het gebruik van fluorescente secundaire antilichamen gericht op het primaire antilichaam voor visualisatie. Vanwege de noodzaak om de fluorescentie spectra van elke secundaire antilichaam onderscheiden zonder overlap, kan slechts een beperkt aantal antigenen gelijktijdig worden onderzocht. Aldus kan voorkennis morfologie bruikbaar zijn bij het selecteren van de gegadigde neurochemische merkers voor cellulaire indeling zijn. Conceptueel is de ratio seriële verwerking van al-gekleurde coupes gebaseerd op de vooronderstelling dat immunokleuring voor één eiwit of peptide raakt niet aan antigeniciteit en daaropvolgende immunokleuring voor een structureel onafhankelijk peptide 16. Dit gebrek aan interferentie wordt veroorzaakt door de binding van de antilichamen tegen een specifiek eiwit epitoop op een antigeen en derhalve voorziet in de gelijktijdige kleuring van meerdere antigenen in hetzelfde weefsel. Het aantal antigenen revealed door immunokleuring wordt beperkt door de behoefte aan niet-overlappende spectra van fluorescente secundaire antilichamen en door de noodzaak om individuele antigenen met antilichamen opgewekt bij diverse soorten richten teneinde elimineren kruisreactiviteit 17,18. Hoewel dit de redenering achter seriële plaats gelijktijdige labeling met twee verschillende antilichamen die kunnen interageren, voorzover ons bekend, immunokleuring voor een tweede antigeen is niet gemeld na voltooiing van immunokleuring voor één of meer antigenen op gemonteerde profielen. Hier beschrijven we een werkwijze voor seriële immunokleuring van eerder bevlekt en gemonteerde profielen. Hoewel we detail het proces voor een seriële immunokleuring procedure voor het terugwinnen van morfologie, gevolgd door kleuring op eiwit / peptide markers in dikke gedeelten kunnen dezelfde procedures worden gebruikt in standaard, dunne coupes ook. Daarnaast beschrijven we een praktische benadering opgenomen neuronen met biocytine en het proces om het los te vullenelektrode van de cel na voltooiing van opnames voor het vullen van de axonale en dendritische assen van neuronen te optimaliseren, zoals beschreven in onze recente werk 6,8.

Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven werkwijze is dat de morfologie van de cel opgenomen kan volledig worden hersteld en afgebeeld alvorens resectie of immunostain de segmenten. Hoewel problemen met de penetratie van bepaalde antilichamen het noodzakelijk om resectie plakken voor secundaire immunokleuring kunnen maken, zouden de procedures hier beschreven de noodzaak om complexe neuronen van meerdere secties te reconstrueren uitschakelen, zodat problemen als gevolg van weefsel verlies en differentiële krimp te vermijden, die de wederopbouw in gevaar kunnen brengen volgende resectioning. Een bijkomend voordeel is dat het proces kosten, tijd, inspanning en dure antilichamen zullen beperken doordat immunokleuring en opnieuw snijden plakjes waarin biocytine-gevulde neuronen worden teruggewonnen. De meest praktische aspect is de advertentiemende immunokleuring die kunnen worden uitgevoerd op secties gekleurd maanden voordat de bovengenoemde techniek. Met name zou het herstel van de morfologie aanzienlijk het potentieel dat fysiologische gegevens uit de cellen wordt verwijderd als gevolg van een onvermogen om een ​​fundamentele morfologische karakterisering van het celtype te verkrijgen te verminderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. biocytine Vullen tijdens Electrofysiologie

NB: De lezers kunnen verwijzen naar alternatieve bronnen voor basis patch-clamp-opname technieken en instrumentatie 19-22, die niet zijn uitgewerkt hier. De stappen die hier beschreven veronderstellen dat de apparatuur en procedures voor de patch-clamp opnames al worden vastgesteld, en de beschrijving zal worden beperkt tot details met betrekking tot biocytine-vullen en post-hoc immunokleuring. Alle experimenten die in dit manuscript werden uitgevoerd op ratten.

  1. Met behulp van een vibratome, voorbereiden levende hersensecties van het gewenste gebied bij een dikte van 300-350 urn 23.
  2. Bereid een interne oplossing die 0,2% biocytine door toevoeging van 2 mg biocytine tot 1 ml interne standaardoplossing 6. Voor het beste resultaat, ultrasone trillingen de interne oplossing voor 10-15 min, totdat het biocytine volledig oplost. Vervolgens laadt de inwendige oplossing in een 1 ml injectiespuit uitgerust met een 0,2 &# 160; um poriegrootte polypropyleen filter tip bevestigd aan een microloader. Houd deze loading spuit op een coldpack de stabiliteit van de Mg-ATP en Na-GTP in het interne oplossing leidt.
    Opmerking: Een interne oplossing die kalium gluconaat (126 mM K-gluconaat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP en 10 mM creatinefosfaat) optimaal is voor het herstel van bepaalde neurochemische merkers, waaronder parvalbumin, tijdens immunokleuring. In onze ervaring, met behulp van cesium- en chloride-gebaseerde interne oplossingen vermindert het vermogen om te herstellen immunokleuring voor bepaalde neurochemische markers. Neurobiotin of een cel-impermeant, montage, polaire tracer combinatie van een fluorofoor Alexa met biocytine kan worden gebruikt als alternatief voor biocytine.
  3. Onder infrarood differentieel interferentie contrast, breng de betreffende cel voor opname. Een verstoring van het axon minimaliseren, benadert het cellichaam door verlaging van de pipet om zijn as met de "aanpak" fzalving beschikbaar in de meeste micromanipulators. Vestigen whole-cell opnames onder infrarood differentieel interferentie contrast met behulp van patch-clamp fysiologie protocollen 19-22.
    OPMERKING: Vermijd nadert de cel de richting van de vermeende axon, zoals het axon, gevisualiseerd als een blaasje aan het uiteinde (groene pijl in figuur 1) zal scheiden. Vermijd ook die een hoge positieve druk om de opname pipet bij het naderen van de cel om de lekkage van biocytine, wat zal resulteren in hoge achtergrondkleuring minimaliseren.

figure-protocol-1
Figuur 1. Voorgestelde Vliegtuig voor Approaching Cellen voor biocytine vult. Het beeld illustreert een Korrel Cell (GC) vullen biocytine tijdens opname die is verwerkt tot biocytine zichtbaar (rode middels 594-geconjugeerd streptavidine). De GC heeft zijn dendrieten georiënteerd in het XY-vlak. Let op de afgehakte korrel celaxon (groene pijl) als gevolg van pipet beweging langs het XY-vlak. Merk op dat het ideaal om deze neuron benaderen langs het XZ-vlak. Schaal bar: 50 pm.

  1. In voltage clamp configuratie, bepalen de whole-cell capaciteit en serie weerstand in reactie op kleine (5 mV), korte (30 ms) spanning stappen met behulp van de met behulp van het membraan testfunctie in bad mode in een elektrofysiologie data-acquisitie en analyse software. Dit zal zorgen voor de oprichting van whole-cell opname-omstandigheden mogelijk te maken voor biocytine-vulling.
  2. Gedrag fysiologische opnames in zowel stroom- of spanning-clamp-modus als nodig is. Een minimale opnametijd van> 10 minuten bij 34 ° C is ideaal.
    OPMERKING: langere opnametijden mogelijk nodig voor studies uitgevoerd bij kamertemperatuur.
  3. Na voltooiing van de fysiologische opnames, herstel van de patch-clamp configuratie door langzaam de opname pipet in kleine stappen, afwisselend omhoog (langs de Z-as) enbuiten (langs de X-as) in voltage-clamp modus.
  4. Tegelijkertijd toezicht op de capaciteit en input weerstand met de functie "membraan test" om het verlies van capacitieve transiënten en de ineenstorting van de huidige reacties op een rechte lijn te visualiseren, met vermelding van de re-afdichting van de cel en de oprichting van een buiten-out- patch op de pipetpunt. Die de cel bij een gedepolariseerd potentiaal (-40 mV) wordt het opnieuw afdichten te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Deze procedure voor het verwijderen van een cel zorgt voor typisch het volledige herstel van de soma en dendrieten. Mis positieve druk toe op de opname pipet tijdens de procedure of tijdens het verwijderen van de cellen van de pipet. Visualisatie van de soma van de opgenomen cel in het segment geeft een succesvolle terugtrekking. De aanwezigheid van cellulair afval of membraanplaat aan het einde van de vrijstaande tip geeft typisch dislocatie van de soma en doen dat niet volledig celmorfologie.
  5. achteruiter losmaken van de pipet uit de cel behouden segment in de opname kamer gedurende 3-5 minuten om het transport van de kleurstof distaal dendritische en axonale processen te waarborgen.
  6. Breng de segmenten een 24-well plaat met 4% PFA voor bevestiging.
    LET OP: PFA is kankerverwekkend en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief handschoenen en een gezichtsmasker, moeten worden gebruikt om irritatie en inhalatie de huid te voorkomen. PFA is brandbaar en moet buiten het bereik van vuur worden gehouden. PFA is nooit geplaatst in de afvoer en moeten worden verzameld als chemisch afval. PFA fixatie worden gescheiden van gebieden gebruikt voor levende slice voorbereiding om verontreiniging van de fysiologie installatie te voorkomen, zoals transferpipetten.
  7. 24 - 48 uur na PFA fixatie, overdracht van de plakken tot 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor opslag voorafgaand aan immunokleuring.
    LET OP: In het ideale geval biocytine herstel en immunokleuring zijn best wanneer uitgevoerd kort na fixatie, hoewel kleuring per gevormd binnen 7 dagen van fixatie levert goede resultaten. Segmenten kunnen in PBS onderhouden met 0,02-0,05% natriumazide voor kleuring uitgevoerd tot en meer dan 90 dagen na fixatie. Hoewel overnacht fixatie in PFA werkt goed voor de meeste antilichamen, is het mogelijk dat sommige antilichamen beste wanneer de duur van de incubatie in fixatief wordt verminderd. Fixatie in PFA voor meer dan 48 uur vermindert de beschikbaarheid van antigenen en vermindert de kans op een succesvolle secundaire immunokleuring voor neurochemische markers.
    LET OP: Natriumazide is zeer gevaarlijk en een irriterend bij contact met de huid of ogen of bij inslikken of inademen. Ernstige overmatige blootstelling kan leiden tot de dood. Het carcinogeen en mutageen effect van de verbinding zijn niet bekend. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, een veiligheidsbril, een laboratoriumjas en een stofmasker. Natriumazide is nooit geplaatst in de afvoer en moeten worden verzameld als chemisch afval.
e_title "> 2. Kleuring van de eerste primair antilichaam en biocytine

(Dag 1)
OPMERKING: De volgende procedure voor immunokleuring vrij zwevende gedeelten en vereist continu schudden bij een lage snelheid (2 omwentelingen / min, rpm) op een schudinrichting alle incubatiestappen.

  1. Was 3x het weefsel voor 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
    OPMERKING: 0,1 M PBS kunnen commercieel worden gekocht of gemaakt in het laboratorium als volgt (voor 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2PO 4 in 1 L van dH 2 0.
    LET OP: Als de gewenste neurochemische marker bekend is, kleuren voor een eiwit / peptide kan gelijktijdig worden uitgevoerd met biocytine kleuring (stappen 2,2-2,4). Als kleuring voor slechts biocytine, ga dan naar stap 2.5.
  2. OPTIONEEL: Blok met 10% Blocking serum (BS, normaal geitenserum (NGS) verdund in 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur).
    OPMERKING: Elk goed moetontvangen hetzelfde volume van de oplossing; het aanbevolen volume tussen 250-500 ul / putje. De selectie van de blokkerende serum is gebaseerd op de soorten waarbij de secundaire antilichamen zijn opgewekt (bijvoorbeeld wordt gebruikt NGS kleurstof-geconjugeerd geit anti- (respectievelijke primaire antilichaam species)). Indien nodig secundaire antilichamen die verschillende soorten secties immunostain gebruiken, neemt 10% van elk normaal serum in blokkeerbuffer stap (2) en 3% van elk normaal serum voor de primaire en secundaire antilichaam incubatiestappen.
  3. (OPTIONEEL) Incubeer de secties primaire antilichaam, CB 1 R (polyklonaal, cavia) met 0,3% Triton X-100 en 3% BS in 0,1 M PBS bij kamertemperatuur O / N. CB 1 R wordt gebruikt voor het identificeren cannabinoïde receptor type 1 expressie.
    OPMERKING: Deze stap is optioneel en niet nodig is om de biocytine vulling te onthullen. Figuur 2 toont een doorsnede gelabeld voor biocytine en CB 1 R in de eerste kleurproces. O / N Incubation bij kamertemperatuur is voldoende voor de meeste van de primaire antilichamen; Bepaalde primaire antilichamen, waaronder CB 1 R, vereisen 3-5 d incubatie. Wanneer de incubatie moet langer dan 1 d zijn, wordt aanbevolen incuberen bij 4 ° C omdat Triton X-100 segmenten kan doorlaatbaar en kan leiden tot het uiteenvallen van het weefsel tijdens langdurige incubatie bij kamertemperatuur. Neem een ​​negatieve controle ontbreekt primair antilichaam in ten minste één deel voor iedere serie experimenten als controle voor de specificiteit van het secundaire antilichaam. Voor negatieve controles, wordt het primaire antilichaam weggelaten, maar het 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS en BS worden toegevoegd.

figure-protocol-2
Figuur 2. Succesvolle CCK kleuring 1 week na het herstel van biocytine kleuring en C annabinoid Receptor Type 1 (CB 1 R) - labeling. (A - C) confocale beelden van 60X die de biocytine-gevulde neuron (A) en CB 1 R immunoreactiviteit (B), aangegeven door de pijlpunt. Dezelfde sectie werd bewerkt voor CCK immunokleuring na 1 week (C). De overlay van beelden wordt getoond in D. CCK immunoreactiviteit werd onthuld met behulp van ver-rood en werd pseudo-gekleurd in cyaan. (E) morfologische wederopbouw van de door biocytine gevulde cel in A. Merk op dat de biocytine en CB 1 R vlekken zijn duidelijk, zelfs na de tweede CCK immunokleuring. Let ook op de verwachte verdeling van de CB 1 R en CCK immunokleuring patronen. (F - H) vergroot beeld van de axon uit de cel, zoals in A, tonen nauwe co-lokalisatie van biocytine en CB 1 R in axonen (pijlpunten). Schaal bar: 50 micrometer (A - D), 100 um (E) en 10 urn ( F - H). Beelden worden gereproduceerd van Yu et al. 2015 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

(Dag 2)

  1. Was de hersensecties 3x gedurende 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  2. Incubeer de secties streptavidine rode kleurstof-conjugaat (concentratie: 1: 1000; excitatie: 594 nm met emissie in het zichtbare rode spectrum) met 0,3% Triton X-100 en 3% BS in 0,1 M PBS bij 4 ° CO / N in het donker (verpakt in aluminiumfolie) aan de biocytine onthullen. OPTIONEEL: Voeg een tweede antilichaam, geit anti-cavia (concentratie: 1: 500; excitatie: 488 nm en emissie in groen), met de bovengenoemde incubatie of na de optionele primaire incubatie in stap 2,3.
    OPMERKING: Secundaire antilichamen is nodig indien de optionele primaire antilichaam kleuring (stap 2.3) wordt uitgevoerd. Om biocytine visualiseren, een streptavidin-fluorofoor conjugaat met een emissiespectrum in het rood is aan te bevelen, omdat het helpt bij fijnere axonen visualiseren in detail en met een beter contrast (figuren 1-3). Tijdens dubbele of driedubbele immunokleuring om kruisreactiviteit van secundaire antilichamen met elkaar voorkomen, voeg secundaire antilichamen na elkaar op seriële wijze (2 h interval tussen periodieke toevoegingen van de antilichamen voldoende is). Figuur 3A illustreert een biocytine-gevulde cel verwerkt zonder de optionele primaire antilichaam kleuring en afgebeeld voorafgaand aan resectioning.

figure-protocol-3
Figuur 3. Succesvolle Tweede Immunokleuring na het herstel van biocytine morfologie en Resectioning. (A1) confocale afbeelding van een 300 urn schijfje met de terugwinning van de dendritische morfologie van een biocytine gevulde cel. ( A2) Membraan spanning sporen van de neuron in responsie op 500 en -100 pA huidige injecties. (B) Herstel van de-biocytine gevulde soma in een sectie 50 pm verkregen na resectioning de sectie 300 micrometer (in A1), na montage en beeldvorming. (B2) Na immunokleuring van de dunne deel onthulde colocalization van de biocytine gevulde soma (rechter paneel) met CCK (middelste paneel). De samengevoegde afbeelding wordt weergegeven in het rechter paneel. Schaal bar: 50 pm. Panel A2 wordt gereproduceerd met toestemming van Yu et al. , In de pers 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

(Dag 3)

  1. Wassen hersenplakjes 3x gedurende 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  2. Om de fluorescentie te beschermen en re-kleuring in de toekomst te vergemakkelijken, monteer de secties in een op water gebaseerde montage medium en sluit de randen van het dekglaasje met heldere nagellak.
    LET OP: Het is het beste om te delen zo vroeg mogelijk inklemmen tot moeilijkheden bij het verwijderen van de nagellak van de glijbaan, schimmel besmetting, en uitdroging van het weefsel als gevolg van lekkage van de montage medium uit het glaasje te vermijden. Microbiële verontreiniging kan voorkomen worden door 0,02% natriumazide in PBS.
    VOORZICHTIG: Natriumazide is zeer giftig en brandbaar wanneer het in contact met water. Raadpleeg de standard operating procedures voor de behandeling en verwijdering van gevaarlijke chemische stoffen.
    (Dagen 4-7)
  3. Voer confocale beeldvorming met excitatie bij 594 en 488 nm en bij een vergroting van 20X en 40X tot biocytine gevulde neuronen in rood en neurochemische merkers (CB 1 R) groen onthullen. Beoordelen colabeling (figuur 2).
  4. Zet de camera blootstelling aan minder dan 100 ms aan fotobleken en OBTA voorkomenin confocale beeld stapels van de axonale en dendritische priëlen van de gehele neuron. Gebruik confocale image stacks en neuron tracing software pakketten om de neuronale morfologie reconstrueren.

3. kleuring van de Tweede Primary Antibody

OPMERKING: Terwijl de tweede immuunkleuren kan worden uitgevoerd 90 d na de eerste kleuring wordt optimale kleuring bereikt als de tweede primaire antilichaam kleuring wordt uitgevoerd binnen 7-10 d.

(Na 7-90 d)

  1. Solliciteer aceton om een ​​wattenstaafje en strip de nagellak af van het glaasje.
  2. Verwijder de dekglaasje voorzichtig met fine-tip pincet en doe er een paar druppels van 0,1 M PBS op de secties.
  3. Haal de delen van de glijbaan met een fijn penseel en was ze in 0,1 M PBS voor 24 - 48 uur op een shaker bedekt met aluminiumfolie bij weinig licht bij 4 ° C.
    NB: Het is cruciaal om te delen met een dekkingluminum folie om te voorkomen dat fotobleken.
  4. Om volledige verwijdering van het fixeermiddel garanderen, was de secties 1 - 2x op de volgende dag in 0,1 M PBS gedurende 10 minuten elk.
  5. Ga door incubatie in de tweede primaire antilichaam (bijvoorbeeld cholecystokinine, een neuropeptide gevonden in bepaalde GABAerge interneuronen (CCK; concentratie: 1: 1000, muis monoklonaal antilichaam)) gedurende 1 d (figuur 2).
    OPMERKING: Deze procedure is vergelijkbaar met stap 2.3, maar maakt gebruik van een ander antilichaam. Bovendien wordt de blokkerende stap overgeslagen tijdens re-kleuring.
  6. Was de hersensecties drie keer gedurende 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  7. Vlek met de fluorofoor-geconjugeerde tweede antilichaam geit anti-muis (concentratie: 1: 500; excitatiegolflengte: 647 nm), om ervoor te zorgen dat de excitatie-emissie spectra van het secundaire antilichaam niet overlappen met streptavidine (concentratie: 1: 1000; excitatiegolflengte: 594 nm) en voorafgaande immunofluorescentievlekken.
  8. Monteer de secties in waterige montage medium en sluit de randen van het deksel slip met heldere nagellak.
    OPMERKING: Bewaar de secties bij 4 ° C in een ondoorzichtige opbergdoos de fluorescentie beschermen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na succesvolle afronding, de afdelingen behouden biocytine vulling en de immunokleuring uitgevoerd in stap 2 en kan worden afgebeeld met behulp van confocale of epifluorescentie microscopie. Bovendien, het bewerkte secties ook immunokleuring voor het antigeen gelabelde tijdens de verdere verwerking in stap 3. In het deel weergegeven in figuur 2 tonen, werd de morfologie van een biocytine gevulde neuron in een dikke gedeelte (300 pm) geopenbaard via streptavidine gevisual...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritische stappen in het protocol

Het vullen van de gepatchte cel met biocytine is de meest cruciale stap om het volledige herstel van de morfologie te waarborgen. Voor volledig herstel van de cel, is het essentieel om een ​​optimale segment oriëntatie selecteren om het verbreken van zo laag mogelijk houden tijdens het snijden. Deze oriëntatie kan verschillen op basis van het circuit en celtype in behandeling. Vervolgens is het noodzakelijk om voldoende de biocytine te diffu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de steun van NIH / NINDS R01 NS069861 en NJCBIR CBIR14IRG024 te erkennen VS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NaClSigmaS7653Immunostaining
KClFluka60129Immunostaining
Na2HPO4 SigmaS7907Immunostaining
KH2PO4 Sigma229806Immunostaining
Triton X-100SigmaT8787Immunostaining
Guinea pig anti CB1 SigmaAf530-1Immunostaining
Mouse anti CCKCURE, UCLAcourtesy of G. OhningImmunostaining
Rabbit anti ParvalbuminSwantPV27Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor conjugateMolecular ProbesS11227Immunostaining
Normal goat serum (NGS)SigmaG9023Immunostaining
Vectashield Vector LabsH-1000Immunostaining
Secondary AntibodiesInvitogen Molecular probesAlexa Fluor conjugated dyesImmunostaining
Labnet orbit low speed shakerBioexpressS-2030-LSImmunostaining
ForcepsDumont11231-30Immunostaining
Slide foldersEMS71520Immunostaining
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066Elektrofysiologie
Multiclamp 700B amplifierMolecular devicesMulticlamp 700BElektrofysiologie
pCLAMP 10 SoftwareMolecular devicespCLAMP 10 Elektrofysiologie
DigitizerMolecular DevicesDigidata 1440 digitizerElektrofysiologie
Filter tipsNalgene171-0020Elektrofysiologie
SonicatorFisher Scientific15-335-100Elektrofysiologie
MicroloadersEppendorf930001007Elektrofysiologie
BiocytinSigmaB4261Elektrofysiologie

Referenties

  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  3. Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  4. Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
  5. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553(2013).
  6. Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
  7. Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
  8. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
  9. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
  10. Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
  11. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109(2015).
  12. Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
  13. Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
  14. Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17(2011).
  15. Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
  16. Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
  17. Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
  18. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358(2015).
  20. Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
  21. Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
  22. Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
  23. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706(2014).
  24. Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
  25. Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
  26. Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109(2013).
  27. Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
  28. Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Biocytinvullingimmunohistochemische kleuringmorfologisch herstelpatchclamp registratieseri le immuunkleuringpreparatie van hersendoorsnedenantilichaampenetratieconfocale beeldvormingcelmorfologie

Gerelateerde artikelen