Methodenartikel

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

DOI:

10.3791/54934

⸱

24 februari 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanische stress kan de chondrogene differentiatie van stamcellen induceren, wat een potentiële therapeutische aanpak biedt voor de reparatie van beschadigd kraakbeen. We presenteren een protocol om de chondrogene differentiatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) te induceren met behulp van centrifugale zwaartekracht (CG). De door CG geïnduceerde opregulatie van SOX9 resulteert in de ontwikkeling van chondrogene fenotypes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschadigd kraakbeen kan niet natuurlijk genezen. Momenteel is de meest geavanceerde therapie voor kraakbeendefecten de transplantatie van chondrocyten die zijn gedifferentieerd uit stamcellen met behulp van cytokinen. Helaas is cytokine-geïnduceerde chondrogene differentiatie kostbaar, tijdrovend en gepaard gaande met een hoog risico op besmetting tijdens in vitro differentiatie. Echter, biomechanische stimuli dienen ook als cruciale regulatorische factoren voor chondrogenese. Bijvoorbeeld, mechanische stress kan chondrogene differentiatie van stamcellen induceren, wat een potentiële therapeutische aanpak suggereert voor de reparatie van beschadigd kraakbeen. In deze studie hebben we aangetoond dat centrifugale zwaartekracht (CG, 2.400 × g), een mechanische stress die gemakkelijk toegepast kan worden door centrifugatie, de upregulatie van sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) induceerde in vet-afgeleide stamcellen (ASCs), waardoor ze chondrogene fenotypes gaan uitdrukken. De gecentrifugeerde ASCs vertoonden hogere niveaus van chondrogene differentiatiemarkers, zoals aggrecaan (ACAN), collageen type 2 alfa 1 (COL2A1) en collageen type 1 (COL1), maar lagere niveaus van collageen type 10 (COL10), een marker van hypertrofische chondrocyten. Daarnaast werd chondrogene aggregaatvorming, een voorwaarde voor chondrogenese, waargenomen in gecentrifugeerde ASCs.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Defecten in gewrichtskraakbeen niet genezen natuurlijk. Bijgevolg stamcel is voorgesteld als een veelbelovende benadering voor het herstel van aangetast kraakbeen. Deze werkwijze vereist zowel het verkrijgen van een voldoende aantal stamcellen en de inductie van deze cellen chondrogene differentiatie ondergaan. Beenmerg (BM) is op grote schaal gebruikt als bron van stamcellen, maar celisolatie van BM heeft twee belangrijke nadelen: invasiviteit en onvoldoende opbrengst. Vanwege het gemak van verwerving, vetweefsel is een voorkeur bron van stamcellen. Eerdere studies toonden de haalbaarheid van het isoleren van stamcellen uit vetweefsel en het induceren van chondrogene differentiatie van deze cellen met behulp cytokines zoals TGF-β1 1, 2. Deze werkwijzen zijn effectief maar duur.

Als goedkopere alternatief voor cytokinen, kunnen mechanische belasting worden gebruiktchondrogene differentiatie induceren. Mechanische belasting speelt een cruciale rol bij het handhaven van de gezondheid van gewrichtskraakbeen 3, en kan chondrogene fenotypes in verschillende cellen. Bijvoorbeeld, hydrostatische druk veroorzaakt chondrogene fenotypen in synovium afgeleide progenitorcellen via de MAP kinase / JNK pathway 4 en mechanische compressie veroorzaakt chondrogenese van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) van genen opwaarts reguleren chondrocytische 5. Bovendien afschuifspanning bij tot de expressie van chondrogenese gerelateerde extracellulaire matrix (ECM) in humane MSC's 6. Centrifugale zwaartepunt (CG), een gemakkelijk worden gecontroleerd spanning gegenereerd door centrifugeren, kan differentiële genexpressie in cellen 7 induceren. Bijvoorbeeld, in longepitheelcellen carcinoomcellen, de expressie van interleukine (IL) -1 ter opgereguleerd door centrifugeren 8. Therefore, als experimenteel induceerbare spanning, CG kan worden gebruikt om chondrocyte genexpressie te induceren in stamcellen. Het blijft echter onduidelijk of CG het chondrogene differentiatie van stamcellen kunnen induceren.

In deze studie hebben we vastgesteld dat CG induceerde de opregulatie van SOX9, regulering van de chondrogenese in menselijk ASCs, wat resulteert in de overexpressie van chondrocyte genen. Verder vergeleken we de effecten van CG op chondrogenese met die van TGF-β1, de groeifactor meest gebruikte in vitro chondrogenese te induceren in stamcellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC16EAME0162) en uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen. Alle weefsels werden verkregen met schriftelijke informed consent.

1. Centrifugaal Zwaartekracht laden en Pellet Cultuur

  1. Celcultuur en oogst
    1. Cultuur ASC (P2-P3, zie Lijst van Materials) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium-laag glucose (DMEM-LG) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    2. Wanneer de cellen 80% confluentie bereikt, gooi het medium en spoelen van de cellen met 5 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    3. Voeg 1 ml PBS met 1 mM EDTA en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    4. Tik op de cultuur plaat zachtjes, voeg 4 ml vers medium, de overdracht van de celleneen 15-ml conische buis en gecentrifugeerd cellen bij 250 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  2. Centrifugale zwaartekracht loading
    1. Na centrifugeren (stap 1.1.4), de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM-LG met 10% FBS. Tel de cellen met een hemocytometer.
    2. CG laden, overdragen 2,5 x 10 5 cellen in nieuw 15-ml conische buis en centrifugeer bij 2400 xg gedurende 15 min.
  3. pellet cultuur
    1. Onmiddellijk na centrifugatie, zuig de supernatant en voeg 500 ul van gedefinieerde chondrogene differentiatie medium (CDM, hoog-glucose DMEM aangevuld met 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM dexamethason, 1x MEM niet-essentiële aminozuren oplossing 50 ug / mL L-proline, en 1% penicilline / streptomycine). Voeg 50 ug / ml vers bereide L-ascorbinezuur 2-fosfaat bij elke mediumverversing. Als positieve controle induceren chondrogene differentiatide in uncentrifuged cellen door toevoeging CDM bevattende 10 ng / mL TGF-β1.
    2. Plaats de losjes afgedekte buizen met de pellets in een staande positie en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    3. Verander het medium elke andere dag gedurende 3 weken.
  4. micromassakweek
    1. Direct na centrifugeren (stap 1.2.2; 2400 xg gedurende 15 min), zuig de supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ul CDM.
    2. Een Micromass vormen, plaatst de geresuspendeerde cellen in het midden van een putje van een 24-wells plaat.
    3. Na 2 uur, 1 ml CDM Voeg aan de bron, pipetteren tegen de wand van de plaat niet te verstoren de micromassa. Als een positieve controle, voeren een micromassakweek met uncentrifuged cellen door toevoeging CDM bevattende 10 ng / mL TGF-β1.
    4. Incubeer de micromassa bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    5. Verander het medium every andere dag gedurende 3 weken.

2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) te detecteren transcriptionele opregulatie van chondrogene differentiatie Markers

  1. Op dag 14 Gebruik een pipet om de bolvormige pellets naar een nieuwe 1,5 ml buis en wassen in 1 x PBS.
  2. Extraheer het totale RNA van de pellets met de guanidinium thiocyanaat-fenol- chloroform extractie methode 9.
  3. Synthetiseren cDNA van 2 ug totaal RNA met behulp van reverse transcriptase volgens het protocol van de fabrikant (incuberen bij 42 ° C gedurende 1 uur en vervolgens inactiveren van het enzym bij 70 ° C gedurende 5 min).
  4. Voer PCR met primers specifiek voor chondrogene differentiatie merkers 10.

3. Kleuring de overexpressie van chondrogene differentiatie merkereiwitten Detect

  1. Paraffine inbedding celpellets
    1. Op dag 21,Gebruik een pipet om de bolvormige pellets te oogsten en was ze met 1x PBS.
    2. Bevestig de bolvormige pellets door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur.
      Let op: Paraformaldehyde is zeer giftig. contact met de ogen, huid of slijmvliezen te voorkomen. Minimaliseer blootstelling aan en inademen te voorkomen tijdens de bereiding. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    3. Gooi de fixatief en spoel de celpellets met gedemineraliseerd water (DW).
    4. Plaats een laag van gaas op de cassette en breng de vaste pellets met een pipet. Bedek de pellet door het vouwen van het gaas en sluit de cassette deksel.
    5. Dehydrateer de pellets.
      1. Dompel de pellets in 70% ethanol (EtOH) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Dompel de pellets in 80% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Dompel de pellets in 95% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      4. Dompel de pellets in 100% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit twee keer.
      5. Dompel de pellets 100% xyleen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal twice.
    6. Insluiten vaste celpellets in paraffine bij 56 ° C in een matrijs; de pellets kan worden ingebed in paraffine middels geautomatiseerde gespecialiseerde weefsel verwerkingssystemen.
    7. Cut 5 urn dikke secties van de paraffine ingebedde celpellet toepassing van een roterende microtoom.
    8. Float de secties in 50% EtOH en vervolgens overbrengen naar een 50 ° C waterbad met behulp van een glijbaan.
    9. Plaats de zwevende gedeelten op objectglaasjes.
  2. Safranine O en alcianblauwkleuring
    1. Hydrateren de paraffine secties.
      1. Dompel de objectglaasjes in xyleen gedurende 15 min. Herhaal dit twee keer.
      2. Dompel de objectglaasjes in 100% EtOH gedurende 5 min. Herhaal dit twee keer.
      3. Dompel de glaasjes in 90% EtOH gedurende 5 min.
      4. Dompel de glaasjes in 80% EtOH gedurende 5 min.
      5. Dompel de dia's in 70% EtOH gedurende 5 minuten, en daarna was ze in 1x PBS.
    2. Vlekken op de gerehydrateerd secties met 1% Safranin O-oplossing en 3% Alcian blauw voor30 minuten.
    3. Gooi de kleuroplossing en spoel de secties met DW.
    4. Vlekken op de secties met hematoxyline / eosine-oplossing (tegenkleuring) gedurende 1 min.
    5. Gooi de kleuroplossing en spoel de secties met DW.
    6. Breng een druppel montage medium op een dekglaasje na het verwijderen van het resterende water. Plaats de dia (cell-kant naar beneden) op het dekglaasje met de montage medium zorgvuldig.
    7. Laat de dia's drogen 2-3 uur bij kamertemperatuur.
    8. beelden vast te leggen met behulp van een bright-field microscoop (geautomatiseerde rechtopstaande microscoop, 50X en 200X).
  3. immunofluorescentietest
    1. Hydrateren de secties zoals beschreven in paragraaf 3.2.1.
    2. Dompel de objectglaasjes in natriumcitraat buffer (10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), en vervolgens te handhaven op een sub kooktemperatuur gedurende 10 minuten in de magnetron.
    3. Koel de dia's voor 20 minuten bij kamertemperatuur en daarna was ze met kraanwater.
    4. Incubeer de glaasjes in 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) gedurende 15 min, en vervolgens wassen met kraanwater gedurende 15 min 11.
    5. Blokkeer de dia's met blokkerende buffer (10% normaal geit serum in PBS) gedurende 1 uur.
    6. Zuig het blokkeren oplossing, en breng daarna een primair antilichaam verdund met 5% normaal geit serum op de dia's.
    7. Incubeer de glaasjes nacht bij 4 ° C.
    8. Was de glaasjes drie keer in 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
    9. Incubeer de glaasjes in fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam verdund met 5% normaal geit serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
    10. Was de glaasjes drie keer in 1x PBS gedurende 5 min elk in het donker.
    11. Incubeer de glaasjes met DAPI (1 ug / ml) gedurende 10 min, en vervolgens twee keer wassen in 1 x PBS gedurende 5 minuten elk.
    12. Breng een druppel montage medium op een dekglaasje na het verwijderen van het resterende water. Plaats de dia (cell-kant naar beneden) op de montage medium zorgvuldig.
    13. Laat de dia's drogen 2-3h in het donker bij kamertemperatuur.
    14. Visualiseer de dia's met behulp van fluorescentie microscopie (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X en 200X vergroting) 12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centrifugale zwaartekracht induceert de overexpressie van chondrogene differentiatie merkers in adipeus afgeleide stamcellen.

Om de mate van centrifugale zwaartekracht die geschikt is voor chondrogene differentiatie te induceren, werden ASC gestimuleerd met verschillende graden van CG (0, 300, 600, 1200 en 2400 x g) gedurende 15 min. Na stimulatie, het ASC werden opnieuw gezaaid in kweekplaten en gekweekt gedurende 24 uur. Zoa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stemness de toestand van cellen is zeer belangrijk voor CG-geïnduceerde overexpressie van SOX9. In onze studie konden SOX9 expressie worden geïnduceerd door CG in vroege passage ASC's (2-3), maar niet in latere doorgang ASC. Het is gerapporteerd dat, tijdens de teelt, ASC bevatten CD34 + -cellen tot 3 passages 16. ASC neiging om de expressie van CD34 verliezen de cellen gepasseerd, waardoor een lage respons CG.

Met centrifugale zwaartekracht, kan hydrostatische dr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We verklaren dat we geen belangenconflicten hebben die verband houden met dit werk.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI14C2116) en door het Onderzoeksfonds van Seoul St. Mary's Hospital, The Catholic University of Korea.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Plasticware
100 mm DishTPP93100
60 mm DishTPP93060
50 mL Cornical TubeSPL50050
15 mL Cornical TubeSPL50015
10 mL Disposable PipetteFalcon7551
5 mL Disposable PipetteFalcon7543
ASC Culture Media Materials
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM Low glucoseLife Technologies11885-084growth base media
Penicilin StreptomycinSigma AldrichP43331%
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000-04410%
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucoseLife Technologies11995chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Life Technologies11140-050
DexamethasoneSigma AldrichD2915100 nM
Penicilin StreptomycinLife TechnologiesP43331%
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000-0441%
Ascorbate-2-phosphateSigma AldrichA896050 μg/mL
L-prolineSigma AldrichP560750 μg/mL
ITSBD3543521%
Human TGFβ1Peprotech100-2110 ng/mL
Materials
18 mm Cover GlassSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-Collagen II antibodyabcam ab347121:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugateMolecular ProbeA-110371:200
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
Slide Glass, CoatedHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EthanolDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kitThermo ScientficK1622
i-Taq DNA PolymeraseiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
loading starDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder markerEnzynomicsDM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)Catholic MASTER Cells
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SOX9 expressiecollageen type 2aggrecaan expressiemicromassa kweekparaffine inbeddingSafranine O kleuringAlcian Blue kleuring

Gerelateerde artikelen