Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

Samenvatting

Dit rapport beschrijft een werkwijze biotechnologie ontwerpen en bouwen van nieuwe kunstmatige splicingfactoren (ASFS) die specifiek de splitsing van doelgenen te moduleren in zoogdiercellen. Deze werkwijze kan verder worden uitgebreid met verschillende kunstmatige engineering factoren andere aspecten RNA metabolisme manipuleren.

Samenvatting

De verwerking van de meeste eukaryote RNA wordt gemedieerd door RNA-bindingseiwitten (RBPs) met modulaire configuraties, met inbegrip van een module RNA herkenning, dat specifiek bindt aan de pre-mRNA target en een effector domein. Eerder hebben we gebruik van de unieke RNA bindingsmodus van de PUF-domein genomen humaan Pumilio 1 aangeleerde RNA-bindende scaffold, dat werd gebruikt om verschillende kunstmatige RBPs ingenieur RNA metabolisme manipuleren genereren. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven Engineered splicingfactoren (ESFT) die speciaal zijn ontworpen om de alternatieve splicing van doelgenen te moduleren construeren. Het protocol omvat het ontwerpen en bouwen van een aangepaste PUF matrix voor een specifiek RNA-doelwit, hoe een ESF expressieplasmide te construeren door het fuseren ontwerper PUF domein en een effector domein en hoe ESFT om de splitsing van doelgenen te manipuleren. In de representatieve resultaten van deze methode, hebben we ook beschreven gemeenschappelijke assaysVan ESF-activiteiten met behulp van splicing verslaggevers, de toepassing van ESF in gekweekte menselijke cellen, en het daaropvolgende effect van splicing veranderingen. Door de gedetailleerde protocollen in dit rapport te volgen, is het mogelijk om ESF's te ontwerpen en te genereren voor de regulering van verschillende typen Alternative Splicing (AS), waarbij een nieuwe strategie wordt gegeven om splicing regulatie te bestuderen en de functie van verschillende splicing isoforms te bestuderen. Bovendien kunnen onderzoekers kunstmatige factoren richten op specifieke RNA's om verschillende stappen van RNA-verwerking te manipuleren door verschillende functionele domeinen te combineren met een ontworpen PUF-domein.

Inleiding

De meeste menselijke genen ondergaan alternatieve splicing (AS) met meerdere isovormen te produceren met verschillende activiteiten, die sterk de coderende complexiteit van het genoom ^{1, 2} is toegenomen. AS een hoofdbestanddeel mechanisme om genfunctie te reguleren, en wordt strak gereguleerd via diverse transductie in verschillende cellulaire en ontwikkelingsstadia ^{3, 4.} Omdat splicing misregulation is een veel voorkomende oorzaak van ziekte bij de mens ^{5, 6,}

Protocol

1. Constructie van een PUF Steiger met aangepaste RNA-bindende specificiteit door overlappende PCR

1. Ontwerp een reeks PCR-primers die de PUF sequenties die specifiek verschillende RNA nucleotiden herkennen in elke positie ¹² (zie Tabel 1 voor de primersequenties en zie Figuur 1A de RNA: PUF herkenningscode). Voor elke herhaling PUF, ontwerp vier verschillende primers om een ​​andere base op elke positie te herkennen.
   Opmerking: Deze primers worden gebruikt in een reeks van vier ronden van PCR reacties PUF fragmenten die aan elkaar zijn verbonden

Resultaten

Dit rapport beschrijft de volledige protocol voor het ontwerp en de bouw van ESFS en splicing verslaggevers. Schetst ook de verdere toepassing van ESFS manipuleren van de AS van endogene genen ^16. Om typische resultaten van het ESF-gemedieerde splicing veranderingen te illustreren, gebruiken we de gegevens uit onze eerdere werk als voorbeeld. Het ESFT met verschillende functionele domeinen kunnen worden gebruikt voor het bevorderen of remmen de opname van de beoog.......

Discussie

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van het ontwerp en de bouw van kunstmatige splicing factoren die specifiek de alternatieve splicing van een doelwitgen kan manipuleren. Deze methode maakt gebruik van de unieke RNA binding wijze van PUF herhaald om een ​​RNA-bindende scaffold aanpassen met specificiteit. Het kan worden gebruikt om ofwel activeren of onderdrukken splicing.

De kritische stap in dit protocol is het genereren van de reprogramed PUF domein dat de specificiteit van.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) met PCR buffer	New England Biolabs	M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase)	New England Biolabs	M0202L
Liposomal transfectiereagens (Lipofectamine 2000)	Invitrogen	11668-019
Medium met verminderd serum (Opti-MEM)	Gibco	31985-062
RNA-extractiebuffer (TRIzol Reagent)	ambion	15596018	TRIzol-reagens bevat fenol, wat brandwonden kan veroorzaken. Draag handschoenen bij het hanteren
PBS (1x)	Life Technologies	10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT)	Invitrogen	18080044
Caspase-3 antilichaam	Cell Signaling Technology	9668
PARP antilichaam	Cell Signaling Technology	9542
Bcl-x antilichaam	BD Bioscience	610211
beta-actine antilichaam	Sigma-Aldrich	A5441
alpha-tubulin antilichaam	Sigma-Aldrich	T5168
FLAG antilichaam	Sigma-Aldrich	F4042
Nitrocellulose membraan	Amersham-Pharmacia	RPN203D
ECL Western Blotting detectie reagentia	Invitrogen	WP20005
Cy5-dCTP	GE Healthcare	PA55021
Fluorescentie-geactiveerde Cel Sorter (FACS)	BD Bioscience	FACSCalibur
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium (DMEM)	GE Healthcare	SH30243.01
Fetaal bovien serum (FBS)	Invitrogen	26140079
Propidiumjodide (PI)	Sigma	P4170
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma	A7638-5G
Triton-X100	Promega	H5142
Poly-L-Lysine	Sigma	P-4832	Filter-steriliseer en bewaar bij 4 °C
Vector pWPXLd	Addgene	12258
Vector pMD2.G	Addgene	12259
Vector psPAX2	Addgene	12260
DNase I (RNase-vrij)	New England Biolabs	M0303S
Oligo(dT)18 Primer	Thermo Scientific	SO131
Anti-muis secundair antilichaam (Anti-muis IgG, HRP-gekoppeld Antilichaam)	Cell Signaling Technology	7076S