Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54967

⸱

26 april 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit rapport beschrijft een werkwijze biotechnologie ontwerpen en bouwen van nieuwe kunstmatige splicingfactoren (ASFS) die specifiek de splitsing van doelgenen te moduleren in zoogdiercellen. Deze werkwijze kan verder worden uitgebreid met verschillende kunstmatige engineering factoren andere aspecten RNA metabolisme manipuleren.

Samenvatting

De verwerking van de meeste eukaryote RNA wordt gemedieerd door RNA-bindingseiwitten (RBPs) met modulaire configuraties, met inbegrip van een module RNA herkenning, dat specifiek bindt aan de pre-mRNA target en een effector domein. Eerder hebben we gebruik van de unieke RNA bindingsmodus van de PUF-domein genomen humaan Pumilio 1 aangeleerde RNA-bindende scaffold, dat werd gebruikt om verschillende kunstmatige RBPs ingenieur RNA metabolisme manipuleren genereren. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven Engineered splicingfactoren (ESFT) die speciaal zijn ontworpen om de alternatieve splicing van doelgenen te moduleren construeren. Het protocol omvat het ontwerpen en bouwen van een aangepaste PUF matrix voor een specifiek RNA-doelwit, hoe een ESF expressieplasmide te construeren door het fuseren ontwerper PUF domein en een effector domein en hoe ESFT om de splitsing van doelgenen te manipuleren. In de representatieve resultaten van deze methode, hebben we ook beschreven gemeenschappelijke assaysVan ESF-activiteiten met behulp van splicing verslaggevers, de toepassing van ESF in gekweekte menselijke cellen, en het daaropvolgende effect van splicing veranderingen. Door de gedetailleerde protocollen in dit rapport te volgen, is het mogelijk om ESF's te ontwerpen en te genereren voor de regulering van verschillende typen Alternative Splicing (AS), waarbij een nieuwe strategie wordt gegeven om splicing regulatie te bestuderen en de functie van verschillende splicing isoforms te bestuderen. Bovendien kunnen onderzoekers kunstmatige factoren richten op specifieke RNA's om verschillende stappen van RNA-verwerking te manipuleren door verschillende functionele domeinen te combineren met een ontworpen PUF-domein.

Inleiding

De meeste menselijke genen ondergaan alternatieve splicing (AS) met meerdere isovormen te produceren met verschillende activiteiten, die sterk de coderende complexiteit van het genoom 1, 2 is toegenomen. AS een hoofdbestanddeel mechanisme om genfunctie te reguleren, en wordt strak gereguleerd via diverse transductie in verschillende cellulaire en ontwikkelingsstadia 3, 4. Omdat splicing misregulation is een veel voorkomende oorzaak van ziekte bij de mens 5, 6, 7, 8, gericht splicing regelgeving wordt steeds een aantrekkelijke therapeutische route.

Volgens een vereenvoudigd model van splicing verordening AS wordt voornamelijk bepaald door splicing Regulatory cis Elementen (SRE) in pre-mRNA splicing die fungeren als enhancers of silencers alternatieve exons. thEse SREs recruteren specifiek verschillende transactieve eiwitfactoren ( dwz splitsingsfactoren) die de splitsingsreactie 3 , 9 bevorderen of onderdrukken. De meeste transacterende splitsingsfactoren hebben afzonderlijke sequentiespecifieke RNA bindende domeinen om hun doelen en effector domeinen te herkennen om splicing te beheersen. De bekendste voorbeelden zijn de leden van de serine / arginine-rijke (SR) eiwitfamilie die N-terminale RNA-herkenningsmotieven (RRM's) bevatten, die exonische splicing enhancers binden en C-terminale RS domeinen die exon-inclusie 10 bevorderen . Omgekeerd bindt hnRNP A1 aan exonische splicing silencers via de RRM domeinen en remt exon inclusion door een C-terminale glycine-rijke domein 11 . Met behulp van dergelijke modulaire configuraties moeten onderzoekers artificiele splitsingsfactoren kunnen manipuleren door een specifiek RNA-bindend domein (RBD) te combineren met verschillende effectenTor domeinen die splicing activeren of remmen.

De sleutel van zo'n ontwerp is het gebruik van een RBD die bepaalde doelstellingen herkent met programmeerbare RNA-bindingsspecificiteit, die analoog is aan de DNA-bindende modus van het TALE-domein. Echter, de meeste inheemse splicing factoren bevatten RRM of K Homology (KH) domeinen, die korte RNA-elementen met zwakke affiniteit herkennen en dus een voorspellende RNA-eiwitherkenning "code" 12 ontbreken. De RBD van PUF-herhalingsproteïnen ( dwz het PUF-domein) heeft een unieke RNA herkenningsmodus, waardoor de herontwikkeling van PUF-domeinen specifiek herkenbaar is voor verschillende RNA-doelen 13 , 14 . Het canonische PUF-domein bevat acht herhalingen van drie a-helices, die elk een enkele basis in een 8-nt RNA doel herkennen. De zijketens van aminozuren in bepaalde posities van de tweede α-helix vormen specifieke waterstofverbindingen met de Watson-Crick rand van tHij rna basis, die het RNA bindingsspecificiteit van elke herhaling (figuur 1A) bepaalt. De code voor RNA-basen herkenningsplaats van de PUF repeat verrassend eenvoudig (figuur 1A), waardoor de vorming van PUF domeinen mogelijke 8-base combinatie (beoordeeld door Wei en Wang 15) herkennen.

Deze modulaire constructieprincipe maakt het genereren van een Engineered Splicing factor (ESF) bestaande uit een aangepaste PUF domein en een domein splicing modulatie (dwz een SR-domein of een Gly-rijke domein). Deze ESFT kan functioneren als zowel splicing activatoren of remmers verschillende soorten splicing gebeurtenissen controleren, en zij nuttig gebleken als instrumenten om de splitsing van endogene genen betrokken bij menselijke ziekten 16, 17 te manipuleren. Als voorbeeld hebben we PUF-Gly-type ESFT geconstrueerd om specifiek af aan het lassen van de Bcl-xL genOmzetten van de anti-apoptotische lange isovorm (Bcl-xL) tot het pro-apoptotische korte isovorm (Bcl-xs). Het verschuiven van de verhouding van de Bcl-x isovorm volstond om verschillende kankercellen sensibiliseren voor meerdere anti-kanker chemotherapie geneesmiddelen 16, wat suggereert dat deze kunstmatige factoren bruikbaar als potentiële therapeutische reagens kunnen zijn.

Naast het beheren splicing bekende splicing effector domeinen (bijvoorbeeld een RS of Gly-rijke domein), kunnen de gemanipuleerde PUF factoren ook gebruikt worden om de activiteiten van nieuwe splicing factoren onderzocht. Bijvoorbeeld met gebruikmaking van deze benadering hebben we aangetoond dat het C-terminale domein van verschillende SR eiwitten kunnen activeren of remmen splitsing bij binding aan verschillende pre-mRNA gebieden 18, die de alanine-rijke motief van RBM4 splicing 19 kan remmen, en dat de proline-rijke motief van DAZAP1 kan splicing 20, 21 te verbeteren </ Sup>. Deze nieuwe functionele domeinen kunnen worden gebruikt om extra typen kunstmatige factoren verfijnen splicing construeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Constructie van een PUF Steiger met aangepaste RNA-bindende specificiteit door overlappende PCR

  1. Ontwerp een reeks PCR-primers die de PUF sequenties die specifiek verschillende RNA nucleotiden herkennen in elke positie 12 (zie Tabel 1 voor de primersequenties en zie Figuur 1A de RNA: PUF herkenningscode). Voor elke herhaling PUF, ontwerp vier verschillende primers om een ​​andere base op elke positie te herkennen.
    Opmerking: Deze primers worden gebruikt in een reeks van vier ronden van PCR reacties PUF fragmenten die aan elkaar zijn verbonden (figuur 1B) te genereren.
  2. Selecteer de erkenning plaats van het doelwitgen in de buurt van de alternatieve splice website.
    LET OP: Deze site kan worden beslist door de gebruiker, en meestal wordt gekozen binnen 10-50 nt van de alternatieve splice sites.
  3. Ronde 1: genereren coderende sequenties4 PUF herhalingen, universele brug fragmenten en fragmenten cap.
    1. Gebruik de beoogde plaats voor de erkenning code te definiëren voor elke herhaling van de aangepaste PUF. Selecteer het PCR primers voor PUF herhalingen 1 - 8. Gedrag vier opeenvolgende ronden van PCR om een aangepaste PUF domein te produceren, zoals hieronder beschreven (figuur 1B).
    2. In de eerste ronde van PCR ingestelde standaard PCR-reactiemengsels (dat 2,5 pl van 10x buffer, 0,5 ui 10 mM dNTP's, 0,5 pl 10 pM voorwaartse en reverse primers, 50 ng van het DNA-matrijs (humaan cDNA of expressievector WT PUF domein) en 0,5 U high-fidelity DNA polymerase in een 25 pl eindvolume).
      Opmerking: Deze reacties zullen DNA-sequenties die overeenkomen met elke herhaling PUF, universele brug fragmenten en twee cap fragmenten met verschillende restrictieplaatsen (figuur 1B). Een korte lijst met sjablonen, primersEn gegenereerde PCR-producten die in deze stap worden getoond in Tabel 2.
    3. Stel het PCR-programma als volgt: 5 min bij 95 ° C; 28 cycli van 30 seconden bij 95 ° C, 30 seconden bij 55 ° C en 15 s bij 72 ° C; en 5 min incubatie bij 72 ° C. Gebruik high-fidelity DNA polymerase om puntmutaties te minimaliseren gedurende PCR.
  4. Ronde 2: Genereer coderende sequenties voor R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) en R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. Scheid de PCR producten verkregen in stap 1.3.3 behulp van elektroforese met een 1,5% agarosegel (25 minuten bij een constante spanning van 120 V). Gel-zuiveren van alle producten van de verwachte grootte met behulp van een gel zuivering kit. Gebruik een ander mengsel van deze producten als matrijs in de volgende ronden van PCR.
      OPMERKING: Meng de drie PCR-producten in een vrijwel 1: 1: 1 verhouding. Ze hebben meestal hoeven niet te worden gekwantificeerd, zolang de intensiteit van elk product lijkt in de gel.
    2. Meng ongeveer 5% van de gezuiverde PCR producten als een temPlaatje in de volgende ronde PCR. Alternatief, kwantificeer de gezuiverde PCR producten met behulp van een UV-Vis spectrofotometer en gebruik 15 ng van elk PCR product in het sjabloon mengsel.
    3. Gebruik gezuiverde PCR producten R1 / R2, R3 / R4 en Bridge 2/3 als gemengde sjablonen en R1-F en R4-R als primers. Stel de PCR-reactie op zoals beschreven in stap 1.3 om overlappend PCR-product R1-4 te verkrijgen.
    4. Gebruik gezuiverde PCR-producten R5 / R6, R7 / R8 en Bridge 6-7 als gemengde sjablonen en R5-F en R8-R als primers om overlappend PCR-product R5-8 te verkrijgen ( Figuur 1B ). Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 30 s bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C. Gel-zuiveren R1-4 en R5-8.
  5. Ronde 3: Genereer coderende sequenties voor R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 zonder caps).
    1. In de derde ronde PCR, met gebruikmaking van de gezuiverde R1-4, R5-8 en Bridge 4/5 als gemengde templates en R1-F enR8-R als primers, zet de PCR-reactie op zoals beschreven in stap 1.3 om overlappend PCR-product R1-8 zonder caps te verkrijgen.
    2. Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 55 s bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C. Gel-zuiver de R1-8 zonder caps.
  6. Ronde 4: Genereer coderende sequenties voor complete PUF domeinen.
    1. In de laatste ronde PCR, gebruik de gezuiverde R1-8 zonder caps en 5'-end en 3'-end caps als gemengde templates en Cap-F en Cap-R als primers, stel de PCR-reactie op zoals beschreven in stap 1.3 Om de uiteindelijke gemuteerde PUF domeinen te verkrijgen.
    2. Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 1 min bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C.
    3. Gel-zuiveren de PCR-producten van de laatste herprogrammeerde PUF domeinen. Gebruik deze producten voor de constructie van het ESF expressie plasmide in de volgende stappen. SequEnce het laatste construct om de herprogrammeerde sequenties van PUF domeinen te verifiëren.
      OPMERKING: Cap-F codeert NLS (PPKKKRKV) tussen BamH I en Xba I sites en Cap-R codeert voor een stopcodon en de Sal I site (restrictieplaatsen zijn ontworpen voor het vormen van expressievectoren van ESFs, Figuur 1C).

2. Opbouw van een functionele module van ESF's

  1. Twee strategieën worden vaak gebruikt om functionele modules van ESF's (RS-domeinen of Gly-rich-domeinen) te klooneren: deze domeinen te amplificeren met behulp van PCR met behulp van totaal menselijk cDNA als een template (stap 2.2) of om de DNA-fragmenten die voor verschillende RS-codes codeert rechtstreeks te synthetiseren Of Gly-rijke domeinen (stap 2.3).
  2. Gebruik PCR om RS-domeinen te kloonen van residuen 123 - 238 van 9G8 (NP001026854), residuen 180-272 van SRP40 (NP008856), of residuen 117-221 van SC35 (NP003007). Clone Gly-rijke domeinen van residuen 195 - 320 van hnRNP A1 (NP_002127), residuS 203 - 353 van hnRNP A2 (NP112533), of resten 211 - 378 van hnRNP A3 (NP919223).
    1. Gebruik het NCBI primer design tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) of Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) om primers te ontwerpen voor Klonen van RS-domeinen of Gly-rich domeinen (functionele module van ESF's).
      OPMERKING: De voorwaartse primer bevat een N-terminale FLAG-tag na de Nhe I-site. De omgekeerde primer bevat een BamHI plaats voor het klonen in expressievectoren ( Figuur 1C).
    2. Stel de standaard PCR-reactie op, zoals beschreven in stap 1.3, om de RS- of Gly-rijke domeinen te amplificeren. Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 30 s bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C.
  3. Clone RS domeinen of Gly-rich domeinen door middel van directe DNA synthese. In plaats van het genereren van PCR-producten die coderen voor de effector domeinen in stap 2.2, syntheGrootte een oligonucleotide dat codeert voor een kortfragment RS domein (RSRSRSRSRSRS) of een Gly-rich domein (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) met behulp van een commerciële bron van DNA-oligonucleotiden.

3. Constructie van ESF Expression Plasmids

  1. Construeer ESF expressie plasmiden met behulp van elke expressievector.
    OPMERKING: Een expressieconstruct pGL-Gly-MS2 (een cadeau van dr. R. Breathnach van het Instituut de Biologie-CHR 11 ) werd oorspronkelijk gebruikt, die codeert van de N- tot de C-terminale, een FLAG-epitoop, een Gly -rich domein van hnRNP A1, en het MS2 coat protein. Daarom wordt dit expressieconstruct als voorbeeld gebruikt in de volgende stap.
    OPMERKING: Andere expressievectoren met meerdere kloneringsplaatsen kunnen ook worden gebruikt, en de standaardkloneringsstappen zullen worden toegepast om samen de fragmenten aan te sluiten.
  2. Digest 1,5 μg van de expressieplasmiden (pGL-Gly-MS2) genoemd in stap 3.1 om het MS2-coat-eiwitfragment te verwijderen. Gebruik de restrictieEndonucleasen BamHI en SalI gedurende 1 uur bij 37 ° C. Digest de herkenningsmodule van ESF's (coderen voor een NLS en herprogrammeerde PUF domeinen, gegenereerd in stap 1.5) met BamH I en Sal I in dezelfde staat.
  3. Voeg 5x laadkleuren toe aan de restrictieverwerkende reacties en langzaam elektroforeseer het totale volume met een 1,5% agarosegel die een DNA gelvlek bevat gedurende 40 minuten bij 120 V. Geluidsgeur de verteerde producten.
  4. Bereid 10 μL ligatie reacties op met een gezuiverde herkenningsmodule van ESF inserts en expressie vector DNA in een 3: 1 verhouding, 1 μL DNA ligase en 1 μl 10x ligatie buffer. Incubeer de ligeringsreacties overnacht bij 4 ° C; Het resulterende construct expresseert een Gly-PUF-type ESF (pGL-Gly-PUF) onder controle van een CMV promotor ( Figuur 1C).
  5. Verwijder het fragment dat codeert voor het FLAG / Gly-rijk domein met Nhe I en BamH I digestie gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vervang het met een fragment dat codeert voor het RS domein (gegenereerd in stap 2.2, ook verteerd door Nhe I en BamH I); Het resulterende construct expresseert een RS-PUF-type ESF ( Figuur 1C).

4. Constructie van de Splicing Reporter

  1. Synthese oligonucleotiden die de kandidaatsequenties bevatten ( dwz doelsequenties van PUF-domeinen) die flankeren door XhoI- en ApaI- plaatsen of XhoI- en EcoRl-plaatsen. Ontleed de oligonucleotiden gedurende 5 minuten bij 55 ° C om dubbelstrengde inserts te verkrijgen die de herkenningsplaatsen van PUF-domeinen bevatten die door de cohesieve einden van XhoI- en Apa I- of XhoI- en EcoRl-plaatsen flankeren.
  2. Begin van een eerder beschreven modulair splicing reporter 22 , pGZ3, die twee GFP exonen bevat die gescheiden zijn door een test exon (exon 12 van de menselijke IGF2BP1, Ensembl ID ENSG00000159217) en zijn flankerende introns.
    OPMERKING: De testexon werd geconstrueerd met Xho I en Apa I sites, die gebruikt kunnen worden om gesynthetiseerde oligonucleotiden te bevatten die de kandidaatsequenties bevatten (doelsequenties van PUF domeinen). Deze modulaire splicing reporter (pGZ3) wordt door het Add-gen van het plasmide-repository verschaft.
  3. Digest de base reporter pGZ3 (bereid in stap 4.2) met de Xho I en Apa I restrictie endonucleasen gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  4. Gel-zuiveren de verteerde producten zoals beschreven in stap 3.3.
  5. Bereid 10 μl ligeringsreacties op met de dubbelstrengige inserts die gegenereerd werden in stap 4.1 en de verteerde pGZ3-vector die bij stap 4.4 werd gegenereerd in een 3: 1 molaire verhouding, 1 μl DNA-ligase en 1 μl 10x ligatiebuffer. Incubeer de ligeringsreacties overnacht bij 4 ° C om de constructie-splitsende reportervector pGZ3 te verkrijgen.
  6. Plaats de dubbelstrengige inzetstukken die in stap 4.1 zijn gegenereerd in de vorigegepubliceerd reporters Pez-1B (via Xho I en EcoR I plaatsen) en PEZ-2F (via Xhol en Apal sites) 23, om de concurrerende 5' krijgen ss reporter en de concurrerende 3'ss reporter, zoals beschreven in stap 4.3-4.5.
    OPMERKING: Beide typen splicing reporters zullen beschikbaar zijn via Add-gen.

5. Constructie van Lentiviral expressievectoren voor ESF

  1. Stel de standaard PCR-reactie zoals beschreven in stap 1.3 de volledige lengte ESFT van de oorspronkelijke expressievectoren (pGL-Gly-PUF of pGL-RS-PUF) met primers die MluI / SpeI plaatsen amplificeren. Stel het PCR-programma als volgt: 5 min bij 95 ° C; 28 cycli van 30 seconden bij 95 ° C, 30 seconden bij 55 ° C en 1,5 min bij 72 ° C; en 5 min bij 72 ° C.
  2. Via een ontsluitingsreactie, gelzuivering, en ligatiereactie, integreren ESFS in het lentivirale expressievector pWPXLd tussen de Mlu I / Spe I sites, zoals beschreven in stappen 3.2-3.4.
  3. Gebruik de standaard calcium fosfaat precipitatie methode, zoals eerder gerapporteerd 24 , om lentivirussen te genereren door cc-transfectie van HEK293T cellen door de vectoren, psPAX2 en pMD2.G te verpakken, met ofwel pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF Wt) (als specificiteitscontrole), of pWPXLd-GFP (mock).
    1. Zaad 5x10 6 HEK293T cellen in 10 cm gerechten en groei de cellen 's nachts in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), aangevuld met 10% Fetal Bovine Serum (FBS) per schotel in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 . Voer de transfectie uit wanneer de cellen 70 tot 90% samenvloeien.
    2. Bereid het plasmide mengsel door de drie plasmiden toe te voegen (7,5 μg van de verpakkingsvector, psPAX2; 2,5 μg pMD2.G; en 10 μg van hetzij pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (wt) , Of pWPXLd-GFP) aan een 2 ml buis.
    3. Voeg 560 μl 0,25 M CaCl toe2 en 560 μL 2x BBS oplossing aan de 2-ml buis. Meng verscheidene malen zachtjes en incubeer het gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om het transfectiemengsel te bereiden.
    4. Voeg alle transfectie mengsels toe aan de 10 cm-schotels. Wissel de afzettingen zachtjes en incubeer ze overnacht bij 3% CO 2 en 37 ° C.
    5. Verwijder het medium, voeg 10 ml frisse DMEM toe met 2% FBS aan elk gerecht, en incubeer ze bij 10% CO 2 en 37 ° CO / N.
    6. Verzamel de eerste supernatant uit de afwas. Voeg 10 ml frisse DMEM toe met 2% FBS aan elk gerecht. Incubeer de afwas O / N bij 10% CO 2 en 37 ° C. Bewaar het supernatant bij 4 ° C.
    7. Verzamel de tweede supernatant uit de afwas. Pool de supernatant van de eerste en tweede oogst. Verwijder de supernatant van celresten door het filter te filteren via een 0,4 μm filter. Gebruik de gecontroleerde supernatant direct of opslaan bij -80 ° C.
  4. Bepaal de titer van de lentivirus door HEK2 te infecteren93T cellen met seriële verdunningen van het viruspreparaat, zoals eerder gemeld 25 .

6. Specifiek modulerende Exon Inclusion en het alternatieve gebruik van Splice Sites met ESFs

  1. Zaad 2 x10 5 HEK293T cellen in elke put in een 24-putjesplaat. Groei de cellen 's nachts in 500 μl DMEM aangevuld met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Meng het liposomale transfectie-reagens door de flessen voorzichtig te omkeren. Verdun 2 μL liposomaal transfectie-reagens in 50 μl gereduceerd serummedium. Meng het voorzichtig en incubeer ze gedurende 5 minuten bij RT.
  3. Verdun 0,04 μg pGL-Gly-PUF expressievectoren en 0,2 μg pGZ3-reporterplasmiden in 50 μl gereduceerd serummedium in een steriele buis. Verdun 0,4 μg pGL-RS-PUF expressievectoren en 0,2 μg pGZ3-reporterplasmiden in 50 μl gereduceerd serummedium in een steriele buis. Dilute 0,4 ug pGL-RS-PUF expressievectoren en 0,2 ug Pez-1B of Pez-2F reporterplasmiden in 50 ui gereduceerd serum medium in een steriele buis.
  4. Na 5 minuten incubatie bij KT, meng het verdunde liposomale transfectie reagens bereid in stap 6.2 met verdund plasmiden bereid in stap 6.3. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voeg de gehele transfectie mengsels die de expressie vectoren en transfectie reagens bereid in stap 6.4 aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 12 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  6. Na 12 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2, gooi het medium uit elk putje en wassen met 500 pl fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) / well.
  7. Gooi de PBS en voeg 200 ul trypsine aan elk putje. Incubeer de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5 minuten. Voeg 1 ml van het medium aan de di stoppengestion en overbrengen van de cellen naar een steriele 1,5 ml buis.
  8. Centrifugeer de buisjes gedurende 3 min bij 5.000 xg en gooi het medium. Voeg 0,5 ml RNA-extractiebuffer per buis om de cellen door herhaalde pipetteren lyseren. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende 5 min.
  9. Voor elk RNA-extractie-buffer behandelde monster, voeg 0,1 ml chloroform per 0,5 ml RNA-extractiebuffer. Keren de buizen gedurende 15 s en incubeer ze gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Centrifugeer de buisjes gedurende 15 min bij 12.000 xg en 4 ° C. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. Voeg 0,25 ml isopropanol 0,5 ml per RNA extractiebuffer toegepast voor de initiële homogenisatie.
  11. Door vortexen gemengd en incubeer ze bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer de buisjes bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Na centrifugeren, het RNA neerslag gewoonlijk zichtbaar op de bodem van de buis.
  12. Verwijder het supernatant en was de RNA-pellet met 0,5 ml 75% ethanol per 0,5 ml RNA-extractiebuffer.
  13. Vortex krachtig en centrifugeer deze bij 7,500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en droog de RNA pellet. Los het RNA op in 50 μl RNase-vrij water.
  14. Voeg 2 μL 5U / μL DNase I, 7 μL 10x buffer en 11 μL H20 toe aan elke 50 μL RNA oplossing. Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Hitte ze bij 70 ° C gedurende 15 minuten om de DNase te inactiveren.
  15. Voor elk monster voeg de volgende componenten toe aan een 0,2 ml nuclease-vrije buis: 1 μL 50 μM oligo dT, 5 μl 400 ng / μL RNA (2 μg), 1 μl 10 mM dNTP en 3 μl H 2 O. Voer de omgekeerde PCR uit.
    1. Verhit het mengsel gedurende 5 minuten tot 65 ° C en incubeer het op tenminste 2 minuten op ijs om de secundaire structuur te hervormen. Voeg de volgende componenten toe aan dezelfde buis: 4 μl 5x eerste strandbuffer, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl 200 U / μL omgekeerde transcriptase en 4 μl H 2 </ Sub> O. Meng door voorzichtig pipetteren en neer en incubeer bij 50 ° C gedurende 60 min. Stop de reactie door gedurende 15 minuten te verhitten bij 70 ° C.
  16. Voor elk monster, de volgende componenten aan een PCR buis om het lichaam gemerkte PCR ronden: 2,5 pl 10x PCR-buffer, 0,5 ui 10 mM dNTP mix, 1 ui van 10 uM voorwaartse primer, 1 pl 10 pM reverse primer, 0,25 pl van 5 U / ul Taq DNA-polymerase, 0,5 pl 25 nM Cy5-dCTP en 2 pi van het cDNA bereid in stap 6.15.
    1. Verwarm de reactie tot 94 ° C gedurende 2 minuten om de moleculen denatureren Voer 25 PCR cycli (94 ° C gedurende 30 s, 60 ° C 30 s en 72 ° C 30 s), houdt de reactie bij 72 ° C 7 min, en laat het op een greep 4 ° C.
  17. Los de PCR producten door elektroforese door een 10% polyacrylamidegel met 1x Tris base, Boorzuur en EDTA (TBE) buffer. Uitvoeren van een scan met een fluorescentie scanner. Meet dehoeveelheid van elke isovorm splicing densitometrie onder toepassing van een software.

7. Gebruik ESF moduleren Endogene Bcl-x Splicing en meet de effecten op apoptose

  1. Plaat 2 x 10 5 HeLa-cellen aan elk putje van een 24-wells plaat. Groeien de cellen overnacht in 500 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Na 12 uur transfecteren van de cellen met 2 ug pGL-Gly-PUF (WT) of 0,2 ug, 1 ug, 2 ug pGL-Gly-PUF (531) (a geherprogrammeerd PUF domein herkent dat Bcl-x pre- mRNA met een hoge affiniteit, zie figuur 2A).
  3. 24 uur later te oogsten van de cellen. 1/3 van de cellen voor RNA-isolatie en PCR-analyse (stappen 6,8-6,17) en 2/3 zijn van eiwit isolatie.
  4. Voor de Western blot-analyse, kook de totale celpellets in 2X natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) laadbuffer gedurende 10 minEn vervolgens het oplossen van de eiwitten in een 12% SDS-PAGE gel. Overdracht van de eiwitten op een nitrocellulose membraan.
  5. Blokkeer het membraan met 5% melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en incubeer het membraan O / N met Caspase-3 (1: 1000), PARP (1: 1000), of beta-actine (1: 5000) primaire antilichamen (verdund in 5% melk) bij 4 ° C.
  6. Spoel het membraan met PBS dat 0,1% Tween 20 (PBS-T) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur 3x op een rocking shaker. Incubeer het membraan met aan HRP gekoppelde antilichamen (1: 5.000 verdund in 5% melk) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Spoel het membraan met PBS-T 3x bij kamertemperatuur, en vervolgens ontwikkelen van de membraan onder toepassing van ECL Western blotting detectie reagentia.
  8. Voeg 250 ul van poly-L-lysine (PLL) op dekglaasjes, incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en sifon van de vloeistof. Was de PLL-beklede dekglaasjes met PBS 3 x 5 minuten elk. Voor de immunofluorescentie assay die apoptose zaad 5 x 10 5 cellen op HeLa-polylysine gecoate dekglaasjes in een 6-wells plaat. transfecteren pGL-Gly-PUF (WT) of pGL-Gly-PUF (531) plasmiden in de HeLa-cellen met behulp van een liposomaal transfectiereagens (zie stap 6,1-6,5).
  9. 24 uur na de transfectie, bevestig de cellen op de dekglaasjes met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. WAARSCHUWING: PFA is giftig; ga er voorzichtig in een zuurkast.
  10. Voorzichtig te wassen de cellen op de dekglaasjes door toevoeging van 2 ml 1x PBS. Incubeer ze gedurende 5 minuten. Verwijder de PBS met pipetten. Herhaal het wassen 3x.
  11. Permeabel de cellen met 0,2% Triton X-100 in 1 x PBS gedurende 10 min, en vervolgens 3x wassen met 1 x PBS.
  12. Blokkeer de cellen met 3% runderserumalbumine (BSA) in 1 x PBS gedurende 10 minuten en 3x wassen met 1 x PBS.
  13. Verdun het FLAG antilichaam 1: 1000 in 3% BSA / PBS en pipet 30 pi van de verdunde FLAG antilichaam op een vel parafilm.
  14. Neem het dekglaasje met de cellen voorzichtig droog het overtollige buffer met een lab doekjes, en zet het omgekeerde (cel naar beneden) op 30 pl anti-FLAG solution. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  15. Voeg 500 ul van 1 x PBS om de zijkant van het dekglaasje geïncubeerd met het primaire antilichaam tot het dekglaasje drijft bovenop de oplossing. Breng het terug naar de 6-wells plaat met 1x PBS in de putten.
  16. 3x wassen met 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
  17. Verdun het anti-muis secundair antilichaam (1: 500) in 3% BSA / PBS; Gebruik nogmaals 30 ui per dekglaasje. Zet het dekglaasje ondersteboven op de secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  18. Verwijder het dekglaasje uit de parafilm, zoals beschreven in stap 7.15. Zet het terug in de 6-well plaat en was het met 1x PBS 3x gedurende telkens 5 min.
  19. Monteer de dekglaasjes met montage medium (met DAPI), het overtollige medium en verzegel de rand met nagellak.
  20. Visualiseer de cellen met behulp van een fluorescentie microscoop (bij een vergroting van 100X) en fotograferen met een digitale camera.
    OPMERKING: De expressie van ESF wordt gevisualiseerd door de fluorescentie-labeleD secundair antilichaam tegen de FLAG-tag, en de nucleaire fragmentatie wordt gevisualiseerd met behulp van DAPI-kleuring.

8. Meet de apoptose van verschillende kankercellen die ESF uitdrukken

  1. Verdeel 2 x 10 6 HeLa cellen, MDA-MB-231 cellen en A549 cellen in 60 mm schalen met 4 ml DMEM aangevuld met 10% FBS in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 om apoptose te detecteren met Propidium Iodide (PI) kleuring.
  2. 24 uur later, vernieuw het medium en berei de lentivirus voor, zoals eerder gerapporteerd 24 .
  3. Verpakt 10 x 10 6 lentivirus pWPXld-Gly-PUF (WT), pWPXld-Gly-PUF (531) of pWPXld-GFP-voorraden in 4 ml vers medium om de verhouding van virus tot celgetal gelijk te maken aan 5.
  4. Vervang het medium in de platen naar 4 ml van het virusbevattende medium bereid in stap 8.3 en incubeer de platen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. 12 uur na de infectie, verander het medium.
  5. Na 24 uur van infectie, verzamelen en vlekken op de cellen gedurende 5 min in een PBS-oplossing bevattende een eindconcentratie van 2 ug / ml PI.
  6. Analyseer de-PI gekleurde cellen met een flow cytometer, zoals hiervoor 16 beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit rapport beschrijft de volledige protocol voor het ontwerp en de bouw van ESFS en splicing verslaggevers. Schetst ook de verdere toepassing van ESFS manipuleren van de AS van endogene genen 16. Om typische resultaten van het ESF-gemedieerde splicing veranderingen te illustreren, gebruiken we de gegevens uit onze eerdere werk als voorbeeld. Het ESFT met verschillende functionele domeinen kunnen worden gebruikt voor het bevorderen of remmen de opname van de beoog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van het ontwerp en de bouw van kunstmatige splicing factoren die specifiek de alternatieve splicing van een doelwitgen kan manipuleren. Deze methode maakt gebruik van de unieke RNA binding wijze van PUF herhaald om een ​​RNA-bindende scaffold aanpassen met specificiteit. Het kan worden gebruikt om ofwel activeren of onderdrukken splicing.

De kritische stap in dit protocol is het genereren van de reprogramed PUF domein dat de specificiteit van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​R01-CA158283 en NSFC verlenen 31.400.726 aan ZWYW wordt gefinancierd door de Young Duizend Talents Program en de National Natural Science Foundation of China (subsidies 31.471.235 en 81.422.038). XY wordt gefinancierd door de postdoctorale Science Foundation of China (2015M571612).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) met PCR bufferNew England BiolabsM0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase)New England BiolabsM0202L
Liposomal transfectiereagens (Lipofectamine 2000)Invitrogen11668-019
Medium met verminderd serum (Opti-MEM)Gibco31985-062
RNA-extractiebuffer (TRIzol Reagent)ambion15596018TRIzol-reagens bevat fenol, wat brandwonden kan veroorzaken. Draag handschoenen bij het hanteren
PBS (1x)Life Technologies10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT)Invitrogen18080044
Caspase-3 antilichaamCell Signaling Technology9668
PARP antilichaamCell Signaling Technology9542
Bcl-x antilichaamBD Bioscience610211
beta-actine antilichaamSigma-AldrichA5441
alpha-tubulin antilichaamSigma-AldrichT5168
FLAG antilichaamSigma-AldrichF4042
Nitrocellulose membraanAmersham-PharmaciaRPN203D
ECL Western Blotting detectie reagentiaInvitrogenWP20005
Cy5-dCTPGE HealthcarePA55021
Fluorescentie-geactiveerde Cel Sorter (FACS)BD BioscienceFACSCalibur 
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium (DMEM)GE HealthcareSH30243.01
Fetaal bovien serum (FBS)Invitrogen26140079
Propidiumjodide (PI)SigmaP4170
Bovine Serum Albumine (BSA)SigmaA7638-5G
Triton-X100PromegaH5142
Poly-L-Lysine SigmaP-4832Filter-steriliseer en bewaar bij 4 °C
Vector pWPXLdAddgene12258
Vector pMD2.GAddgene12259
Vector psPAX2Addgene12260
DNase I (RNase-vrij)New England BiolabsM0303S
Oligo(dT)18 PrimerThermo ScientificSO131 
Anti-muis secundair antilichaam (Anti-muis IgG, HRP-gekoppeld Antilichaam)Cell Signaling Technology7076S

Referenties

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147(2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732(2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Gemodificeerde splicingfactorenPUF-domeinstuiverRNA-bindende eiwittensplicing-reporterassaysHEK-293T-transfectieRT-PCR-analyseimmunofluorescentiemicroscopieRNA-extractieprotocolglycine-rijk domein
Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.