Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Summary

Deze studie beschrijft een -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Abstract

De micro-neutralisatie (MN) test is een standaardtechniek voor het meten van de infectiviteit van het influenzavirus en de remming van virusreplicatie. In deze studie presenteren we het protocol van een beeldgebaseerde MN-test om de ware antigene relaties tussen virussen te kwantificeren. In tegenstelling tot typische plaquereductietests die afhankelijk zijn van zichtbare plaques, kwantificeert deze test de volledige geïnfecteerde celpopulatie van elke put. Het protocol matcht het virustype of -subtype met de selectie van cellijnen om maximale infectiviteit te bereiken, wat de steekproefcontrast tijdens beeldvorming en beeldverwerking verbetert. De introductie van kwantitatieve titratie definieert de hoeveelheid inputvirussen van neutralisatie en maakt de resultaten van verschillende experimenten vergelijkbaar. De beeldopstelling met een flatbed scanner en gratis downloadbare software maakt de aanpak hoogdoorvoerig, kosteneffectief, gebruiksvriendelijk en eenvoudig in te zetten in de meeste laboratoria. Onze studie toont aan dat de verbeterde MN-test goed werkt met de huidige circulerende influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2) en B-virussen, zonder significant beïnvloed te worden door aminozuursubstituties in de neuraminidase (NA) van A(H3N2)-virussen. Het is bijzonder nuttig voor de karakterisering van virussen die ofwel een lage HA-titer bereiken en/of een abortieve infectie ondergaan, wat resulteert in een onvermogen om plaques te vormen in gekweekte cellen.

Introduction

Micro-neutralisatie (MN) assays worden in virologie voor de kwantificering van neutraliserende antilichamen en antivirale activiteiten. In plaats van hemagglutinatie inhibitie (HI) assays, MN assays kunnen niet- antigenisch effecten beïnvloed door de veranderingen van receptor-bindende affiniteit van influenzavirussen, die kunnen bemoeilijken de interpretatie van resultaten HI ^1,2,3 overwinnen. Tot voor kort waren de meeste MN assays gebaseerd op cytopathische effecten (CPE) of enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) ^4,5. MN assays op basis van focus en plaquereductie werden ontwikkeld in 1990 ^6,7,8. Plaquevermindering assays vertrouwen op te tellen zichtbaar plaques om het besmettingsgevaar te kwantificeren. Echter, visuele telt alleen betrekking grote plaques die oplosbaar door menselijke ogen, hoewel de meeste plaques zijn klein en onzichtbaar voor vele huidige circulerende virussen. Dit onvolledige dekking kan aanzienlijke verschillen veroorzaken tussen examinatoren en tussen de experimenten, wat leidt tot incomparable resultaten. Het is ook mogelijk de werkwijze te gebruiken bij sommige virussen vertonen abortieve infectie van enkele cellen of zeer kleine plaques.

De arme telresolutie kan worden verbeterd door de introductie van een imaging-gebaseerd protocol. Met de vooruitgang in technologie, optische microscopie en high-throughput kan goed-plaat lezers accurate manier om de geïnfecteerde cellen ⁹ tellen bieden. Onder een trans-verlichte microscoop, kunnen geïnfecteerde cellen gelabeld met bepaalde markers worden gevisualiseerd door de absorptie of fluorescentie contrast in sub-cellulaire resolutie. Een monster kan vervolgens worden geanalyseerd op een computerscherm.

Helaas, vanwege de beperking van het gezichtsveld, meer dan honderd beeldvensters dienen een enkel putje bedekken. Het analyseren van een plaat met 96 wells zou de beeldvorming en de verwerking van ongeveer tienduizend beelden nodig. Dergelijke moeizaam proces is tijdrovend en duur, en de resolutie is opgedaan general onnodig voor routine karakterisering van virale infecties. Laboratoria met een beperkt budget kan vinden dat de aanpak rond een flatbedscanner biedt een kosteneffectieve, high-throughput alternatief.

In dit artikel beschrijven we een verbeterd plaquereductie MN test die geschikt is voor het karakteriseren van antigene een groot aantal virussen en voor het kwantitatief meten antivirale activiteiten en neutralisatie antilichamen. De test heeft een aantal voordelen: ten eerste een imaging-gebaseerde test die kan virusinfecties maatregel op cellulair niveau, ongeacht de plaque grootte. Het tellen van de totale geïnfecteerde celpopulatie (ICP) in een put verhoogt de detectiegevoeligheid, waardoor het mogelijk om de virussen te karakteriseren met lage infectiviteit. Ten tweede wordt een meer accurate kwantitatieve titratie vóór neutralisatie geïntroduceerd om de hoeveelheid toegevoegd virus te bepalen. De kwantitatieve ingang virus vermindert de variatie tussen de verschillende experimenten en maakt de resultaten beter vergelijkbaar tussen laboratoria. Ten derde neutralisatie titers kunnen rechtstreeks door het analyseren beelden, waardoor de kwantificering snelle en gebruikersvriendelijke bepaald. Tenslotte het protocol levert een rendabele hoge-doorvoer alternatief met de vereiste resolutie en nauwkeurigheid. De kwantificering is gebaseerd op een flatbed scanner en vrije data processing software. De hele opzet heeft een kleine footprint en is inzetbaar in de meeste laboratoria.

Het protocol in dit document bestaat uit vier belangrijke stappen, met inbegrip van virus titratie titratie kwantificering, virus neutraliseren, en neutralisatie kwantificering. Virustitratie is samengesteld experiment dat bepaalt de hoeveelheid invoer virussen voor gebruik in neutraliseren. Tijdens een titratie, een aantal virale concentraties worden toegepast op de celmonolagen in 96-wells plaat. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens gekwantificeerd in deel 2. De viral Dilutie die 20% -85% ICP produceert op zijn beurt toegepast als input virussen de overeenkomstige neutralisatie in sectie 3. De titers van de neutralisatie protocol worden gekwantificeerd met behulp van sectie 4. Experimenten die volgden de bovenstaande protocollen worden gepresenteerd in de Representatieve resultaten. De assay is uitgebreid getest gedurende de afgelopen twee jaar met de meeste van de huidige circulerende influenzavirussen zoals A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B virussen. De resultaten van het influenzavirus karakterisering werden opgenomen in de verslagen van de WHO overleg dat de aanbevelingen over griepvaccins voor gebruik in het zuidelijk halfrond in 2016 en het noordelijk halfrond in 2016-2017 gaf.

Protocol

LET OP: De bioveiligheidsniveau (BSL) voor de volgende protocol is BSL 2 voor seizoensgebonden influenza virussen en BSL 3+ voor potentiële pandemische griepvirussen. Virale titratie is vereist voordat een neutralisatie experiment beslist de virale concentratie van de virale controle (VC).

1. Virus titratie

Opmerking: Afhankelijk van het aantal virussen en het aantal duplicaten, kan een plaat worden ingesteld met de volgende flexibiliteit: (1) De virale verdunning kan worden aangebracht langs ofwel de rijen of de kolommen (figuur 1). Elk virus moet een aparte rij / kolom te bezetten. (2) De virale verdunning increment is flexibel, maar het moet beginnen met de hoogste virale concentratie op de linker bovenhoek. (3) Er is geen beperking op het aantal duplicaten.

LET OP: Madin Darby hond (MDCK) en MDCK-SIAT1 (SIAT) cellen werden vriendelijk verschaft door Dr. M. Matrosovich, Marburg, Gervele ^10. SIAT cellen MDCK-cellen stabiel getransfecteerd met de humane CMP-N-acetylneuraminate: P-galactoside α-2,6- sialyltransferase-gen voor verhoogde expressie van siaalzuur (SA) α2-6Gal beëindigde oligosacchariden.

1. Aliquot voldoende MDCK-cellen of MDCK-cellen SIAT ⁸ naar 96-well platen (200 ul / putje). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 2 of 3 dagen tot confluentie bereiken. Propageren cellen in DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en antibiotica (100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine). Incubeer de SIAT cellen bij 37 ° C met _5% CO2 en 1 mg / ml G418 sulfaat.
   NB: De verdunningsfactor is afhankelijk van de ervaring en de gebruikte cellijn. De eencellige laag moet confluent (dwz, geen celwand of toegankelijk schets voor MDCK cellen en een dicht gepakte layout voor MDCK-cellen SIAT1) bij de virusinoculatie. Voorbeelden van verdunningen op basis vande subcultuur van confluente flessen van MDCK of MDCK-cellen SIAT1 zijn vermeld in tabel 1.
2. Was de cellen 3 maal met 200 ul virus groeimedium (VGM) per putje. Steriliseer de meerwandige plaat ring met 70% EtOH gedurende 30 min, en spoel vervolgens in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of VGM voor de was.
3. Zuig het VGM onmiddellijk voeg 50 ul van VGM aan elk putje.
4. Voeg 900 ul van VGM aan elk van 6 steriele buizen (of minder, afhankelijk van het aantal testvirussen en duplicaten). Pipet 100 ul van virus in de eerste buis, meng goed, en serieel verdunnen, het veranderen van de tips tussen elke verdunning. Herhaal dit voor elk virus te worden getitreerd.
   LET OP: Dit zal virus verdunningen van 10 ^-1 tot 10 ^-6 geven.
5. Voeg 50 ul van elk virus verdunning, beginnend bij de hoogste verdunning (1 x 10 ^-5 in figuur 1), om dubbele putjes (kolommen 9 en 10 in figuur 1) van een 96-wells plaat.
6. Plaats de plaat bij 37 ° C gedurende 2-3 uur om het virus aan de cellen te infecteren.
   OPMERKING: A 2-3 uur incubatie moet voor worden gezorgd dat de virussen in het inoculum voldoende tijd om de monolaag te bereiken.
7. Bereid de overlay (10 ml / plaat)
   LET OP: De bekleding bestaat uit 5 ml 2x DMEM, trypsine (2 ug / ml uiteindelijke concentratie), 20 ui van 1 mg / ml bouillon en 5 ml van cellulose katoenlinters (zie Materials List).
8. Verwijder het inoculum.
9. Voeg de overlay (200 ul aan elk putje). Incubeer overnacht bij 37 ° C, ongestoord.
   Opmerking: Het virus ontluikende vindt plaats na ongeveer 4 uur, dus is het belangrijk dat de plaat niet verstoord na deze tijd.
10. Zuig het overlay uit de putjes.
11. Voeg ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS A (200 pl / putje). Plaats ze bij 4 ° C gedurende 30 min en bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    LET OP: Een PBS is natuurlijke pH-fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 10 gof NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na ₂ HPO _4, 0,25 g KH ₂ PO _4, en 1 liter gedestilleerd water (zie Materials List).
    LET OP: Paraformaldehyde is schadelijk bij inademing en kan brandwonden veroorzaken. Er is ook weinig bewijs van een kankerverwekkende effect, en het kan overgevoeligheid veroorzaken na contact met de huid.
12. Zuig het paraformaldehyde en was de platen tweemaal met PBS A (200 gl / putje).
13. Bewaar de platen in PBS A bij 4 ° C voor toekomstig gebruik, of doorgaan met de volgende stappen.
14. Voeg permeabilisatie buffer (100 ul / putje). Laat het bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
15. Was plaat tweemaal met PBS A (200 pl / putje).
16. Voeg 50 ul van het eerste antilichaam, MAb tegen influenza type A (1: 1000 in ELISA-buffer) per putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (of 4 ° C overnacht), onder schudden.
17. Was het 3 keer in 100 pl wasbuffer (0,05% Tween 80 in PBS A, v / v) per ook. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten tussen wasbeurten. Anders, 3 keer wassen zonder incubatie met behulp van 300 ul per putje.
18. Voeg 50 ul van het tweede antilichaam, geit anti-muis IgG (H + L) HRP conjugaat (1: 1000 in ELISA-buffer) per putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder schudden.
19. Was het 3 keer beschreven in stap 1.17.
20. Voeg het substraat (50 gl / putje). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten of totdat de ontwikkeling van een blauwe kleur duidelijk zichtbaar.
21. Om de reactie te stoppen was de plaat tweemaal met 200 gl gedestilleerd water per well, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min -3 tussen de wasbeurten.
22. Air-droog de plaat en bewaar het op een donkere plaats (bv, wikkel het in aluminiumfolie).

2. Titratie Kwantificering

1. Plaats een plaat in het scangebied van een flatbed scanner, zie figuur 2a. Gebruik de positie L-vorm grens aanzorgen voor een optimale en reproduceerbare beeldvorming locatie.
   LET OP: Het is mogelijk om het beeld twee goed platen in één scan.
2. Een afbeelding scannen.
   OPMERKING: De instellingen worden getoond in tabel 2.
3. Voer het "Wellplate Reader" software om de gewenste virusconcentratie (figuur 3) te berekenen.
   1. Klik op de "Load image" knop om een ​​afbeelding te laden. Schuif de rode balk in het histogram van het tabblad 'Global Threshold "om het sampling drempel aan te passen. Klik op de knop "Update" om het effect op het beeld te onderzoeken.
   2. Vink het vakje 'Bereken Neutralisatie / titratie ". Klik op de knop "Sampling" om de ICP te kwantificeren. Klik op de knop "Save" om de sampling resultaten op te slaan wanneer dat wordt gevraagd.
      OPMERKING: Nadat de sampling proces wordt een nieuw venster met de naam "neutralisatie & titratie Berekening" verschijnt automatisch als het vakje "Bereken Neutralisatie / titratie" is aangevinkt.
   3. Belasting of het invoeren van de goed-plaat definition kaart. Geef de drempel (bijvoorbeeld 30%) in "Titratie: Optimal Virus Bevolking (%)". Selecteer het tabblad 'titratie Process "om de titratie resultaten te berekenen. Controleer de titratie resultaten. Klik op de knop "Opslaan en sluiten" om de titratie resultaten op te slaan.
      OPMERKING: Raadpleeg Aanvullende S1 voor meer gedetailleerde instructies over de software. Een kopie van de op maat gemaakte software is beschikbaar op aanvraag.
      LET OP: Typisch, de beste virus verwatering voor de plaque-reductie assay levert ongeveer 50% (20-85%) ICP van de totale cellen in elk putje ^11.

3. Virus neutralisatie

OPMERKING: Bereken het aantal platen nodig voor de neutralisatie assay. Elke plaat is geschikt voor een virus en een aantal antisera.

Opmerking: Afhankelijk van het aantal antisera en het aantal duplicaten, een plaat kan worden ingesteld met the flexibiliteit volgende: (1) Het serum verdunning kan worden aangebracht langs volgens rij of kolom (figuur 4). Elk serum moet een aparte rij of kolom te bezetten. (2) De toename van serumverdunning is flexibel, maar het moet beginnen met de hoogste serumconcentratie de linkerbovenhoek van een plaat. (3) Het aantal duplicaten balanceert het aantal antisera. Meer duplicaten kunnen helpen om glad te strijken experimentele variaties. (4) Het aantal VC en het aantal van de celcontrole (CC) duplicaten zijn flexibel, maar ze moeten ook in afzonderlijke rijen of kolommen. Verwacht wordt dat het aantal VC duplo aanzienlijk groter dan die van de antisera.

1. Bereid de cel monolaag, net als in de stappen 1,1-1,3, 2 of 3 dagen van tevoren.
2. Voeg 50 ul van VGM aan elk putje van de plaat.
3. Gebruik kolommen 11 en 12 voor VC en CC resp. Voeg 50 ul aliquots van 01:20-receptorvernietigend enzym (RDE) behandeld serum aan de eerste rij (A) van Columns 1-10.
   Opmerking: Voor elk virus en serum combinatie wordt de assay in duplo uitgevoerd, zodat een plaat kan bijvoorbeeld bevatten een virus getoetst vijf antisera.
4. Voer 2-voudige opeenvolgende verdunningen door het overdragen van 50 ul van rij A tot H Row (Kolommen 1-10 in figuur 4) en weggooien 50 pl van rij H.
5. Voeg 50 ul van verdunning elk putje van de CC kolom (kolom 12 in Figuur 4).
6. Voeg 50 ul van het virus aan elk putje van de plaat, behalve de CC kolom (1-11 kolommen, rijen AH in figuur 4).
7. Incubeer het op 37 ° C gedurende 2-3 uur. Verwijder het inoculum. Voeg de overlay (200 ui) aan elk putje. Incubeer het 's nachts bij 37 ° C, ongestoord. Fix en vlekken op de platen als voor het virus titratie (stappen 1,11-1,22).

4. neutralisatie kwantificering

1. Plaats een plaat in het scangebied van een flatbed scanner, zie Figure 2a. Gebruik de positie L-vorm te beperken om een ​​optimale en reproduceerbare beeldvorming locatie te waarborgen.
   LET OP: Het is mogelijk om het beeld twee goed platen in één scan.
2. Scan de plaat, zoals beschreven in stap 2.2.
3. Voer het "Wellplate Reader" software om de vereiste virale titers (figuur 3, stap 2,3) berekend.
   1. Klik op de "Load image" knop om een ​​afbeelding te laden. Schuif de rode balk in "Global Threshold" om het sampling drempel aan te passen. Klik op de knop "Update" om het effect te onderzoeken.
   2. Vink het vakje 'Bereken Neutralisatie / titratie ". Klik op de knop "Sampling" om de ICP te kwantificeren. Klik op de knop "Save" om de sampling resultaten op te slaan wanneer dat wordt gevraagd.
      OPMERKING: Nadat de sampling proces wordt een nieuw venster met de naam "neutralisatie & titratie Berekening" verschijnt automatisch als het vakje "Bereken Neutralisatie / titratie" is aangevinkt.
   3. Belasting of het invoeren van de goed plaat kaart. Geef de drempel (bijvoorbeeld 50%) in "Neutralisatie:. Infectie aftrek (%)"
   4. Selecteer "Neutralisatie" gebruiken de titers berekend. Controleer de titers en klik op de knop "Opslaan en sluiten" om de neutralisatie resultaten op te slaan.
      OPMERKING: Neutralisatie wordt gerapporteerd als de reciproke van de hoogste verdunning van serum met voorgedefinieerde ICP reductie (bijvoorbeeld 50% of 80%) ten opzichte van de VC (het gemiddelde van kolom 11 in Figuur 4). Een 50% reductie ICP werd gebruikt in de Representatieve resultaten.

Results

Naar aanleiding van de bovenstaande procedures, presenteren we enkele resultaten uit de recente antigene karakterisering experimenten. De titratie opstelling is ontworpen om acht ingang virussen te onderzoeken, met dubbele duplicaten voor elke verdunning. De virale verdunningen werden getest tussen 1,0 x 10 ^-1 en 1,0 x 1,0 ^-6 om de variaties tussen de virussen dekken. De test virussen waren van het H3N2 subtype, waaronder A / Kameroen / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moskou / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 / A / Moskou / 101 / 2015, A / Moskou / 100/2015, A / Moskou / 133/2015 en A / Bratislava / 437/2015. De titratie resultaten zijn weergegeven in figuur 5. Figuur 5d toont de daling van ISP met de toename van virusverdunning. De curven werden genormaliseerd tegen de ISP van dezelfde virussen die infecties bij alle cellen leverden in een put ¹² (gedefinieerd als ICP verzadiging). Als de ICP niet verzadiging heeft bereikt met de highest virus concentratie werd de ICP gemiddelde uit overeenkomstige duplicaten in plaats daarvan gebruikt (A / Moskou / 103/2015 in figuur 5d). Het virus verdunningen die 30% verzadiging van ICP geproduceerd werden gekozen als ingang virusverdunning voor neutralisatie (tabel 3).

Neutralisatie gericht op één ingang virus tegen vijf antisera, met dubbele duplicaten op elk bord. De referentie-virus aangetoond is H3N2 A / Stockholm / 63/2015. De vijf antisera zijn A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Zuid-Afrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Zwitserse 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, en A / Nederlands 525/14 SIAT F23 / 15. De neutralisatie resultaten zijn weergegeven in figuur 6. Figuur 6d toont de infectie voortgang met de toename van serum verdunning. De genormaliseerde positieve populatie op de vertikale as de verhouding tussen ISP uit de overeenkomstige antisera respons tegen de gemiddelde ICPvan de referentie-virus ^12. De achtergrond van ICP ongeïnfecteerde cellen werd afgetrokken controles tijdens de normalisatie. De neutralisatie titers werden bepaald als de reciproque van het antiserum verdunningen overeenkomt met 50% reductie ICP (Tabel 4). Lineaire interpolatie werd gebruikt om titers die tussen twee aangrenzende serumverdunningen schatten.

Figuur 1: Voorbeeld van een goed plaat opstelling in een virus titratie experiment. Testvirussen worden toegewezen aan afzonderlijke lijnen (A tot H). Kolommen zijn voor verschillende virale verdunningen (1 tot 12). Twee kolommen werden als duplo voor elke virale verdunning. Schaal bar = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schema van een monster scansysteem. (A) Een 96-well plaat op de afbeeldingspositie van een flatbed scanner (gepubliceerd van referentie ¹¹ met toestemming van Elsevier BV), en (b) de afmetingen van de positiegrens L-vorm getoond in (a). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Desktop diagram van de "Wellplate Reader" kwantificering software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Voorbeeld van een goed plaat opstelling in een neutralisatie experiment. Elk antiserum wordt toegewezen aan twee kolommen met duplicaten (1 tot 10). Rijen zijn voor verschillende serumverdunningen (A tot H). Het virus controle neemt Column 11, met acht duplicaten (A11 tot en met H11). De cel control is in kolom 12, met acht duplicaten (A12 tot H12). Schaal bar = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Resultaten van een titratie experiment. (A) De goed-plaat setup, (b) een goed-plaat afbeelding gescand, (c) illustratiede kleur gecodeerd, gekwantificeerd, met virus geïnfecteerde celpopulatie en (d) genormaliseerd met virus geïnfecteerde celpopulaties tegen virusverdunningen. 30% ICP werd gebruikt als criterium. De fout bars in (d) zijn standaarddeviaties (SD) van het monster duplicaties (± 1 SD). Schaalbalken in (b) en (c) = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Resultaten van een neutralisatie experiment. (A) De goed-plaat setup, (b) het goed plaat, (c) illustratie van de gekwantificeerd, virus-geïnfecteerde cel populatie, en (d) genormaliseerd-virus geïnfecteerde cel bevolking te beschermen tegen de serumverdunning gescand. De ingang virus (VC) is A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP werd gebruikt om de titer te berekenen. De fout bars in (d) zijn standaarddeviaties (SD) van het monster duplicaties (± 1 SD). Schaalbalken in (b) en (c) = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende S1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

typische verdunning
	MDCK cellen	MDCK-cellen SIAT1
2 dagen	1: 5 (1 + 4)	01:10 (1 + 9)
3 dagen	01:10 (1 + 9)	01:20 (1 + 19)
Typische aantal cellen per ml
	MDCK cellen	MDCK-cellen SIAT1
2 dagen	2 x 10 5	1 x 10 5
3 dagen	1 x 10 5	5 x 10 4

Tabel 1: Typische verdunningen op een subcultuur die confluente flessen van MDCK of MDCK-SIAT1 cellen.

mode	professionele modus
type document	Film (met Area Guide Film)
Automatische belichting	Foto
Imleeftijd Type	24-bit kleur
Resolutie	1200 dpi
Opgeslagen afbeelding Format	TIFF

Tabel 2: Typische opstelling van een flatbed scanner.

Rij	Virus	Aanbevolen verdunning
EEN	A / Cameron / 15V-3538/2016	1,0 x 10 -2
B	A / Vladivostok / 36/2015	1,0 x 10 -3
C	A / Moskou / 103/2015	1,1 x 10 -1
D	A / Tomsk / 5/2015	5.9 x 10 -1
E	A / Moskou / 101/2015	8.3 x 10 -1
F	A / Moskou / 100/2015	1,4 x 10 -2
G	A / Moskou / 133/2015	1,3 x 10 -2
H	A / Bratislava / 437/2015	1,3 x 10 -4

Tabel 3: Virale verdunningen berekend uit een populatie van 30% ICP.

Kolom	antisera	Aanbevolen titer
1-2	A / HK4801 / 2014	110
3-4	A / HK7295 / 2014	213,3
5-6	A / Zuid-Afrika / R2665 / 2015	2155,8
7-8	A / Zwitserland / 9715293/2013	89.4
9-10	A / Nederland / 525/2014	78.6

Tabel 4: Titers bij 50% van ICP A / Stockholm / 63/2015 tegen antisera.

Discussion

In deze studie beschrijven we een imaging-gebaseerde MN test de werkelijke antigene relatie tussen virussen kwantificeren. In vergelijking met andere plaque-reductie assays, benadrukt de methode het meten van de ICP van een heel goed, het waarborgen van de volledige dekking van de infectieuze bevolking. De onafhankelijkheid van plaquevorming vergroot tevens de toepassing van de bepaling voor virussen die hoofdzakelijk onzichtbaar kleine plaques kan vormen of die slechts beheerder eencellige infectie. Aldus was de zuiverheid kan onderzoeken vermenigvuldigen en de effecten van een groter aantal antilichamen dan HI, en het helpt om uitgebreider weerspiegelen de antigene overeenkomsten of verschillen tussen virussen ^12. Wanneer bijvoorbeeld oseltamivircarboxylaat is opgenomen, de MN test wordt minder beïnvloed door NA-afhankelijke binding, die de antigene verschillen nauwkeuriger. Tijdens de ontwikkeling van de test werden grote inspanningen geleverd om het experiment consistentie, snelheid en detectie verbeterengevoeligheid, onder meer door het beheersen ingang virussen door middel gekwantificeerd titratie, beeldvorming in high throughput met een flatbed scanner, en implementeren van een gebruiksvriendelijke data processing platform. De resultaten zijn over het algemeen in overeenstemming met geweest en bevestigde die van HI. Met name de resultaten bleek ook antigene verschillen tussen antigene drift varianten recente type A en B vaccin virussen en antigene veranderingen veroorzaakt door kweek geselecteerde of incidenteel veranderingen, zoals G155E vervanging HA1 bepaalde A (H1N1) pdm09 virussen ^12.

Het protocol paste het virustype of subtype met de selectie van cellijnen die de sterkste infectie, die de beeldvorming sterk verbeterd signaal gaf. Experimentele variant werd glad gemaakt met het ontwerp van duplicaten dat evenwicht met het aantal geteste antisera. Onzekerheden komen ook de beeldkwaliteit, die voornamelijk wordt beïnvloed door de beeldvormingsinrichting. Een fatsoenlijke kleur flatbed scanner kan Significantly verbetering van het imago contrast en het lawaai te verminderen. De hoeveelheid toegevoegd virus in de neutralisatie, kwantitatief worden bepaald tevoren in de overeenkomstige titratie terwijl de virussen niettemin van hetzelfde te behouden. Tijdens neutralisatie, het antiserum reactie op een infectie wordt genormaliseerd tegen het verschil tussen de referentie-virus (VC) en het achtergrondniveau (CC). Nauwkeurige metingen van VC en CC zijn essentieel voor een neutralisatie experiment. Meer duplicaten aanbevolen (acht duplo werden in de Representatieve resultaten). Tenslotte begrijpen van de software is essentieel voor het succes van een experiment. De software is getest op routine virus karakterisering van de WHO Influenza Centrum, het UK voor meer dan twee jaar. Gedetailleerde instructies voor het omgaan met verschillende situaties is voorzien in het aanvullend S1.

Dit MN test is geschikt voor toepassingen waar de monsters beslaan een extremely groot gezichtsveld, maar vereisen slechts een matige beeldvorming resolutie. De lage kosten en eenvoudige setup maken het systeem gemakkelijk beschikbaar voor de meeste virologie laboratoria. De variatie in de metingen van hetzelfde monster minder dan 3%, wat ruwweg de onzekerheid die tijdens het scannen ¹¹ definieert. Dergelijke reproduceerbaarheid volstaat vele virologische studies en kan verder worden gereduceerd door het middelen beelden van meerdere scans.

Samenvattend toont dit onderzoek aan een robuust MN test die routinematig worden gebruikt in antigene studie en HI data in gedetailleerde analyses van momenteel circulerende influenzavirussen, met name voor de halfjaarlijkse selectie van virussen voor opname in humane influenza vaccins.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
VGM	Sigma	D6429, P0781	500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb
PBS A			Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl 10 g, KCl 0.25 g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g, en Dist. Water 1 L.
Avicell	FMC	RC-581F	2.4 g in 100 ml gedistilleerd water opgelost door 1 uur lang roeren op een magnetische roerder. Steriliseer door autoclaven.
2x DMEM	Gibco	21935-028
Trypsin	Sigma	T1426
Overlay (10 ml/plaat):			5 ml 2x DMEM, Trypsin 2 μg/ml uiteindelijke concentratie, Avicell 5 ml
Triton X- 100e	Sigma	T8787	Permeabilisatie buffer: 0.2% in PBS A (v/v)
Tween 80	Sigma	P5188	Wasbuffer: 0.05% Tween 80 in PBS A (v/v)
Paarden serum	PAA Labs Ltd	B15-021	ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80
Muis MAb tegen influenza type A	Biorad	MCA 400	1st Antilichaam: 1:1.000 in ELISA Buffer
Geit anti-muis IgG (H+L) HRP-conjugaat	Biorad	172-1011	2nd Antilichaam: 1:1.000 in ELISA Buffer
True Blu peroxidase substraat	KPL	50-78-02	Substraat: True blue +0.03% H2O2g (1:1.000 van 30% oplossing)
96-wells vlakbodem microtiter platen	Costar	3596
8 kanaals multiwell plaat washer en manifold	Sigma	M2656
Perfection Plate Scanner	Epson	V750 Pro	De beeldvormingssoftware kan gratis worden gedownload van http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads.
Software operationeel omgeving: LabVIEW	National Instruments Corporation	Op Windows gebaseerd met NI Vision builder	Versie: LabVIEW2012 of hoger