Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

20.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54968

⸱

24 december 2016

 ,  , 
1Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

In dit artikel

Samenvatting

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Samenvatting

Dendritische cellen (DC's) herkennen vreemde structuren van verschillende pathogenen, zoals virussen, bacteriën en schimmels, via een verscheidenheid aan patroonherkenningsreceptoren (PRR's) die op hun celoppervlak worden tot expressie gebracht en activeren en reguleren daardoor de immuniteit.

De belangrijkste functie van DC's is de inductie van adaptieve immuniteit in de lymfeklieren door het presenteren van antigenen via MHC I en MHC II moleculen aan naïeve T-lymfocyten. Daarom moeten DC's migreren van de periferie naar de lymfeklieren na de herkenning van pathogenen op de infectieplaatsen. Voor in vitro experimenten of DC-vaccinatiestrategieën worden routinematig door monocyten afgeleide DC's gebruikt. Deze cellen vertonen overeenkomsten in fysiologie, morfologie en functie met conventionele myeloïde dendritische cellen. Ze worden gegenereerd door stimulatie met interleukine 4 (IL-4) en granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) van monocyten geïsoleerd uit gezonde donoren. Hier laten we zien hoe monocyten worden geïsoleerd en gestimuleerd uit anticoaguleerd menselijk bloed na verrijking van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) door dichtheidsgradiëntcentrifugering. Menselijke monocyten worden gedifferentieerd in onvolwassen DC's en zijn na 5 dagen incubatie klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Inleiding

Dendritische cellen (DCs) zijn de belangrijkste gespecialiseerde antigen presenterende cellen van het immuunsysteem. Onrijpe DC (IDC's) bevinden zich in de huid of in de mucosale weefsels en behoren daarom tot de eerste immuuncellen om te interageren met het binnenvallen van ziekteverwekkers. DCs vertegenwoordigen de brug tussen het aangeboren en adaptieve immuunsysteem 1, omdat ze T- en B-cel responsen na detectie van pathogenen kunnen activeren. Voorts dragen zij bij aan pro-inflammatoire immuunrespons door de afscheiding van grote hoeveelheden cytokines, zoals IL-1β, IL-6 en IL-12. DCs ook activeren NK cellen en andere immuuncellen naar de plaats van infectie door chemotaxis trekken.

DC's kunnen worden onderverdeeld in onrijpe dendritische cellen (IDC's) en gerijpte dendritische cellen (mDC) 2 op basis van hun morfologie en functie. Na de erkenning van buitenlandse antigenen door een van de vele receptoren patroonherkenning (bijv toll-like receptoren, C-typelectinen, receptoren of complement) overvloedig tot expressie gebracht op het celoppervlak, IDC ondergaan grote veranderingen en beginnen te rijpen. Tijdens dit rijpingsproces, receptoren voor antigeen-capture worden down-gereguleerd, terwijl moleculen die essentieel zijn voor antigeen presentatie zijn up-gereguleerd 3. Mature DCs up-reguleren van de major histocompatibility complex I en II (MHC I en II), co-stimulerende moleculen zoals CD80 en CD86, die essentieel zijn voor antigeen presentatie en activatie van T-lymfocyten. Bovendien wordt de uitdrukking van chemokine receptor CCR7 op het celoppervlak veroorzaakt, die de migratie van DCs van perifere weefsels naar de lymfeklieren maakt. De migratie wordt vergemakkelijkt door het "rollen" van DCs langs een chemokine ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) en chemokine ligand 21 (CCL21 / SLC) gradiënt naar de lymfeklieren 4-6.

Na migratie mDC presenteren verwerkt antigeen CD4 + en CD8 + T-cellen naïeve, waardoor initiating een adaptieve immuunrespons tegen het binnendringende pathogeen 7. Deze interactie met T-cellen in de lymfeknopen wordt ook geassocieerd met de verspreiding van het virus 8. Andere in vitro studies toonden aan dat DCs efficiënt te vangen en over te dragen aan HIV T-cellen en dat deze overdracht resulteert in een krachtige infectie 9-12. Deze experimenten wijzen erop dat in vivo HIV exploits DCs als shuttles van de periferie naar de lymfeklieren. Tijdens antigeenpresentatie, DC scheiden sleutel interleukinen dat de differentiatie van effector T-helpercellen vorm, en daarom wordt het resultaat van de volledige immuunrespons tegen de microbe bepaald op dit interactie. Naast het type 1 (Th1) en type 2 (Th2) effector T-cellen, andere subgroepen van CD4 + T helpercellen (bijv type 17 (Th17) en type 22 (Th22) T-cellen) zijn beschreven, en hun introductie en functie zijn grondig onderzocht. DCs zijn verder betrokken bijde generatie van regulatoire T-cellen (Tregs) 13,14. Deze cellen zijn immunosuppressieve en kan stoppen of omlaag reguleren inductie of proliferatie van effector T-cellen en zijn dus cruciaal voor de ontwikkeling van de immuniteit en tolerantie.

Human conventionele DC (CDC) bestaan uit verschillende subsets van cellen met een myeloïde oorsprong (dat wil zeggen, Langerhans cellen (LC) en via de huid en interstitiële DC) of een lymfoïde oorsprong (dat wil zeggen, plasmacytoide DCs (pDCs)). Voor in vitro experimenten of DC vaccinatie strategieën, zijn monocyt afgeleid DCs routinematig gebruikt als een model voor dermal DCs. Deze cellen vertonen overeenkomsten in fysiologie, morfologie en functie gebruikelijke myeloïde dendritische cellen. Zij worden gegenereerd door toevoeging van interleukine 4 (IL-4) en granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) aan monocyten geïsoleerd uit gezonde donoren 12,15-18. Dendritische cellen kunnen ook direct worden geïsoleerd uit de huid of slijmvlies biopten, of kan zelfs be ontwikkeld uit CD34 + hematopoietische stamcellen geïsoleerd uit navelstrengbloed monsters verkregen ex baarmoeder. Hier laten we zien hoe monocyten zijn geïsoleerd en gestimuleerd uit anti-gecoaguleerd menselijk bloed na perifere mononucleaire cel (PBMC) verrijking door dichtheidsgradiënt centrifugeren. Na incubatie gedurende 5 dagen, humane monocyten onder specifieke condities gedifferentieerd in IDC's en zijn klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek statement: Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemende bloeddonoren door het Centraal Instituut voor Bloedtransfusie en immunologische Department, Innsbruck, Oostenrijk. Het gebruik van anonieme overgebleven exemplaren voor wetenschappelijke doeleinden werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Universiteit van Innsbruck.

1. Verrijking van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs)

  1. Concentratie van PBMC door centrifugatie.
    1. Open het pakket en bloed split bloed in steriele 50 ml centrifugebuizen volgens de hoeveelheid bloed ontvangen.
    2. Pas indien nodig het volume op 50 ml voor elke buis met steriele Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS).
    3. Plaats de buizen in een centrifuge en draaien ze bij 400 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT) zonder rem.
    4. Verwijder de bovenlaag bevattende plasma en bloedplaatjes met een steriele 10 ml serologische pipet, waardoor de boundary laag ongestoord.
      Opmerking: Als autoloog plasma in plaats van FCS wordt gebruikt in aanvulling het kweekmedium moet het plasma worden verzameld en hitte-geïnactiveerd bij deze stap.
    5. Verzamel de mononucleaire cellen (grenslagen) uit twee 50 ml centrifugebuizen en breng ze in een steriele 50 ml buis met behulp van een steriele 10 ml serologische pipet.
    6. Zet het volume op 50 ml per buis met behulp van steriele D-PBS.
    7. Plaats de buizen in een centrifuge en draaien ze bij 400 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur zonder rem.
    8. Verwijder de bovenste laag die het plasma en bloedplaatjes met een steriele 10 ml serologische pipet, waardoor de grenslaag ongestoord.
    9. Verzamel de mononucleaire cellen (grenslagen) uit de 50 ml centrifugebuizen en zet ze in twee steriele 50 ml collectie buizen met behulp van een steriele 10 ml serologische pipet.
    10. Zet het volume op 50 ml voor elke buis met steriele D-PBS.
  2. Scheidingvan PBMC door dichtheidsgradiënt centrifugatie (figuur 1).
    1. Neem vier 50 ml buizen en Pipetteer 15 ml dichtheidsgradiënt medium in elke buis.
    2. Neem 25 ml van samengevoegde cellen / bloed uit de collectie buis (stap 1.1.10) en voorzichtig overlay de dichtheidsgradiënt medium.
    3. Plaats de buizen in een centrifuge en draaien ze bij 700 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem.
  3. Inzameling en zuivering van PBMCs.
    1. Verwijder de bovenste laag die het plasma en bloedplaatjes met een steriele 10 ml serologische pipet, waardoor de PBMC laag ongestoord.
    2. Verzamel de PBMC tussenfase van alle buizen en bundelen de cellen in twee steriele 50 ml buizen met behulp van een steriele 25 ml serologische pipet.
    3. Zet het volume op 50 ml voor elke buis met steriele D-PBS. Plaats de buizen in een centrifuge en draaien ze bij 400 xg gedurende 15 min bij 4 ° C met de rem.
    4. Zuig het supernatant en resuspendeer decellen in steriele D-PBS. de cellen Pool van beide buizen en het volume op 50 ml met steriel D-PBS passen.
    5. Plaats de buizen in de centrifuge en draaien ze bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met rem.
    6. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in steriele D-PBS. Stel het volume op 50 ml met steriel D-PBS en 50 ul pipet een 1,5 ml buis die 450 pl D-PBS.
    7. Vortex de 1,5 ml buis krachtig en tel de cellen in een Neubauer kamer of een andere cel telapparaat.
    8. Plaats de 50 ml buizen in de centrifuge en draaien ze bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met rem.

2. Isolatie van monocyten van Anti-humaan CD14 magnetische deeltjes

  1. Etikettering van PBMCs met magnetische deeltjes.
    1. Stel de PBMC concentratie 8 x 10 7 cellen / ml gebruikt isolatiebuffer.
    2. Vortex het anti-humane CD14 magnetische deeltjes thoroughly en voeg 50 ul van deeltjes voor elk 1 x 10 7 PBMC.
    3. Meng de cel-deeltjessuspensie grondig en incubeer deze bij kamertemperatuur 30 min.
  2. Scheiding van de positieve en negatieve fracties.
    1. Stel het volume tot 12 ml met behulp van isolatie buffer.
    2. Neem zes steriele rondbodem buizen en Pipetteer 2 ml van de cel-deeltjessuspensie in elke buis.
    3. Onmiddellijk in zijn buizen op de magneet. Incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Houd de buizen op de magneet en zorgvuldig te trekken uit de bovenstaande vloeistof. Het supernatant bevat de negatieve fractie.
    5. Haal de buis uit de magneet en voeg 2 ml van isolatie buffer.
    6. Voorzichtig resuspendeer de cellen door en neer te pipetteren.
    7. Plaats de buizen weer op de magneet. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Houd de buizen op de magneet en zorgvuldig te trekken uit de bovenstaande vloeistof. Het supernatant bevat de negatieve fractie.
    9. Verwijder de buizen uit de magneet en voeg 2 ml isolatiebuffer aan elke buis. Voorzichtig resuspendeer de cellen door en neer te pipetteren.
    10. Breng de positieve fractie naar een steriele 50 ml buis en het volume aan te passen tot 50 ml met behulp van steriele D-PBS.

3. stimulatie van geïsoleerde monocyten met IL-4 en GM-CSF

  1. Breng de buis in de centrifuge en spin in bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met rem.
  2. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 50 ml D-PBS.
  3. Pipetteer 50 ul in een 1,5 ml buis die 450 pl D-PBS. Vortex de 1,5 ml buis krachtig en tel de cellen in een Neubauer kamer of andere cel telapparaat.
  4. Plaats de 50 ml buis in de centrifuge en spin in bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met rem.
    LET OP: Als de negatieve fractie, die perifere bloed lymfocyten (PBL), is ook nodig, het uitvoeren van het wassen en het tellen van de stappen vergelijkbaar met tslang van de positieve fractie (stappen 3,1-3,5).
  5. Stel de celconcentratie 1 x 10 6 / ml met voorverwarmd kweekmedium (RPMI 1640 medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd FBS en 1% L-Glutamine oplossing) en pipetteer 3 ml / putje in 6-well platen.
    LET OP: Bij gebruik van hitte-geïnactiveerd autoloog plasma, vervang dan de 10% FCS met 1-5% autoloog plasma, volgens de experimentele opstelling.
  6. Stimuleren van de monocyten met recombinant humaan IL-4 (250 U / ml) en recombinant humaan GM-CSF (1000 U / ml) door pipetteren de cytokinen rechtstreeks in het kweekmedium. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
  7. Opnieuw stimuleren van de cellen met IL-4 (250 U / ml) en GM-CSF (1000 U / ml) na 48 uur door pipetteren de cytokinen rechtstreeks in het kweekmedium.
    Opmerking: Als er tekenen van verzuring aangegeven door de pH-indicator in het medium, de helft van het medium vervangen door voorverwarmd kweekmedium.
  8. Harvest onvolwassen dendritische cellen op dag 5 voorstroomafwaarts experimenten pipetteren de gekweekte cellen uit de 6-well plaat in een 50 ml centrifugebuis na pipetteren het kweekmedium en neer enkele keren.
  9. Tel de cellen en vlekken op een monster van monocyten geïsoleerd met anti-humane antilichamen tegen CD 11 b, CD 11 c en DC-SIGN / CD209, samen met een cellevensvatbaarheid kleurstof. Om niet-specifieke binding van de antilichamen in het oppervlak vlekken te voorkomen, is het gebruik van Fc receptor blokkerende reagentia of runderserumalbumine (BSA) buffers sterk aanbevolen.
  10. Analyseer het monster met de cellevensvatbaarheid kleurstof, volgens het protocol van de fabrikant, door het uitvoeren van stromingscytometrie om de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de gegenereerde IDCS beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na centrifugering van anti-gecoaguleerd volbloed met behulp van een sucrose kussen worden perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's) verrijkt in een interfase bovenop de dichtheidsgradiënt medium (figuur 1). Nadat de PBMC uit worden getrokken, is FACS-analyse uitgevoerd om de verschillende celpopulaties karakteriseren in de PBMC met behulp lineage markers (bijvoorbeeld CD3 voor T lymfocyten, CD14 op monocyten en CD19 op B-lymfocyten). Figuur 2A

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de vorming van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDCs) door de isolatie van humane monocyten uit anti-gecoaguleerd volbloed met behulp van een magnetische nanodeeltjes gebaseerde test. In dit protocol worden de centrifugatiestappen uitgevoerd vóór de cel isolatiewerkwijze, hetgeen leidt tot een verrijking van de PBMC fractie. Hoewel cellen verloren tijdens het centrifugeren, de inhoud van een pakket op volbloed dichtheidsgradiënt medium overlay zou vereisen 200-300 ml van de dichtheidsgra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij willen onze technicus Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, en Dr. Annelies Mühlbacher en Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, bedanken voor hun waardevolle hulp en ondersteuning met betrekking tot dit manuscript. We danken de Austrian Science Fund voor de steun bij dit werk (P24598 naar DW, P25389 naar WP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19BD Biosciences555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15eBD Biosciences551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic ParticlesBD Biosciences557769
BD ImagnetBD Biosciences552311
BSA (Albumine Fractie V)Carl RothEG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-behandelde multi-well platenCostar3506
Dichtheidsgradiënt media: Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare Bio-Sciences17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Sigma-AldrichD8537
Falcon 10 ml Serologische PipetCorning357551
Falcon 25 ml Serologische PipetCorning357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge TubeCorning352070
Falcon Ronde-BodembuizenCorning352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3aBD Biosciences555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagens)Tonbo biosciences13-0870
GM-CSFMACS Miltenyi Biotec130-093-862
Heat Inactivated FBS (Foetaal Rundserum), EU Goedgekeurde Oorsprong (Zuid-Amerika)Gibco10500-064
Hettich Rotanta 460RHettich---
IL-4 CCPromoKineC-61401
Isolatie buffer: BD IMag Buffer (10x)BD Biosciences552362
L-Glutamine oplossingSigma-AldrichG7513
Microcentrifugebuizen, 1,5 ml, SuperSpinVWR211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2BD Biosciences555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46BD Biosciences551265
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR0883
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020

Referenties

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van monocytendifferentiatie van dendritische cellenCD14 magnetische beadsdichtheidsgradiëntcentrifugatieverrijking van PBMC'sflowcytometrieinterleukine 4GM-CSF stimulatieonrijpe dendritische cellenantigeenpresentatie
Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.