Een vergelijkende studie van Drug Delivery Methoden Gericht op de Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Samenvatting

Twee microchirurgiebenaderingen voor lokale medicijntoediening aan het binnenoor worden hier beschreven en vergeleken in termen van impact op gehoorparameters, cochleaire cytoarchitectuur en expressie van inflammatoire markers.

Samenvatting

We presenteren twee minimaal invasieve microchirurgische technieken bij knaagdieren voor specifieke geneesmiddelafgifte in het middenoor zodat het binnenoor kan bereiken. De eerste procedure bestaat uit perforatie van het trommelvlies bulla, genaamd bullostomy; de tweede is een transtympanic injectie. Beide emuleren menselijke klinische intratympanic procedures.

Chitosan-glycerofosfaat (CGP) en Ringer's lactaatbuffer (RL) werden als biocompatibele voertuigen voor lokale geneesmiddelafgifte. CGP is een niet-toxisch bioafbreekbaar polymeer schaal gebruikt in farmaceutische toepassingen. Het is een viskeuze vloeistof bij kamertemperatuur maar stolt aan gemengde vaste fase bij lichaamstemperatuur. RL is een isotonische oplossing voor intraveneuze toediening bij mensen. Een klein volume van het voertuig juist op het ronde venster (RW) niche geschreven door middel van een bullostomy. Een transtympanic injectie vult het middenoor en laat minder controle maar ruimere toegang tot het binnenoor.

Beide procedures zijn geschikt als geneesmiddelafgiftesystemen methoden in de muis middenoor, maar transtympanic injectie bleek minder invasief worden vergeleken met bullostomy.

Inleiding

Slechthorendheid is de meest voorkomende menselijke sensorische tekort en treft 5,3% van de wereldwijde bevolking, en 30% van de personen ouder dan 65 ( http://www.who.int/topics/deafness/en , bijgewerkt 2016). Gehoorverlies beïnvloedt taalverwerving bij kinderen en versnelt cognitieve achteruitgang bij oudere mensen. Daarom is het een belangrijke gezondheidszorg probleem met een enorme socio-economische impact. Het kan worden veroorzaakt door genetische afwijkingen, omgevingsfactoren of een combinatie van beide ^1, die uiteindelijk schade en dood van neuronen en haarcellen in het slakkenhuis induceren. Deze cellen niet regenereren bij zoogdieren, dus cellulaire verlies en daarmee gepaard gaande gehoorverlies kan niet worden teruggedraaid. Klinische opties zijn gebaseerd op protheses, zoals gehoorapparaten en cochleaire, middenoor en beengeleiding implantaten ^2. Helaas zijn er geen specifieke medische herstellende Treatments voor slechthorendheid en dus verschillende onderzoekslijnen zijn gericht op de ontwikkeling van preventieve en herstellende therapieën. Nieuwe therapeutische opties omvatten gentherapie, celtherapie, alsook de ontwikkeling van kleine moleculen voor farmacologische therapie ^2.

Een van de belangrijkste uitdagingen in cochleaire farmacologische therapie is drug delivery. Systemische behandelingen beperkt werkzaam in de cochlea door de bloed-labyrint barrière ³ continu endotheel in contact met cochleaire bloedvaten, die fungeert als een fysieke en biochemische barrière voor binnenoor vloeistof homeostase derhalve beperkt geneesmiddel doorgang naar het binnenoor. Het doorlaatbaar slechts kleine oplosbare moleculen, hoewel permeabiliteit tijdens cochleaire ontsteking kan worden verhoogd, en ook met het gebruik van diuretica of osmotische middelen. De hoeveelheid geneesmiddel die uiteindelijk de cochlea na systemische toediening wordt verminderd bereikt;Daarom, hoge doses dat biologische toxiciteit kunnen veroorzaken zijn vereist. Bovendien kan levermetabolisme van het geneesmiddel toxische of inactieve metabolieten ^{4, 5, 6, 7} produceren. Daarentegen lokale interventies kan de plaatsing van een bekende beperkte hoeveelheid van het geneesmiddel in het midden of binnenoor zonder ongewenste bijwerkingen ^{4, 7, 8, 9.} In de huidige klinische praktijk worden intratympanic toedieningen beperkt tot bepaalde cochleaire pathologieën, zoals gentamicine in de ziekte van Menière ^10, corticosteroïden plotselinge doofheid, ziekte van Meniere, immuungemedieerde en gehoorverlies door lawaai, ^{11, 12, 13, 14, 15} en insuline-achtige groeifactor 1 (IGF1) in plotselinge doofheid ^{4, 16, 17.}

Formuleringen voor lokaal bestuur moet de delicate homeostase (pH en osmolariteit) van cochleaire vloeistoffen te behouden. Bovendien is het zeer belangrijk om de steriliteit te handhaven tijdens het gehele proces om bacteriële besmetting van de cerebrospinale vloeistof voorkomen. De hulpstof wordt gebruikt voor drug delivery moet biocompatibel, nonototoxic en van de juiste consistentie. Vloeibare oplossingen worden aanbevolen voor intracochlear injecties, maar zijn niet geschikt voor de intratympanic route door de vereffening via de buis van Eustachius. In dit geval worden gewoonlijk gedragen door drugs halfvaste gels om hun duurzaamheid in het middenoor ^{4, 18, 19} te verhogen. Alternatief levering systems die dragers voor de doorgang van het geneesmiddel te verhogen tot het binnenoor zijn nanodeeltjes ²⁰ en ²¹ adenovirussen hier vergeleken we twee voertuigen: CGP en RL een oplossing. CGP is een hydrogel gevormd door chitosan, een lineaire polysaccharide bestaande uit D-glucosamine en N-acetyl-D-glucosamine verkregen uit schalen van schaaldieren en β-glycerofosfaat, een polyol die een schild van water vormt rond de chitosanketens en houdt deze in vloeibare vorm. CGP is warmtegevoelig en kan worden afgebroken door lysozymen waardoor een aanhoudende geneesmiddelafgifte in het middenoor ^{22, 23, 24, 25.} Chitosan-base hydrogelen geschikte vectoren voor klinische toepassingen zoals geneesmiddelafgifte vanwege hun gebrek aan immunogeniciteit en gebrek aan activering van lokale ontstekingsreacties ^{23, 24.} Op de OTHER kant RL buffer een pyrogeenvrije isotone oplossing (273 mOsm / l en pH 6,5) bestemd voor toediening in mensen als een bron van water en elektrolyten, vooral in bloedverlies, trauma of brandwonden omdat de bijproducten van lactaatmetabolisme in de lever tegen acidose.

Hier beschrijven we en vergelijking van twee chirurgische methoden die zijn verbeterd voor lokale medicijnafgifte om de muis binnenoor. Het veiligheidsprofiel van beide technieken werd geëvalueerd met behulp van functionele, morfologische en moleculaire tests. Gehoord werd geëvalueerd middels BAER-test (ABR) ^{26, 27} uitgevoerd voor en na microchirurgie op verschillende tijdstippen. Eindpunt procedures werden gebruikt om de cochlea ontleden en vergelijk de anatomische, cellulaire en moleculaire effect van beide microchirurgische procedures.

Protocol

Zorg ervoor dat de procedures dier handling zijn in overeenstemming met de internationale en nationale regelgeving. Het protocol volgt de Europese Gemeenschap 2010/63 / EU en de Spaanse RD 53/2013 richtlijnen, respectievelijk.

1. Algemeen Animal Handling

1. Feed muizen ad libitum met een standaard dieet en het drinken van water. gezondheidsinspectie en welzijn door het volgen van Federatie voor Proefdierkunde Associations (FELASA) aanbevelingen.

2. Hoorzitting Assessment

OPMERKING: Spoor functionele gevolgen van microchirurgische procedures testen gehoor voor en vaak na operatie (in dit werk 2, 7, 14 en 28 d postmicrosurgery) met niet-invasieve procedures, zoals ABR ^9.

1. ABR testen verdoven muizen met korte werkingsduur protocollen dwz intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht (BW) en xylazine (10mg / kg BW). Als alternatief, het uitvoeren van het gehoor testen onder inhalatie-anesthesie.
   OPMERKING: Omdat ABR parameters kunnen worden beïnvloed door verdoving protocol ^28, gebruiken de zelfde gedurende het experiment.
2. Controleer de diepte van de anesthesie door het testen van de teen-snuifje reflex.
   OPMERKING: Wanneer de terugtrekking reflex verdwijnt, heeft het dier een geschikte diepte van anesthesie bereikt auditieve testen uit te voeren.
3. Bescherm de ogen tegen uitdroging en secundaire keratoconjunctivitis sicca door lokale toediening van traan supplementen, zoals hydroxypropyl-methylcellulose gebaseerde gels.
4. Houd de muis bij fysiologische temperatuur (37,5-38 ° C) gedurende de gehele procedure. Om elektrische interferentie te voorkomen, gebruikt u een warm water pomp en verwarming pads. Bewaaklichaam temperatuur rectale sondes. Wees altijd voorzichtig het dier niet oververhit raken.
   LET OP: Wij adviseren het schoonmaken van de verwarming pad met een oppervlakte desinfectiemiddel tussen muizen.0; Voor de anesthesie inductie en herstel, elektrische verwarming pads, gloeilampen of infrarood licht kan worden gebruikt.
5. ABR procedure
   LET OP: Voor ABR registratie, gebruik maken van een computer werkstation met een inboard geluidskaart golfvormen te maken (digitaal naar analoog, DA output, conversie) en elektrische reactie golfvormen digitaliseren (analoog naar digitaal, AD-ingang), een demper, een oscilloscoop en een lage impedantie versterker. Modern auditieve werkstations (dwz Tucker Davis Techonologies) omvat al deze componenten in één compact systeem.
   1. Plaats de verdoofde muis in buikligging de verwarming pads in een geluiddempende kamer naar omgevingsgeluid interferentie en nagalm (figuur 1) te vermijden.
   2. Lever akoestische stimuli in de uitwendige gehoorgang. Gebruik vooraf ingestelde stimuli of nieuwe signalen ontworpen met de juiste software. Sluit de DA-werkstation output naar de geselecteerde luidspreker.
      LET OP: Free-veld of gesloten veld luidsprekers in de uitwendige gehoorgang ingebracht kan worden gebruikt. Eerstgenoemde hebben de voorkeur bij het werken met muizen vanwege de moeilijkheid opnemers en insertie van het geluid in gesloten systemen. Vrij veld speakers stimuleren beide oren en wekken een binaural reactie. Overwegend mono reacties met vrije veld speakers te verkrijgen, contralaterale activiteit moet worden geëlimineerd door occlusie (dwz met oordopjes) of door het maskeren van het lawaai.
      1. Plaats lege veld spreker op een vaste afstand (gewoonlijk 5-20 cm) naar het hoofd of oor gekozen met het midden van de luidspreker uitgelijnd met de uitwendige gehoorgang. Zorg ervoor dat er geen obstakels zijn tussen de spreker en het oor en de oorschelp wordt volledig geopend.
   3. Plaats roestvrijstalen subdermale naald elektroden als volgt: i) de actieve (positieve) elektrode in de hoofdhuid tussen de oren (over de top van de schedel), ii) de referentie (negatieve) elektrode in de parotisgebied onder de oorschelp en iii) de aardelektrode in de rug, staart of achterpoot regio (Figuur 1).
      1. Controleer de elektrische impedantie in de positieve en negatieve elektroden. Zorg ervoor dat de impedantie is minder dan 3 kOhm (idealiter 1 kOhm). Als deze hoger is, verplaatsen, schoon met alcohol of vervang de elektroden.
   4. ABR opnemen genereren breedband klikken en zuivere toonfrequenties en aanwezig bij afnemende intensiteiten 90-10 dB ten opzichte van het geluidsdrukniveau (SPL) 5-10 dB SPL stappen ^{27, 29, 30.}
      1. Present korte klik of toon burst stimuli (1-5 ms) beginnen met een hoog niveau (dat wil zeggen 80 of 90 dB SPL) en het verminderen van de intensiteit van 5-10 dB SPL stappen. Registreer de elektrische respons in de eerste 10 ms na de stimulatie (ABR opgewekte responsen verschijnen 6-8 ms).
         OPMERKING: Om deze reden, stimulatie tarievenmag niet hoger zijn dan 50 stimuli / s (normaal tarief 20-50).
   5. Versterken, opnemen en het gemiddelde van de opgewekte elektrische reactie op elke stimulus en intensiteit. Gebruik een versterker met weinig ruis en een goede signaal-ruisverhouding, en sluit deze aan op de AD-ingang.
      OPMERKING: ABR zeer lage amplitude, meestal onder 1 mV (piek-piek) en moeten worden geregistreerd met een versterker met een zeer laag geluidsniveau. In een normaal gehoor muizen, duidelijk ABR golven ontstaan na middeling 100-200 reacties, maar van hoge kwaliteit opnames te verkrijgen, of in het geval van slechthorendheid, meer herhalingen aanbevolen (750-1000) ^27.
   6. Visueel de ABR drempel tijdens de test te bepalen.
      OPMERKING: De ABR drempelwaarde tarieven geluidsstimuli intensiteit die een betrouwbare ABR uitlokt opname met golven I tot IV duidelijk zichtbaar en middelgrote piek-piekspanning 2 SD boven de gemiddelde achtergrondactiviteit ^31. Deze gegevens worden bevestigd during off-line analyse, samen met andere parameters zoals piek- en interpeak latency, en golf amplitudes.
   7. Voer data-analyse handmatig of automatisch.
      1. Voor handmatige analyse, het identificeren van de 4-5 ABR golven (I, II, III, ... enz.) En teken de pieken (P1, P2, P3 ...) en dalen (N1, N2, N3, ...) voor elke golf. Zodra de analyse is voltooid, gegevens exporteren naar spreadsheet of tekstbestand.
         LET OP: Specifieke software voor elektrische respons opname voert meestal de analyse automatisch. Aanvullende metingen kunnen worden bepaald in het ABR opname in reactie op een bepaalde intensiteit (bijvoorbeeld 70 of 80 dB SPL) of intensiteiten ten opzichte van individuele drempels klik (dwz 15 dB SPL overschrijdt drempel).
6. Voer statistische analyse van ABR gegevens met behulp van de juiste software. Afhankelijk van het experimenteel ontwerp, gebruik standaard gepaarde T-test of een analyse van de variantie (ANOVA) om te vergelijken belangrijkste ABR parameters in de verschillende groepen ^{26, 30.}
   LET OP: In longitudinale studies, zijn veel functionele gegevens verzameld van hetzelfde dier op verschillende temporele punten (dat wil zeggen vóór en na microchirurgie). In dit geval, een algemeen lineair model herhaalde meting test geeft een gedetailleerde variantieanalyse.

3. Vehicle Voorbereiding

1. Voor te bereiden en te gebruiken voertuig oplossingen onder steriele omstandigheden.
   LET OP: Vloeibare oplossingen zijn meestal snel opgelost door middel van de buis van Eustachius. Verschillende injecteerbare afgiftesystemen kunnen worden gebruikt om de verblijftijd van het geneesmiddel te verhogen in het middenoor, zoals hydrogels en ³² nanodeeltjes.
   1. Om CGP-hydrogel bereiden lossen 75% gedeacetyleerd chitosan in 0,2 M azijnzuur waardoor een 1,5-2% (gew / gew) chitosan oplossing. Voeg 9% glycerofosfaat (w / w) aan deze oplossing ^7. Bereid de oplossingvlak voor toediening en bewaar de hydrogel bij 4 ° C tot gebruik.
      OPMERKING: De CGP-hydrogel matig viskeuze maar injecteerbare bij deze temperatuur. Onder 4 ° C verandert naar een vaste fase, het blokkeren van de toepassing. Na het aanbrengen CGP ondergaat een faseovergang naar een halfvast gel in ongeveer 15 minuten bij 37 ° C.
   2. Aliquot (0,5 ml) commercieel RL buffer en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.

4. Microchirurgie

1. Induceren algemene anesthesie met ketamine gebaseerde combinaties sedativa en analgetica (bijvoorbeeld ketamine 100 mg / kg, medetomidine 0,05 mg / kg en phentanile 0,025 mg / kg) door intraperitoneale injectie, gevolgd door inhalatie middelen (bijv isofluraan).
   1. Na het toedienen van injecteerbare middelen, past de verdoving gezichtsmasker om de muis snuit en sluit de _O2 levering aan isofluraan damp. Handhaving van de inhalatie-anesthesie tijdens demicrochirurgie en bewaken van de verdoving vliegtuig met de teen-snuifje reflex en ademhaling. Begin chirurgische voorbereiding als de reflex is volledig afgeschaft en de muis presenteert regelmatige ademhaling.
   2. Handhaving van de lichaamstemperatuur met verwarming pads gedurende de gehele procedure en de ogen te beschermen tegen het hoornvlies keratitis met een hydroxypropyl-methylcellulose gebaseerde gel.
2. Bereid een schone chirurgische gebied met behulp van steriele doeken. Steriliseer de microchirurgische instrumenten met een glazen kraal sterilisator voorafgaand aan de operatie. Handhaaf steriele omstandigheden tijdens de hele chirurgische procedure (steriele handschoenen, doeken, chirurgische instrumenten, enz.).
3. microchirurgie
   1. Bullostomy
      LET OP: Bullostomy is een eenzijdige procedure. Bedien een oor van de muis en gebruik de contralaterale oor als controle.
      1. Plaats de muis in een decubitus rugligging. Bereid de chirurgische gebied aan de ventrale oppervlak van de nek met behulp van klippers aanVerwijder de vacht. Reinig de huid met povidonjood gebaseerde antiseptische oplossing, en bedek het met steriele doeken.
      2. Met behulp van een scalpel een longitudinale incisie 2 cm vanaf de onderkaak tot de clavicula.
      3. Onder vergroting met een chirurgische microscoop, identificeren de submandibulaire klieren en scheiden beide met een pincet. Trek de onderkaakspeekselklier en lokaliseren van de oorsprong van de musculus digastricus en het gezicht zenuw.
      4. Een insnijding in de oorsprong van de musculus digastricus met een schaar, uitlopen en ventraal, waardoor de onderliggende inferieure mediale zijde van het trommelvlies bulla.
      5. Maak een opening in de bulla door boren in met een 27 G naald (Figuur 2A). Lokaliseren stapediale slagader en RW membraan caudaal (figuur 2B). Reinig het bloed uit de geboorde ruimte met een absorbeerbare gelatine spons.
      6. Met behulp van een 34 G catheter en een glas micro-injectiespuit en injecteer langzaam 3-5 μL vehikeloplossing (CGP-hydrogel of RL) via bullostomy direct op de RW niche, te vullen (Figuur 2C). Sluit de bullostomy met 1-2 druppels van weefsel lijm.
      7. Zet de onderkaakspeekselklier naar hun oorspronkelijke positie en sluit de huid insnijdingen met 5-0 zijden chirurgisch hechtdraad. Breng een chloorhexidine gebaseerd antiseptische rond de incisie te vermijden wondinfectie. OPMERKING: absorbeerbare en niet resorbeerbare hechtingen worden gebruikt. Niet absorbeerbare hechtingen worden verwijderd in 2 weken. Zijde wordt niet aanbevolen voor de sluiting huid omdat het gebruik ervan wordt geassocieerd met incisie infectie en lokale weefselreacties.
   2. Bilaterale transtympanic injectie
      1. Plaats de muis in de laterale decubitus positie en bereidt een aseptische chirurgische gebied onder de externe gehoorgang zoals beschreven in 4.3.1.1.
      2. Voeg een 0,5 cm longitudinale incisie in het verticale deel van de uitwendige gehoorgang dichtbij de tragus en seel de interne cutane vouw van de oorschelp (optioneel).
      3. Zoek het trommelvlies aan het eind van de uitwendige gehoorgang met een chirurgische microscoop (Figuur 2E) en identificeert de bovenste pars flaccida en de inferieure pars tensa, die in voorste en achterste gedeelten verdeeld door het handvat van de hamer (figuur 2F) .
      4. Maak een kleine myringostomy in het caudale deel van de pars flaccida. Maak een extra incisie in de pars tensa van het trommelvlies, de lucht evacuatie mogelijk te maken tijdens de injectie ^33. Injecteer voorzichtig 10-15 uL drager (CGP-hydrogel of RL) oplossing met een glazen micro injectiespuit verbonden met een 34 G katheter door de pars flaccida, dicht bij de RW nis totdat het middenoor duidelijk vol.
      5. Sluit de huid insnijdingen met een 5-0 zijden chirurgisch hechtdraad en schoon zoals beschreven in 4.3.1.7.
      6. Plaats de muis op de andere kant en operaten de contralaterale oor (stappen 4.3.2.1 tot 4.3.2.5).
4. Houd de muis op een verwarmingselement, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
5. Controleer de conditie, de activiteit en de eventuele tekenen van pijn of spanning. Analgetica leveren indien nodig (dat wil zeggen Buprenorfine 0,05 mg / kg, Carprofen 5-10 mg / kg). Geef je mening over de chirurgische wond dagelijks en verwijder de huid sluitingen 7-14 dagen na de operatie na te hebben vastgesteld dat de wond genezen is.

5. morfologische Evaluatie van Cochlear cytoarchitecture

1. Euthanaseren de muis aan het einde van het experiment (in dit werk 28 dagen postmicrosurgery), met een intraperitoneale overdosis pentobarbital (100 mg / kg) aan de lange termijn van de operatie te bestuderen.
2. Voer een transcardial perfusie met koude 0,1 M fosfaat-gebufferdZoutoplossing (PBS), pH 7,5, gevolgd door 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PBS, pH 7,5 zoals beschreven ^26.
   LET OP: Paraformaldehyde is zeer giftig; contact met de huid, ogen of slijmvliezen te voorkomen. Vermijd het inademen van het poeder tijdens de meting en voorbereiding.
3. Gebruik een stereomicroscoop om ontleden het binnenoor van het slaapbeen beschreven ^{34, 35} zonder scheiding van de vestibulaire en cochleaire componenten van het binnenoor.
4. Bevestig de geïsoleerde binnenoor met 4% (gew / vol) PFA in 0,1 M PBS, pH 7,5 bij 4 ° C gedurende 12 uur onder zacht schudden. 3x wassen gedurende 5 min met 0,1 M PBS, pH 7,5.
5. Ontkalken de monsters met 10% ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bereid in 0,1 M PBS, pH 6,5 bij 4 ° C gedurende 10 d onder constant schudden, veranderen de EDTA elke 3 d.
6. Wanneer cochleae een zachte consistentie te verwerven, te verwijderen EDTA en was 3x gedurende 5 min met 0,1 M PBS, pH 7,5, with schudden bij kamertemperatuur.
7. Insluiten de monsters in paraffine zoals beschreven ³⁴ en maak 7 pm dikke cochleaire secties parallel aan de modiolus.
8. Om cochleair cytoarchitecture, vlek secties met hematoxyline en eosine (H & E) ³⁰ te evalueren en gebruik een lichtmicroscoop verbonden met een digitale camera om beelden met 4X en 20X lenzen vast te leggen.

6. Cochlear Gene Expression

1. Reinig het werkoppervlak en chirurgische instrumenten met RNase decontaminatie oplossing.
2. Euthanaseren de muis, zoals beschreven in 5.1 en snel ontleden uit het binnenoor van het slaapbeen behulp van een microscoop. Dompel het binnenoor in een glazen schaaltje met ribonucleïnezuur (RNA) beschermer en stabilisator reagens.
3. Verwijder het resterende rotsbeen met juwelier pincet en voorzichtig scheiden het slakkenhuis van de vestibule met behulp van Vanna's eye schaar ^35.
4. onmiddellijk transfer het slakkenhuis in een 2 ml microcentrifugebuis met 80 pi RNA beschermer en stabilisator oplossing en vries het weefsel door het plaatsen van de buis in droogijs. Behouden cochleair monsters bij -70 ° C tot gebruik.
5. Isoleer cochleair RNA zoals beschreven ³⁵ en de kwaliteit en kwantiteit vast spectrofotometrisch.
6. Genereer cochleair cDNA uit gelijke hoeveelheden van de totale muis RNA met behulp van een reverse transcriptie commerciële kit.
7. Uitvoeren qRT-PCR aanvullende deoxyribonucleïnezuur (cDNA) amplificeren in drievoud gentranscripten ^{35, 36} te meten.
   LET OP: In dit werk pro- en anti-inflammatoire gen transcripties van Il1b, IL6, TGFB1, TNFa, Il10 en Dusp1 werden gemeten.
8. Bereken relatieve expressie verhoudingen door het normaliseren doelwit transcript cyclus drempel (CT) niveau aan het rekenkundig gemiddelde van de referentie-gen niveau en de relatieve kwantificatie door het normaliseren van deprobleemgroep transcript niveaus aan het rekenkundig gemiddelde van de kalibrator groep ^37.

Resultaten

Hoorzitting werd getest door ABR voor en op verschillende tijdstippen na microchirurgie om de impact op auditieve functie (figuur 1A) te evalueren. ABR registers werden uitgevoerd onder verdoving van dieren beweging en de spanning artefacten te voorkomen en daardoor verbeteren van de reproduceerbaarheid ^27. Intraperitoneaal ketamine gebaseerd combinaties of inhalatoire isofluraan werden gewoonlijk gebruikt om dieren te verdoven tijdens ABR proeven. De ketamine / xylazine combinatie levert een kortwerkend (2-3 min) inductie en een stabiel, veilig onderhoud fase tijdens het uitvoeren van ABR registers. Opgemerkt zij dat isofluraan kan beïnvloeden ABR meetgevoeligheid ^38. ABR registers worden subdermale elektroden in specifieke plaatsen (Figuur 1B) geplaatst en de elektrische impedantie wordt gemeten. Als de impedantie 3 kOhm of hoger elektrode positie moet worden gecontroleerd om te voorkomen altVeel voorkomende handelingen in ABR wave amplitude.

Intratympanic levering wordt uitgevoerd bij muizen door twee microchirurgische procedures (Figuur 2). Blootstelling van de bulla tijdens bullostomy gaat terugtrekken van de onderkaakspeekselklier en musculus digastricus. Deze procedure wordt uitgevoerd met uiterste zorg worden uitgevoerd, omdat de halsslagader en de nervus vagus zijn zeer dicht (Figuur 2A). Vervolgens wordt de bulla geboord stapediale de slagader en RW membraan (Figuur 2B) lokaliseren. Om te voorkomen dat het kraken van het bot, is een kleine 0,5 mm opening gemaakt met een 27 G naald alvorens boren. De katheter 34 G wordt via de bullostomy richting RW membraan en een klein volume medium wordt afgegeven op het venster niche (figuur 2C). De transtympanic injectie wordt uitgevoerd via een incisie in de pars flaccida van het trommelvlies met een 27 G naald; een grotere kunnen veroorzaken bijoor in het membraan. Voorafgaand aan de injectie, raden wij aan het maken van een extra incisie in de pars tensa om de uitstroom van lucht mogelijk te maken tijdens de injectie van het voertuig (figuur 2F). Het is cruciaal om beschadiging van de stapediale slagader, een tak van de interne halsslagader, wat zou leiden tot levensbedreigende bloeden te voorkomen.

Muizen met bullostomy of transtympanic operaties bewaard gehoor gedurende het experiment, vergelijkbaar met niet-geopereerde controles (figuur 3). ABR drempels in reactie op klikken en de toon uitbarstingen niet significant veranderen na microchirurgie in vergelijking met de uitgangswaarden. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen bullostomy en transtympanic benaderingen. Morfologische studies zijn uitgevoerd om correcte aflevering voertuig in het middenoor te bevestigen en de mogelijke veranderingen veroorzaakt door de procedures van cochleaire cytoarchitecture beoordelen. Geen enkele van de belangrijkste cochleair regio showed morfologische veranderingen en dieren uit beide procedures gepresenteerd een vergelijkbare morfologie van cochleaire structuren (Figuur 4A). Bovendien werden de cochleaire profielen van genexpressie van pro- en anti-inflammatoire cytokinen bestudeerd. Ondanks het gebrek aan functionele verschillen in ABR gegevens tussen de twee procedures, bullostomy veroorzaakte een sterkere ontstekingsreactie dan de transtympanic aanpak (Figuur 4B).

Figuur 1. Experimentele Design and Hearing Assessment. (A) Schematische weergave van de experimentele procedure. Hoorzitting werd geëvalueerd met ABR voor en na microchirurgie. Cochlear monsters werden verkregen 28 dagen na microchirurgie. (B) Verdoofd muis in buikligging over de verwarming pad in een geluiddempende kamer, met subdermale electrodes geplaatst in de hoofdhuid tussen de oren over de top van de schedel (actieve, positieve); in de parotis gebied onder de oorschelp (referentie, negatief) en in de rug (grond). De vrije-veld luidspreker wordt geplaatst op een vaste afstand (5 cm) naar het rechteroor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Microchirurgie voor Vehicle Application. (A) Ventraal aanzicht van het trommelvlies bulla. De bullostomy wordt uitgevoerd caudaal van de gezichtszenuw met een 27 G naald. (B) RWN en stapediale slagader kan worden waargenomen door de perforatie. (C) De 34 G katheter wordt via de bullostomy naar de RW niche. (D) Een maand na de bullostomy, een kleine benigelitteken is aanwezig in de opening plaats (pijlpunt). (E) Zijaanzicht van het oor, die de insnijding in de uitwendige gehoorgang en het trommelvlies (vierkant). (F) Detail van het trommelvlies. Een punctie werd gedaan op de caudale bovenste kwadrant van het trommelvlies met behulp van een 27 G naald (zwarte asterisk, in de pars flaccida); de injectie werd gedaan door middel van deze perforatie met behulp van een 34 G katheter. Een extra gat gemaakt in de schedelholte onderste kwadrant van het membraan (witte asterisk in de pars tensa) voorafgaand aan de injectie om de tympanische druk te herstellen. (G) Zicht op de 34 G katheter via de punctie van het trommelvlies. (H) Uitzicht op de cochleaire regio 24 uur na de microchirurgie. RWN gevuld met drageroplossing (asterisk). Lat, laterale; Ro, rostrale; Do, dorsale; Ma, hamer; Co, slakkenhuis; OW, ovale venster; RWN, ronde venster niche. Schaalbalken = 200 um in A, D, F; Schaalbalken = 100 urn in B, C, H; Schaal bars = 1,000 micrometer in E, G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Hoorzitting Assessment. Evolutie van ABR drempelwaarden (gemiddelde ± SEM, in dB SPL) in reactie te klikken (A) en tone burst (B) stimuli, vóór en 7, 14 en 28 dagen na micro-operatie bij mannelijke acht weken oude C57BL / 6J muizen. Bullostomy (oranje; n = 11); transtympanic injectie (blauw; n = 6); niet-bediende (grijs; n = 11), Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

jpg "/>
Figuur 4. Cochlear morfologie en genexpressie analyse. (A) Morfologie van de belangrijkste cochleaire structuren bij de basis van het slakkenhuis. Haematoxilin-eosine kleuring van mid-modiolar paraffine secties (7 pm), van de oren van niet-bediende muizen en muizen een maand na microchirurgie tussenkomst van bullostomy of transtympanic injectie. Het scala media compartiment (a, b, c) geeft alle hoofdcomponenten. Details van elk van deze structuren (genummerde vakken) getoond in de volgende afbeeldingen: ganglion spirale (1), orgaan van Corti (2), spiraalvormige ligament (3) en stria vascularis (4). Inner haar cel (asterisk); buitenste haarcellen (hoofd van de pijl). Schaal bar = 100 urn a, b, c; Schaalbalken = 50 urn in-1,2,3,4. (B) Cochlear expressie van ontstekingsfactoren 28 d na de microchirurgie. Vergelijking tussen bullostomy (oranje) en transtympanic injectie (blauw) en de niet-bediende muizen (wit). *: Niet-bediende vs.bediend groepen; ^: Vergelijking tussen groepen bediend. Genexpressie worden voorgesteld als 2 ^{- ΔΔCt} of de n-voudig verschil ten opzichte van niet-bediende group.Values worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van triplo from pool monsters van 3 muizen per conditie. Statistische significantie: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^{^^} P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Lokale geneesmiddelafgifte aan het binnenoor kan direct intracochleaire injectie of indirect gebeuren door intratympanic toediening, het plaatsen van het geneesmiddel in het middenoor ^{4, 19, 39.} Intracochlear administratie levert gecontroleerde en precieze drug delivery aan het slakkenhuis, het vermijden van diffusie door raam membranen, basale te apicale concentratie gradiënten en de klaring via de buis van Eustachius. Het is echter gewoonlijk een invasieve procedure die een complexe en delicate microchirurgie ^{7, 39} vereist. In dit verband is de ontwikkeling van nieuwe industrie, coating, implantaten voor langdurige geneesmiddelafgifte ^{40, 41.} Anderzijds, intratympanic toediening is een minimaal invasieve en eenvoudig uit te voeren procedure de injectie van grotere hoeveelheden van de d toestaatkleed in het middenoor, hoewel de farmacokinetiek is niet gemakkelijk te controleren. Het merendeel van het geneesmiddel wordt uitgeklaard buis van Eustachius en de resterende fractie moet diffunderen door het membraan naar de RW slakkenhuis ¹⁸ bereikt. RW is de site van de maximale absorptie van stoffen uit het middenoor in de-perilymfe gevulde trommelvlies duct van het slakkenhuis ^7. Het is een semipermeabel drielagenstructuur, hoewel de permeabiliteit afhankelijk van het geneesmiddel eigenschappen (grootte, concentratie, oplosbaarheid en elektrische lading) en transmembraan transportsystemen (diffusie, actief transport of fagocytose) ^42. De ovale venster en otic capsules zijn alternatief, maar minder effectief ingangen van slakkenhuis ^{43, 44.}

Hier laten we zien en vergelijking van twee microchirurgische methoden voor gerichte toediening van geneesmiddelen in de muis middenoor: bullostomy en transtympanic injectie procedures. Gemeenschappelijke kritische stappen om deze procedures omvatten: i) een evaluatie van het gehoor voor en na de microchirurgie, ii) het bereiden van een homogene voertuig oplossing onder steriele omstandigheden, iii) zorgvuldige controle van de anesthesieprocedure en bewaking van dierlijke lichaamstemperatuur en constanten, iv ) trage plaatsing van het juiste volume van het voertuig gericht op de RW, en iv) het nemen van cochleaire monsters naar moleculaire en morfologische analyse te voltooien.

Retroauricular en ventrale benaderingen bullostomy zijn beschreven ^{7, 45.} We gebruikten de ventrale onderlinge omdat onze ervaring heeft geresulteerd in minder morbiditeit en verschaft betere toegang tot de RW ^46. Transtympanic injecties worden meestal via de pars tensa van het trommelvlies uitgevoerd voor- of achterkant aan de hamersteel manubrium ^12. Indit werk hebben we een modificatie van de techniek een injectie door de pars flaccida buiten de hamer met een eerdere aanvullende punctie van de pars tensa lucht kunnen verlaten tijdens de injectie.

De transtympanic injectie was minder invasief dan de bullostomy, hoewel beide microsurgeries waren snel (20 en 5 minuten per oor voor bullostomy en transtympanic benadering respectievelijk), met korte postoperatieve herstel tijden en geen morbiditeit. Belangrijker, zowel hanteert gehoor en ABR parameters waren identiek aan die bepaald voor de microchirurgie. De transtympanic aanpak kost minder tijd dan de bullostomy en kan in beide oren van hetzelfde dier worden uitgevoerd tijdens dezelfde ingreep. Eigenschappen transtympanic injectie derhalve dat bilateraal kan worden uitgevoerd en herhaald, indien nodig. Anderzijds, bullostomy biedt rechtstreekse visuele toegang tot de RW membraan en laat de Filling van het RW niche. In tegenstelling, heeft transtympanic injectie niet toe dat voor de controle van de plaatsing voertuig in de RW niche.

De procedures die in dit werk te beschrijven hoe een lokale drug voertuig levering aan het middenoor voor pre-klinische toepassingen uit te voeren, zoals de evaluatie van ototoxiciteit en de evaluatie van de werkzaamheid in gehoorverlies. Twee microchirurgische procedures beschreven die alternatieve werkwijzen specifieke voor- en nadelen geven. Zowel het behoud van het gehoor en geen morfologische veranderingen veroorzaken. Lokale ontsteking wordt beschreven als een mogelijke complicatie van bullostomy. Een set van complementaire technieken zijn ook beschreven voor postoperatieve procedures, met inbegrip van gehoor, morfologische en inflammatoire marker expressie evaluaties. Toekomstige toepassingen van deze technieken omvatten het preklinische evaluatie van nieuwe therapieën voor gehoorverlies, zoals genetische, cellulaire en farmacologische benaderingen in diermodellen. Intratympanic administrationen zorgen voor de levering van de behandeling in het middenoor, in contact met het ronde venster membraan, het vergemakkelijken van de overgang naar de perilymfe zonder duidelijke cochleair schade.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ketamine (Imalgene)	Merial	# 2529	VOORZICHTIG: vermijd contact van het medicijn met huid of ogen of per ongeluk zelf toegebrachte injecties
Xylacine (Xilagesic)	Calier	# 6200025225
Ooggel smering (Artific)	Angelini	# 784710
Waterpomp	Gaymar	# TP472
Oppervlaktedesinfectiemiddel	José Collado SA	# CR-36
Subdermale naaldelelektroden	Spes Medica	# MN4013D10SM
Low Impedance Headstage  (RA4LI)	Tucker-Davis Technologies
Luidsprekers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker)	Tucker-Davis Technologies
System 3 Evoked Potential Workstation	Tucker-Davis Technologies		Het systeem bestaat uit: RP2 processor, RA16 basisstation, PA5 attenuator, SA1 versterker, MA3 microfoonversterker, RA4LI impedantie headstage en RA4A medusa voorversterker
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
Verwarmende pads (TP pads)	Gaymar	# TP3E
Statistiek software (SPSS)	IBM
Chitosan (gedeacetyleerd)	Sigma-Aldrich	# C3646
Azijnzuur (glaszuur)	VWR	# 20103.295	VOORZICHTIG: ontvlambare vloeistof, huidcorrosie, ademhalings- en huidsensitivisator
Glycerofosfaat	Sigma	# SLBG3671V
Ringer's lactaat buffer	Braun	# 1520-ESP
Medetomidine (Domtor)	Esteve	# 02400190
Fentanyl (Fentanest)	Kern Pharma	# 756650.2	VOORZICHTIG:   vermijd contact van het medicijn met open wonden of per ongeluk zelf toegebrachte injecties
Isofluraan (IsoVet)	Braun	# 469860	VOORZICHTIG: vermijd blootstelling aan plafondconcentraties groter dan 2 ppm van enig gehalogeneerd anesthetisch middel gedurende een monsterperiode die niet langer mag zijn dan 1 uur.
Chirurgisch microscoop (OPMI pico)	Zeiss
Steriele scherm (Foliodrape)	Hartmann	# 277546
Sterilisator	Fine Science Tools	# 18000-45
Scalpelmes	Swann Morton	# 0205	VOORZICHTIG
Scalpelgreep	Fine Science Tools	# 91003-12
Povidonjodium-gebaseerd antisepticum (Betadine)	Meda Pharma SAU	# M-12207
Advenitia schaar (SAS18-R8)	S&T	# 12075-12
Gebogen schaar	CM Instrumente	# AJ023-18
Pincet	CM Instrumente	# BB019-18
Gelatine spons (Spongostan)	ProNaMAc	# MS0001
Microlance 27 G	Becton Dickinson	# 302200
Microliter spuit (701 RN SYR)	Hamilton	# 80330
Katheter (Microfil 34 G)	World Precision Instruments	# MF34G-5
Weefselkleefstof (Vetbond)	3M	# 1469SB
Naaldhouder (Rond handvat naaldhouder)	Fine Science Tools	# 12075-12
Zijde chirurgische hechtdraad (Gevlochten Zijde 5/0)	Arago	# 990011
Chlorhexidine (Cristalmina)	Salvat	# 787341
Pentobarbital  (Dolethal)	Ventoquinol	# VET00040	VOORZICHTIG:   vermijd contact van het medicijn met open wonden of per ongeluk zelf toegebrachte injecties
Stereomicroscoop (Leica)	Meyer Instruments	# MZ75
Vannas Micro-dissectie (Oog) Schaar Veeractie	Harvard Apparatus	# 28483
Juwelierstang (Dumont)	Fine Science Tools	# 11252-00
RNase Decontaminatieoplossing  (RNaseZap)	Sigma-Aldrich	# R2020
RNA Stabilisatieoplossing  (RNAlater)	Thermo Fisher Scientific	# R0901
RNA-zuivering kit (RNeasy)	Qiagen	# 74104
cDNA Reverse Transcriptie Kit	Thermo Fisher Scientific	# 4368814
Genexpressie assay (TaqMan sondes)	Thermo Fisher Scientific	Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1
Real-time PCR Systeem (7900HT)	Applied Biosystems	# 4329001
Paraformaldehyde (PFA)	Merck	# 1040051000	TOXIC: PFA is een potentieel carcinogeen
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Merck	# 405491	VOORZICHTIG:  schadelijk bij inademing, kan schade aan de ademhalingswegen veroorzaken door langdurige of herhaalde blootstelling als ingeademd.
Hematoxyline oplossing	Sigma-Aldrich	# HHS16
Eosine Y	Sigma-Aldrich	# E4382	Gevaar: veroorzaakt ernstige oogirritatie