Met behulp van de mouw techniek in een muismodel van aorta transplantatie - een instructie Video

Samenvatting

Presenteren we een orthotopic aortaklep transplantatie model met behulp van de mouw techniek in muizen. Het is een zeer snelle wapendrager-methode, die kan worden ingezet in studies van vasculaire ziekte.

Samenvatting

Aorta transplantatie Orthotopic met behulp van de mouw techniek vermindert schade aan de aorta met mislukkingstarief van slechts 10-20%. De tijd om de aorta in muizen met behulp van de methode mouw anastomose was kort en gemakkelijk gemiddeld 20 min, studies van iso/allo transplantaten toelaat. Het volgende artikel beschrijft de procedure van de aorta transplantatie gebruikt in ons laboratorium. De muizen waren verdoofd met een mengsel van 1,5% volume Isofluraan en 100% zuurstof via een gezichtsmasker. Op dit punt, het segment van de aorta tussen de renale bloedvaten en de bifurcatie werd gescheiden van de vena cava, vrij bereid en clampedat de proximale en distale segmenten met een enkele zijde hechtdraad. Voorafgaand aan de verwijdering van de aorta, werd een zoutoplossing met heparine geïnjecteerd in de vena cava inferior. Vervolgens de aorta werd gesneden tussen de klauwen en een zoutoplossing heparine oplossing werd gebruikt voor het spoelen van de lumen. De techniek van de mouw met monofilamenten hechtingen werd gebruikt om te planten van de abdominale aorta in de positie van de orthotopic.

Inleiding

Zoals opgemerkt in een eerdere studie, is veel aandacht besteed aan lymfkliertest aorta transplantatie modellen waarmee discriminatie tussen specifieke vasculaire reacties veroorzaakt door de prothese zelf en bepaalde systemische factoren die verband houden met een arteriogenic omgeving ^{1 , 2 , 3}. de belangrijkste factor die hier een cruciale rol speelt is de beschikbaarheid van knock-out en transgene muizen. Hun betrokkenheid bij een dergelijk model biedt de mogelijkheid om te identificeren en bepalen van nieuwe pathofysiologische trajecten in verband met de ontwikkeling van degeneratieve vaatziekten, zoals atherosclerose en aneurysma vorming^{4, 5}.

Het is vermeldenswaard dat tijdens de enting een intrinsieke ischemie/reperfusie letsel aan de vaartuigen die bestemd zijn voor de transplantatie weergegeven. Dus, het voorkomen van specifieke problemen met de integriteit van de prothese of een onverwachte ontstekingsreactie in de postoperatieve periode kan niet worden uitgesloten eventueel uitschakeling pathofysiologische veranderingen in degeneratieve vasculaire ziekten^{3 ,4,5,6,7}. Mouw wapendrager is de alternatieve methode in eind voor arteriële wapendrager van vaartuigen met een diameter van minder dan een millimeter en is met succes toegepast in de nier- en cardiale transplantatie bij ratten die werd vervolgens aangepast op aorta transplantatie in muizen door Dambrin et al. ^{8 , 9 , 10 , 11}.

Aorta schade met behulp van de mouw transplantatie techniek wordt geminimaliseerd met een zeer lage technische mislukkingstarief, te wijten aan het duurzame gemiddeld slechts 20 min. De resultaten van onze vorige hebben uitstekende functionele en structurele eigenschappen van een isograft in vivo aangetoond na de transplantatie die met behulp van de mouw techniek¹. Dambrin et al. beschrijven die na een korte leercurve het slagingspercentage was meer dan 78%¹⁰. Complicaties zoals trombose zijn zeldzaam, bijvoorbeeld Engelbrecht et al. deed niet observeren trombose met behulp van de mouw techniek in niertransplantatie in de rat⁸.

Het model van de lymfkliertest aorta transplantatie met mouw anastomoses is een snelle en eenvoudige tool om te studeren van iso/allograft reacties in het getransplanteerde vaartuig. Deze video toont de aorta transplantatie procedure uitgevoerd in ons laboratorium. Dit model van de transplantatie kan nuttig zijn bij het bepalen van de pathologische mechanismen van vasculaire degeneratieve ziekte en kan bijdragen aan de verdere evaluatie van moleculaire en farmacologische interventies¹².

Protocol

procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op de RWTH Aachen University, AZ 84-02.04.2012.A234.

Opmerking: de procedure is aangetoond door middel van volwassen mannelijke wild type muizen met CD1 achtergrond. Houd de muizen in een gespecialiseerd laboratorium eenheid vóór en na de operatie, verzekeren van toegang tot voedsel, gespecialiseerde veterinaire controle en behandeling. Als de dieren worden gekocht van buiten het toestaan van één week acclimatisatie vóór het uitvoeren van chirurgie.

1. voorbereiding van de Donor

1. gebruik van steriele materialen en instrumenten te handhaven van de steriele omstandigheden tijdens de operatie te voorkomen infecties.
2. Anesthetize elke muis met een mengsel van 1,5% door volume Isofluraan en 100% zuurstof via een gezichtsmasker. Leg de muis op een platform in de liggende positie en tape alle haar benen op de operatietafel. Controleer de reflexen door knijpen de achtervoeten om er zeker van te zijn dat de muis voldoende is verdoofd. Plaats van oogheelkundige zalf op de ogen om te voorkomen dat tijdens de procedure drogen.
3. Verwijder alle haren uit de buik met behulp van een ontharende gel of gebruik van een scheerapparaat. Het uitvoeren van de bewerking onder steriele omstandigheden. Ontsmetten van de buik met afwisselende scrubs van chloorhexidine en steriel water.
4. Verwijder de aorta donor via een middellijn abdominale incisie met schaar of scalpel. Intrekken van de darm handmatig naar rechts. Zachtjes handmatig weerspiegelen de darmen aan de kant met behulp van de gratis handschoenen poeder.
   1. Plaats van de darm op een stuk gaas bevochtigd met zoutoplossing om het te houden vochtige.
   2. Ontleden weg de abdominale aorta zeer zorgvuldig uit het omringende weefsel met behulp van een botte dissectie met een pincet.
   3. Scheiden van het segment van de aorta tussen de renale bloedvaten en de bifurcatie uit de vena cava met een pincet.
   4. Beveiligen van alle kleine takken van dit segment zeer zorgvuldig met 11-0 enkel monofilament hechtdraad.
   5. Voor het verwijderen van de aorta, injecteren 0.5 milliliter (mL) van zoutoplossing met 50 U van heparine in de vena cava inferior.
   6. Laat het donordier nadat het segment van de aorta is verwijderd exsanguinate.
   7. Spoel van de prothese volledig met zoutoplossing en vervolgens onverwijld overbrengen naar een container ijskoude zoutoplossing.

2. Voorbereiding van de ontvanger

1. Anesthetize van het ontvangende dier met een mengsel van 1,5% door volume Isofluraan en 100% zuurstof via een gezichtsmasker, dan verwijderen van de haren en desinfecteren (afdeling 1). Maak een incisie van de middellijn van de xiphoid aan het bekken met een scalpel en intrekken van de abdominale muren. Ophthalmic zalf op de ogen om te voorkomen dat droogte tijdens de procedure plaats.
2. Wrap de darm in zoutoplossing vochtig gaas en verdringen heel voorzichtig aan het dier ' s juiste.
3. Ontleden de aorta infrarenal gratis proximally tussen de renale bloedvaten en de bifurcatie distally met een pincet.
4. Beveiligen van alle kleine takken van dit segment zeer zorgvuldig met 11-0 enkel monofilament hechtdraad.
5. Klem van de proximale en distale delen van de aorta met een 6-0 één zijde hechtdraad.
6. Verdelen van de aorta in het midden tussen de klauwen en de gesneden eindigt met EDTA zoutoplossing te spoelen het lumen open irrigeren.
7. Plaats de prothese in de positie van de orthotopic met het voederen vaartuig einde ingevoegd van het ontvangende vaartuig gevolgd door wordt met 11-0 monofilamenten verzorgen om te voorkomen dat eventuele torsie van de aorta door het correct uitlijnen van de donor en de ontvanger) Figuur 1) ¹⁰.
8. zorgvuldig de ligaturen release na het uitvoeren van een inspectie van de anastomose. De distale klem eerst vrijgeven. Dit resulteert in lage druk houden van de wanden samen voorafgaand aan het vrijgeven van de proximale hogedruk zijde.
9. Perfuse de prothese onmiddellijk en controleren op een zichtbare impuls. Verwijder voorzichtig de overblijfselen van de zijde. De lengte van de optimale overlap tussen donor en ontvanger aorta is 1-2 mm.
10. De buik inhoud terug te keren naar de buikholte en sluit de hele wond met een lopende 3-0 polyglycolic zuur hechtdraad.
11. Geven de muis buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht subcutaan (SC)) vóór de beëindiging van de anesthesie.
12. Laat geen een dier zonder toezicht totdat het volledig bij bewustzijn. Beheren van pijn therapie met buprenophine 0,05 mg/kg lichaamsgewicht toegediend SC drie keer per dag gedurende drie dagen na de operatie zoals goedgekeurd door het lichaam van de institutionele toezicht.
13. Voor weefsel oogsten, anesthetize de ontvangende muizen als hierboven beschreven en flush de vaartuigen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 4% formaldehyde/PBS, (pH = 7.4) door cardiale punctie. Verwijder voorzichtig de transplantaten. Na overnachting fixatie in 4% formaldehyde/PBS, proces monsters verder en inbedden in paraffine.

Resultaten

De muizen verhaald verdoving binnen 15-30 min met geen waargenomen fysieke bijzondere waardevermindering, hoewel er een verhoogd risico op trombose. Echografie analyse was opgebruikt tijdens postoperatieve volgen. De wild type muizen gebruikt in de studie toonde geen wijzigingen in de afmetingen van hun lumen. Dienovereenkomstig, stenoses noch aneurysmal formaties werden waargenomen. De transplantatie-dieren niet vertonen plaque ontwikkeling van wanden (Figuur 2).

Conventionele kleuring procedures zoals immunohistology kunnen worden gebruikt om te bepalen van de plaque, patroon van de zachte spiercellen en accumulatie van macrofagen. In onze studie de histologische en immunohistochemische kleuring 6 weken na het enten om te testen van de integriteit van de prothese werd uitgevoerd. Histologische kleuring (haematoxyline en eosine (HE) en immunohistochemische kleuring (Smooth Muscle actine (SMA) en Macrophage (MAC2)) (Figuur 3) toonde ons ongewijzigd distributiepatronen van zachte spiercellen, intact endothelial cel voering, en geen accumulatie van cellen in de intima. Deze bevindingen wijzen erop dat er geen significante laesie of cel activatie is gevonden in de geënte vaartuigen (Figuur 3).

Figuur 1 : Techniek sleeve. De abdominale aorta was getransplanteerd met behulp van de techniek van de mouw. In deze procedure, werd van de donor aorta geplaatst in de positie van de orthotopic met oppervlakkige beten in de voeding vaartuig aanwezig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Intraoperatieve en echografie beelden. Voorbeelden van de intraoperatieve (necropsie) weergave van de transplantaten 6 weken na de transplantatie (A), de drie-dimensionale echografie (B) en B-wijzemening (C). De postoperatieve follow-up werd uitgevoerd met behulp van echografie. De foto's tonen de bij van de prothese met geen verandering in lumen dimensies. Bovendien werden geen stenoses of aneurysmal formaties waargenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Histologische en beelden van immunohistochemistry. De histologische en immunohistochemistry vertegenwoordiger beelden van getransplanteerde dieren op 6 weken na de transplantatie. Geen significante laesies werden waargenomen in getransplanteerde aortas door histologie (haematoxyline en eosine, hij, 100 X vergroting, schaal bar = 50 µm), immunohistochemische kleuring (gladde spieren actine SMA (rood) of Macrophage MAC2 (groen), 200 X vergroting, schaal bar = 25 µm). Kernen werden tegen gekleurd door DAPI (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Voorafgaand aan deze studie werden verschillende andere modellen van transplantatie in muizen grondig geanalyseerd^{3,6,7,10,13,14}. Het model van de aorta transplantatie met behulp van de techniek van de mouw met wijzigingen door Dambrin et al. werd geselecteerd als het gevonden die aan onze criteria en een hoge betrouwbaarheid van de mouw anastomosis in vergelijking met conventionele end-to-end hechtdraad methoden toonde ^{1 , 10}.

Deze techniek is in vele opzichten gunstig met kruis-clamp tijd aanzienlijk verminderd minimaliseren van de schade aan de aorta tijdens de operatie. Een lage incidentie van trombose werd waargenomen naast het vermijden van een potentiële mismatch in vaartuig kaliber tussen de donor en de ontvanger. De bovenstaande opmerkingen maken deze techniek zeer geschikt voor onderzoek naar vaatziekten in aorta transplantaties in muizen.

In een follow-up studie waarin werd een echografie uitgevoerd 8 weken na de transplantatie, werden geen significante veranderingen waargenomen. Dit bevestigd veronderstellingen dat schade aan de aorta tijdens de operatie zou minimaal¹.

De praktijk procedure gepresenteerd in dit artikel garandeert geen bijzondere waardevermindering zowel in de integriteit van de graft en de functie daarvan. Daarom kan worden geconcludeerd dat dit experimentele transplantatie model als een waardevol instrument voor toekomstige moleculaire en farmacologische onderzoek van degeneratieve vaartuig ziekte bij genetisch gemodificeerde muizen dienen kan.

Wij geloven dat de video-gids als lesmateriaal ter illustratie van het gebruik van dit eenvoudige arterio-arterial model functioneren en kan dat het aan een verdere vruchtbare debat over vele belangrijke kwesties in vasculaire pathologieën bijdragen zal. Deze zeer snelle wapendrager-methode kan worden gebruikt om te studeren vasculaire ziekte bij genetisch gemodificeerde muizen. Het kan ook worden gebruikt als een wijziging in het aneurysma model gecombineerd met transplantatie.

Er zijn kritische punten tijdens de procedure. Het plaatsen van de hechtdraad zelf is de meest kritische stap. De chirurg heeft te verzorgen om te voorkomen dat eventuele torsie van de aorta door de juiste uitlijning van donor en ontvanger. De klemmen zijn zorgvuldig verwijderd na inzage van de anastomose. De distale klem moet altijd eerst wat resulteert in lage druk houden van de wanden samen voorafgaand aan de release van de proximale hogedruk zijde worden vrijgegeven. Het gevolg van het niet goed na de reeks van versie zou worden bloeden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Halsey Needle Holder	Fine Science Tools	12001-13
Dumont #5 Forceps -	Fine Science Tools	11254-20
Lexer-Baby Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-01
Vannas Scissors	Aesculap, Germany	Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps	Geuder, Germany	19015
6-0 silk black (Silk)	Deknatel, Research Triangle Park NC, USA	18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon)	Ethicon, Norderstedt, Germany	EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit)	Serag-Wiessner, Naila, Germany	60203214
Isofluorane	Any genericon
Heparin	Any genericon
0.9% saline	Any genericon
Buprenorphine	Any genericon
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany
Microscop	Zeiss	Opmi MDO/S5
Vaporiser	Eickemeyer	TEC3
Ultrasound	Vevo, Canada	770,2100