De post-mortem beoordeling van myocardinfarct (MI) bij knaagdieren is gebaseerd op kwantificering van het infarct op gekleurde hartsecties. We beschrijven een nauwkeurige methode om de infarctgrootte te kwantificeren door systematische bemonstering van geoogste rattenharten van basis tot apex en beeldanalyse van trichrome-gekleurde histologische secties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Myocardinfarct wordt gedefinieerd als dood van cardiomyocyten als gevolg van langdurige ischemie; een ontstekingsreactie en littekenvorming (fibrose) volgen op de ischemische verwonding. Na de initiële acute fase wijzigt chronisch remodelleren van de linkerventrikel (LV) de structuur en functie van het hart. Permanente coronaire ligatie bij kleine dieren is veel gebruikt als referentiemodel voor een chronisch model van MI. Het verdunnen van de infarcteerde wand ontwikkelt zich progressief tot transmurale fibrose. Histologische beoordeling van infarctgrootte wordt vaak uitgevoerd; niettemin ontbreekt een standaardisatie van de methoden voor kwantificering. Inderdaad worden belangrijke methodologische aspecten, zoals het aantal geanalyseerde secties en de bemonsterings- en kwantificeringsmethoden, meestal niet beschreven en sluiten daarom vergelijking tussen onderzoeken uit. Te vaak wordt kwantificering uitgevoerd op een enkele sectie verkregen op het niveau van de papillaire spieren. Omdat nieuwe strategieën gericht op het verminderen van infarctexpansie en remodellering onder onderzoek staan, is er een belangrijke behoefte aan standaardisatie van nauwkeurige hartbemonsteringsprotocollen. We beschrijven een nauwkeurige methode om de infarctgrootte te kwantificeren met behulp van een systematische bemonstering van geoogst hart van ratten en beeldanalyses van trichroom gekleurde histologische secties verkregen van basis tot apex. We leveren ook bewijs dat het berekenen van de expansie-index (EI) toeliet voor infarctgrootte beoordeling, rekening houdend met veranderingen van de linkerventrikel gedurende het remodelleren.
Inleiding
Myocardinfarct (MI) is een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit wereldwijd. Coronaire hartziekten is de belangrijkste oorzaak; MI het gevolg is van ischemie opeenvolgende coronaire gebeurtenissen, zoals occlusie. Wanneer reperfusie niet binnen de eerste 6 uur wordt uitgevoerd, ischemie veroorzaakt onomkeerbare myocardiale necrose. Bij patiënten, de karakterisering van MI berust op verschillende diagnostische instrumenten, met inbegrip van de klinische symptomen, elektrocardiografie, evaluatie van de plasma niveaus van biomarkers, echocardiografie, MRI, en histologische analyses 1. Acute en chronische MI worden als twee verschillende fasen van de schade van het tijdstip van de myocardiale necrose in verhouding tot de tijd van de coronaire occlusie. De acute fase die gedurende de eerste 7 dagen, wordt het verloren gaan van cardiomyocyten, uitgebreide ontsteking en de rekrutering van fibroblasten. De sub-acute fase, gekenmerkt door de genezing van hartweefsel en de vorming van een litteken, treedttussen 1 en 4 - 6 weken. Uitbreiding van het infarct, ventrikel wand dunner, en ventrikel dilatatie karakteriseren de chronische fase. Uitgebreide herinrichting van de linker hartkamer geleidelijk leidt tot ernstig hartfalen 2.
MI geïnduceerd door permanente linker anterior afdalende arterie (LAD) geeft ligatie standaard knaagdiermodel van chronische myocardiaal infarct. De coronaire ligatuur bootst de coronaire occlusie. De grootte van het infarct afhankelijk van de plaats van de ligatuur. Karakterisering van ischemische verwonding in een knaagdier model is klassiek uitgevoerd met behulp van biomarker plasma niveaus, zoals troponine I en T 3, echocardiografie, MRI en histologie 4,5. Biomarker niveaus zijn gecorreleerd met de mate van cardiomyocyten dood. Echocardiografie beoordeelt de linker ventrikel functie impairment die door de regionale wandbeweging afwijkingen. Bovendien, niet-invasieve beeldvormingstechnieken, zoals MRI of hoge resolutieechocardiografie, laat de beoordeling van de vermindering van de wandbeweging, het volume van het litteken met verminderde perfusie en levensvatbaar myocardium en de wandverdunning. LV bouwvorm maken een nauwkeurige beoordeling van infarctgrootte. Tenslotte kan de kwantificering van levensvatbare en dode myocardium worden uitgevoerd postmortem gebruikmaking van specifieke vlekken van histologische secties van geoogste hart en maakt controle van de infarctgrootte (IS). Een ander belangrijk kenmerk is de evaluatie van het infarct expansie-index (EI) 6. De EI wordt geassocieerd met de transmurale infarct en begint binnen de eerste 3 dagen. De EI wordt gekenmerkt door een geleidelijke vermindering van de wanddikte, een verhoging van de LV holtegrootte, en veranderingen in LV vorm.
Om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe behandelingen te evalueren - in het bijzonder, de regeneratieve strategieën op basis van cellen, matrices en genafgifte-nauwkeurige vaststelling van de MI bij knaagdieren is van het allergrootste belang.Gemeten over een dwarsdoorsnede verkrijgen op de papillaire spier niveau, kan de grootte is vertekend door de grote variabiliteit in infarct ontwikkeling bestaat na LAD ligatie; de apex infarct kan dan worden afgedekt. Belangrijk is dat nauwkeuriger methodologieën bepaald MI maat beschreven voor muizen of ratten 7-9 10. Toch is onvoldoende is om nauwkeurig te kwantificeren LV remodeling of therapeutisch geïnduceerde reducties (of ziektes te voorkomen) van de verbouwing. Inderdaad, wordt gewoonlijk uitgedrukt als percentage van de totale LV volume beoordeeld op dwarsdoorsneden van het hart. Hoewel deze methode geldt voor acuut MI, het dunner worden van de LV wand optreedt tijdens verbouwing blijft onder geëvalueerd 11,12. Een volledige morfometrische kwantificatie van infarctgrootte en structurele veranderingen moeten verschillende parameters, zoals endocardiale en epicardiale lengtes en diameters, en infarct en gezonde gebieden te kwantificeren. We beschrijven een methodologisch ca.oach om nauwkeurig te beoordelen MI en verbouwing in een chronische rat model.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met het Europees Verdrag voor de Animal Care. Chirurgische ingrepen werden uitgevoerd in overeenstemming met de Zwitserse wet Animal Protection na het verkrijgen van toestemming van de Staat Veterinair Bureau, Fribourg, door het Zwitserse Federaal Veterinair Bureau, Zwitserland goedgekeurd.
1. Heart Oogsten
LET OP: Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder isofluraananesthesie. De inspanningen werden gedaan om het lijden van dieren te verminderen. In het bijzonder kregen alle dieren een subcutane injectie van 0,1 mg / kg buprenorfine pre-anesthesie. De chirurgische protocol voor het induceren myocardinfarct eerder elders 13 beschreven.
- Voer een sternotomie op een myocardially infarct dier onder narcose (geïntubeerd dier, 2,5% isofluraan, goede anesthesie bevestigd door poot snuifje reflex).
- Open het dier door het snijden van de huid en de spierenmet chirurgische schaar. Snij de ribben aan de linker- en rechterzijde, en verwijder vervolgens de borst.
- Verwijder de verklevingen resteert na de eerdere operatie (LAD ligatie). Snijd de aorta en verwijder het hart. Doe het materiaal in 1 M KCl (in PBS), en vervolgens wassen met PBS.
2. Tissue Voorbereiding
- Zet het infarct hart in de lengte in een acryl rattehart matrix. Bewaren bij -20 ° C gedurende 1 uur.
- Snijd het hart direct in de matrix met behulp van een scheermesje met een transversale. Zorg ervoor dat elk segment is 2 mm dik. Snij ongeveer 5-7 dia's voor elk hart (op basis van de verbouwing-niveau); dit heet een systematische bemonstering.
- Bij deze stap het uitvoeren van de 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring optioneel (houd de oriëntatie van de hartcoupes base-to-apex).
- Incubeer in 1% TTC in PBS gedurende 50 minuten bij 37 ° C. Incubeer in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min tot 1 uur. Leg de secties between twee glasplaten met een 2-mm spacers en foto's maken met een stereologische microscoop in combinatie met een camera op 15X vergroting.
VOORZICHTIGHEID! Paraformaldehyde is giftig.
- Incubeer in 1% TTC in PBS gedurende 50 minuten bij 37 ° C. Incubeer in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min tot 1 uur. Leg de secties between twee glasplaten met een 2-mm spacers en foto's maken met een stereologische microscoop in combinatie met een camera op 15X vergroting.
- Slide bevriezing (1e optie)
- Plaats elke dia in een plastic mold (10 x 10 x 5 mm) met montage medium voor Cryotomie (optimale snijtemperatuur OCT), handhaven de oriëntatie (plaats de apex gerichte zijde van het gedeelte neer op de bodem van de vorm). Bevriezing van de blokken met 2-methylbutaan dampen onder vloeibare stikstof koeling gedurende 10 - 15 min. Tenslotte worden opgeslagen weefsel bij -80 ° C.
- Paraffinization (2e optie)
- Plaats elke dia in inbedden cassettes (handhaven van de oriëntatie door het plaatsen van de top-georiënteerde zijde van het gedeelte neer op de bodem van de cassette) en in 4% PFA gedurende 24 uur. Zet het in een tissue processor machine 's nachts.
- Incubeer in ethanol 70% voor 2 uur. Incubate in Ethanol 95% voor 2 uur. Incubeer in ethanol 100% voor 3 uur. Incubeer in xyleen gedurende 4 uur. Incubeer in paraffine (gesmolten bij 60 ° C in een oven) gedurende 5 uur. Tot slot, zorg blokken door het inbedden van elk hart dia in paraffine.
- Plaats elke dia in inbedden cassettes (handhaven van de oriëntatie door het plaatsen van de top-georiënteerde zijde van het gedeelte neer op de bodem van de cassette) en in 4% PFA gedurende 24 uur. Zet het in een tissue processor machine 's nachts.
3. Masson-Goldner trichroomkleuring
- Voeg weefselsecties uit paraffineblokken met een handmatige microtoom (dikte: 5 pm) of oktober blokken met een cryostaat ingesteld op -18 ° C (dikte: 7 urn).
- Vlek één dia uit elk hart gedeelte voor elke rat (3-4 transversale secties per slide) met Masson-Goldner trichroomkleuring (zie bijlage).
LET OP: Start van deze stap voor de paraffine secties.- Smelt de objectglaasjes bij 60 ° C in een oven. Onder een zuurkast, deparaffinize ze in xyleen tweemaal gedurende 10 min elk. Rehydrateren ze in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water gedurende 3 min elk.
LET OP: Start van deze stap voor de cryosecties. - Ze op te lossen in Bouin oplossing 's nachts. Dan, spoel ze onder stromend leidingwater gedurende 10 - 15 min. Spoel ze in gedestilleerd water. Incubeer ze in hematoxyline Mayer voor 3 minuten.
- Verwijder de dia's en laat ze in gedestilleerd water gedurende 5 minuten. Dan, incubeer ze in zuur fuchsine-Ponceau gedurende 5 min. Spoel ze in 1% azijnzuur gedurende 1 min.
- Vervolgens incubeer ze in fosfomolybdeenzuur Orange G gedurende 1 min. Spoel ze in 1% azijnzuur gedurende 1 min, incubeer ze in licht groene kleurstof gedurende 10 min en spoel ze in 1% azijnzuur gedurende 1 min.
- Dehydrateren ze in 70% ethanol (30 seconden), 95% ethanol (30 sec), en 100% ethanol (5 min). Doe een druppel van een harsachtige montage medium op het weefsel secties, bedek ze met dekglaasjes, en laat ze drogen.
- Smelt de objectglaasjes bij 60 ° C in een oven. Onder een zuurkast, deparaffinize ze in xyleen tweemaal gedurende 10 min elk. Rehydrateren ze in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water gedurende 3 min elk.
4. infarctgrootte Analyse
- Verwerven één beeld uit elke dia een stereomicroscoop (vergroting 15X) gekoppeld met een camera. Fotografeer een liniaal met dezelfde instellings.
- Met beeldanalyse software om het litteken dikte in het midden van het infarct, het septum dikte, de linker ventrikel (LV) holte gebied, het infarctgebied en het weefselgebied LV behulp meten.
- Zet de schaal met de liniaal afbeelding (Figuur 1A).
- Klik op Metingen selecteer vervolgens Set Conversion Factor. Trek een lijn op de kalibratie bar. Klik met de rechtermuisknop op de foto en klik op End kalibratie. Let op de bar waarde, en klik op OK.
- Selecteer de LV van de gebrandschilderde hart afbeelding (Figuur 1B). Gebruik het hulpprogramma Meerdere segment. Selecteer de LV point-by-point, en dan klik met de rechtermuisknop Copy / Paste overal.
- Meet het litteken en het septum dikte met behulp van de enkel segment meetinstrument (figuur 1C ).
- Detecteert automatisch de LV holte, infarct, en LV gebieden met behulp van de automatische gebied meetinstrument in de RGB-modus (figuur 1D).
- Klik op het gereedschap. Activeer Alleen Borders en Aaneengesloten in de RGB-modus. Ten slotte, klikt u in het gebied van belang om het te ontdekken. Gebruik indien nodig precisie-instrumenten.
- Zet de schaal met de liniaal afbeelding (Figuur 1A).
- Bereken de infarctgrootte als de verhouding van de infarct zone van de LV gebied.
- Bereken de expansie-index als volgt: [LV holte gebied / LV hele gebied] / [infarct dikte / septum dikte], met het hele gebied met inbegrip van LV zowel de LV holte en LV weefsel gebieden.
- Bereken tenslotte een "gemiddelde" voor elk hart als volgt: [gemiddelde van de expansie-index van het infarct dia's] * [Aantal infarct slides / Totaal aantal dia's].
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zes weken na de LAD ligatie werden geoogst harten van Lewis ratten. 2-mm coupes werden verkregen uit de top naar de basis. Een TTC kleuring procedure werd uitgevoerd om de infarct zone, die in wit wordt weergegeven, en de gezonde myocardium, die rood weergegeven (figuur 2) te visualiseren. Afhankelijk van de plaats van ligatie van de LAD, de infarctgrootte varieert. Voor grote MI, werden transmurale infarcten waargenomen vanuit apex tot basis (Figuur 2A).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen in het protocol
Fibrotisch weefsel kan nauwkeurig worden bepaald in een chronische MI rat model met behulp van een systematische bemonstering van de geoogste hart en het imago analyses van trichromatische-gekleurde histologische secties verkregen van basis tot apex. Twee stappen zijn vooral van belang voor een succesvolle implementatie protocol. Ten eerste, het gebruik van KCl voor hart oogsten kan de hartspier in een ontspannen toestand worden gehandhaafd....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De studie werd ondersteund door de Swiss National Foundation [SNF 310030-149986 naar MNG], de Universiteit van Fribourg en het ziekenhuis van Fribourg.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acrylic rat heart matrix 2 mm | 72-5015 | Harvard Apparaat | |
| Inspira advanced volume controlled ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| O.C.T | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| Mayer hematoxyline | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| Acid Fuchsin CI 42685 | F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| Ponceau Xylidin CI 16150 | P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| Orange G CI 16230 | O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| Light green CI 42095 | L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| KCl | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| Xylol | 10315083 | HoneyWell | |
| Ethanol absoluut | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-methylbutaan | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| Stereogische microscoop | SM2800 | Nikon | |
| Formaldehyde | 99340 | Reactolab | |
| Inbeddingscassette | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft Image meting software | Bersoft.com | Gelicentieerde software |
Referenties
- Amsterdam, E. A., et al. AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).
- Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment. JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).
- Frobert, A., et al. Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models. Front Physiol. 6, 353(2015).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).
- Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, 1388-1396 (2008).
- Valente, M., et al. Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).
- Csonka, C., et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).
- Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model. Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).
- Lichtenauer, M., et al. Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation. Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).
- Lutgens, E., et al. Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).
- Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix. J Vis Exp. , e51390(2014).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101, 593-600 (1981).
- Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion. Circulation. 78, 186-201 (1988).
- Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat. J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
