Methodenartikel

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54972

⸱

16 december 2016

 ,  , 
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

In dit artikel

Samenvatting

Bestaande methoden voor het modificeren van planten hebben een beperkte toepasbaarheid. De nieuwe peptide-afgeleide technologie die hier wordt voorgesteld, belooft zowel eenvoud als efficiëntie in de introductie van exogeen eiwit of genen in de gewenste intracellulaire compartimenten van intacte planten.

Samenvatting

De capaciteit om exogene eiwitten te introduceren en specifieke genen in planten tot expressie te brengen (of te onderdrukken) biedt een krachtig hulpmiddel voor fundamenteel onderzoek evenals nieuwe toepassingen op het gebied van plantenbiotechnologie. De haalbare methoden die momenteel bestaan voor eiwit- of genoverdracht naar plantencellen, namelijk Agrobacterium en microprojectielbombardement, hebben nadelen zoals een lage transformatiefrequentie, een beperkt gastheerbereik of hoge kosten voor apparatuur en microcarriers. Het volgende protocol schetst een eenvoudige en veelzijdige methode, die rationeel ontworpen peptiden gebruikt als leveringsmiddelen voor een verscheidenheid aan op nucleic zuur- en eiwit gebaseerde ladingen in planten. Peptiden worden geselecteerd als hulpmiddelen voor de ontwikkeling van het systeem vanwege hun biologisch afbreekbaarheid, verminderde grootte, diverse en aanpasbare eigenschappen, evenals de mogelijkheid om intracellulair/organellair toegang te verkrijgen. De bereiding, karakterisering en toepassing van geoptimaliseerde formuleringen voor elk type van het brede scala aan geleverde ladingen (plasmide DNA, dubbelstrengs DNA of RNA en eiwit) worden beschreven. Kritische stappen binnen het protocol, mogelijke aanpassingen en bestaande beperkingen van de methode worden ook besproken.

Inleiding

Plant genetic engineering wordt conventioneel gebruikt voor het overbrengen van gunstige eigenschappen naar planten. In de afgelopen jaren is deze technologie toegepast om planten om te zetten in bio-fabrieken voor de productie van farmaceutisch belangrijke en commercieel waardevolle eiwitten, waarvan vele niet chemisch kunnen worden gesynthetiseerd en erg duur zijn om te produceren met behulp van dierlijke of microbiële systemen1. Door de introductie van nieuwe genen kan het eigen metabolisme van de plant worden gemanipuleerd voor de productie van verschillende biofarmaceutische producten zoals antilichamen, metabolische enzymen, hormonen, antigenen of vaccins2.

Gevestigde genoverdrachttechnologieën voor planten zijn de Agrobacterium-gemedieerde levering3, bombardement met DNA-gecoate microprojectielen (biolistiek)4, en elektroporatie5 of polyethyleenglycol6 behandeling van protoplasten. Technieken die protoplasten vereisen, worden over het algemeen vermeden omdat ze tijdrovend, omslachtig zijn en inconsistente resultaten opleveren7. Als gevolg hiervan maakt vrijwel al het huidige werk aan plantenmodificatie gebruik van Agrobacterium of microprojectielen voor genoverdracht. De Agrobacterium-methode wordt het meest gebruikt, maar is niet toepasbaar op veel economisch belangrijke plantensoorten. Ondertussen is microprojectielbombardement veelzijdiger vanwege een breed scala aan vatbare planten, maar vereist gespecialiseerde apparatuur en veroorzaakt vaak ernstige weefselschade. Bovendien omvatten deze methoden ofwel een willekeurig (biolistiek) of complex (Agrobacterium) afleveringsmechanisme en hebben variabele transformatiesnelheden8. Daarom is een nieuwe planttransformatietechnologie die eenvoudig maar effectief is, en toepasbaar op verschillende plantensoorten, noodzakelijk.

Momenteel worden planten onderworpen aan genetische modificatie voornamelijk door de levering van exogeen DNA dat een gewenste eigenschap codeert, in plaats van door directe levering van een doelwiteiwit. De hogere stabiliteit van DNA ten opzichte van eiwitten is een belangrijk voordeel; niettemin omvatten potentiële problemen geassocieerd met DNA-levering de willekeurige invoeging van exogeen DNA in het plantengenoom en onbedoelde overdracht van antibioticaresistentiegenen naar pathogene bacteriën via horizontale genoverdracht9. Voor doeleinden van genoombewerking kan de mogelijkheid om plantengenooms te bewerken zonder vreemd DNA in cellen te introduceren, regelgevende zorgen met betrekking tot genetisch gemodificeerde planten omzeilen. Daarom zal een alternatieve DNA-vrije strategie voor de modificatie van planten door directe levering van eiwitten in staat zijn om aan deze behoeften te voldoen.

Hier introduceren we een op peptiden gebaseerd systeem, oorspronkelijk ontwikkeld voor humane gentherapie10-14, voor de gerichte levering van exogene genen of eiwitten in intacte planten. Peptiden zijn in staat om DNA te beschermen tegen nuclease-afbraak en kunnen genoverdracht mediëren over cel- en organellaire membranen15-17. Ze hebben ook diverse en afstembare eigenschappen, naast het feit dat ze niet-cytotoxisch zijn18-20. Belangrijker nog, met behulp van peptiden kunnen genen precies worden gericht op intracellulaire organellen zoals de mitochondriën21 of plastiden (chloroplasten)22 voor expressie - een taak die niet haalbaar is door biolistische of Agrobacterium-gemedieerde transformatie. Afhankelijk van het type vracht, kan deze nieuwe plantenmodificatietechnologie worden gebruikt om eiwitten23 te leveren en specifieke genen binnen de plant, in zijn cytosolische ruimte24-26 of binnen een specifiek organellaire compartiment21 tot expressie te brengen (plasmide21,24 of dubbelstrengs DNA25) of te onderdrukken (dubbelstrengs RNA26). De ontworpen carrierpeptiden bestaan uit een kationische domein in de vorm van polylysine (K8) of polylysine-co-histidine (KH)9 voor binding en/of condensatie van negatief geladen vracht, die is geconjugeerd aan celdoordringende (BP100-peptide) of mitochondriëntransit (Cytcox-peptide) sequenties.

Protocol

1. Bereiding van peptide-gebaseerde formuleringen

  1. Bereid voorraadoplossingen van elk peptide als volgt: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml of 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) en (BP100) 2 K 8 (70 uM). Weeg de vereiste hoeveelheid van elk peptide in een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg geautoclaveerd ultrazuiver water aan het peptide lossen. Meng goed door herhaaldelijk pipetteren totdat een heldere oplossing wordt verkregen.
  2. Versterken en zuiveren het plasmide DNA (pDNA), dubbelstrengs DNA (dsDNA) en dubbelstrengs RNA (dsRNA) volgens standaard moleculaire methoden. In 1,5 ml microcentrifuge buizen, maak voorraadoplossingen met een concentratie van 1 mg / ml (pDNA en dsDNA) of 400 nM (dsRNA).
  3. Bereid de eiwit voorraadoplossing met een concentratie van 7 uM, door het oplossen van 1 mg eiwit (bijv., Alcohol dehydrogenase, ADH) poeder in 1 ml natriumcarbonaatoplossing (0,1 M, pH 9). Label het eiwit met fluorescent probes zoals rhodamine B (RhB) volgens standaardprotocollen microscopische visualisatie van de geleverde proteïne in cellen mogelijk.
  4. Combineer de respectieve componenten in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    1. Voor peptide-pDNA formuleringen gericht het cytoplasma, voeg 6,4 pl (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) tot 20 gl pDNA (1 mg / ml) en goed mengen door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 773,6 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund. Gebruik de pDNA construct ontworpen voor nucleair expressie (P35S-RLuc-Tnos, tabel 1).
    2. Voor peptide-pDNA samenstellingen gericht op de mitochondriën, voeg 6,6 pl Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) tot 20 gl pDNA (1 mg / ml) en goed mengen door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C en voeg 2,4 pl BP100 (1 mg / ml). Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 256, C voor nog eens 15 min. Voeg 771 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund. Gebruik de pDNA construct ontworpen voor mitochondriële expressie (pDONR-Cox2: rluc, tabel 1).
    3. Voor peptide-dsDNA formuleringen, voeg 5,1 pl (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) tot 8 pl dsDNA (1 mg / ml) en goed mengen door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 786,9 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund.
    4. Voor peptide-dsRNA formuleringen, voeg 50 pl (KH) 9 -BP100 (800 nM) aan 50 pl dsRNA (400 nM) en meng door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 700 gl RNase-vrij water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund.
    5. Voor peptide-eiwitformuleringen, voeg 16 pl (BP100) 2 K 8 (70 uM) aan 16 pl ADH (7 uM) en menggoed door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 768 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund.
  5. Laat de formuleringen te stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C.

2. Karakterisering van peptide-gebaseerde formuleringen

  1. Transfer elke oplossing (800 pl) in een cuvette voor dynamische lichtverstrooiing analyse (DLS). Bepaal de hydrodynamische diameter en polydispersiteitsindex gevormde complexen met een zeta nanosizer, met een 633 nm He-Ne-laser bij 25 ° C met een backscatter detectiehoek van 173 °.
  2. Na omvangmetingen transfer elke oplossing (800 pl) in een gevouwen capillaire cel zeta potentiaal metingen op standaardparameters diëlektrische constante, brekingsindex en de viscositeit van water bij 25 ° C.
  3. Zich aan een kleine hoeveelheid complex, gebruikt bij DLS analyse van atomaire kracht microscopie (AFM). Aanbetaling van 10 ul van complexe oplossing op de vers blootgestelde gesplitst oppervlak van een mica plaat en laat de mica droog 's nachts in een overdekte plastic petrischaal lucht.
  4. Verwerven van een afbeelding van de complexen in lucht bij 25 ° C onder toepassing van een silicium cantilever met een veerconstante van 1,3 N / m tapping mode 27,28.

3. Infiltratie van bladeren van de planten

  1. Gebruik 3 weken oude bodem geteelde planten (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 of populier 26). Transfecteren tenminste 3 blaadjes dienen als drievoud voor de kwantificering van genexpressie of eiwit aflevering.
  2. Laad een 1 ml plastic naaldloze spuit met 100 ul van complexe oplossing voor de transfectie van een blad. Plaats de punt van de spuit op de abaxiale oppervlak van het blad.
  3. Druk de spuit tegen het blad iets op en druk de spuit zuiger langzaam tijdens het uitoefenen van een tegendruk met de index vinger van een latex-gehandschoende hand van de andere kant. Succesvolle infiltratie kan worden waargenomen als de verspreiding van water doordrenkte gebied in het blad. Label de geïnfiltreerde bladeren voor het gemak van identificatie.
  4. Incubeer de getransfecteerde blad voor optimale perioden na infiltratie met peptide-pDNA (12 uur), peptide-dsDNA (12 uur), peptide-dsRNA (9-48 uur) en peptide-eiwit (6 uur) formuleringen onder de volgende omstandigheden: 16 uur licht / 8 uur donker bij 22 ° C naar A. thaliana en populier, of 24 uur constant licht bij 29 ° C voor N. benthamiana.

4. Evaluatie van transfectie efficiëntie

  1. Accijnzen de hele getransfecteerde blad kleinere installaties (bijv., A. thaliana) of een 1 cm 2 sectie van het geïnfiltreerde gebied voor grotere installaties (bijv., N. benthamiana).
  2. Voor transfectie-experimenten met Renilla luciferase (Rluc) reporter vector, bepalen de transfection efficiency kwantitatief met behulp van een Rluc Assay Kit.
    1. Plaats elk uitgesneden blad of blad sectie in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 100 ul van 1 × Rluc Assay Lysis Buffer per buis. Op dezelfde wijze bereid lysaten van ongetransfecteerde control bladeren (drievoud).
    2. Maal het blad met behulp van een homogenisatie stamper en incubeer het resulterende lysaat bij 25 ° C gedurende 6-10 uur.
    3. Centrifugeer het lysaat bij 12.470 x g in een microcentrifuge gedurende 1 minuut. Overdracht 20 ul van het lysaat geklaard een putje in een 96-well microplaat, en gebruik het resterende volume voor het kwantificeren van de totale eiwitconcentratie onder toepassing van een BCA Protein Assay Kit volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Voeg 100 ul van 1 × Rluc Assay Substrate (verdund met behulp van de Rluc Assay Buffer) in de put en meng door langzaam pipetteren. Plaats de microplaat in een multimode microplaat lezer en start de meting.
    5. Trek de achtergrond luminescentie (gemiddelde van de no-N getransfecteerde drievoud) van luminescentie elke experimentele monster. Bereken de verhouding van fotoluminescentie (relatieve lichteenheden, RLU) de hoeveelheid eiwit (mg).
  3. Voor transfectie-experimenten met groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter vector of fluorescent gemerkt eiwit (bijv., ADH-RhB), acht de fluorescentie met behulp van een confocale laser scanning microscoop.
    1. Snijd de randen van een hele blad (het verwijderen van luchtruimten steun), terwijl een doorsnede blad kan als zodanig worden gebruikt. Verwijder de zuiger uit een 10 ml spuit en plaats elk uitgesneden blad of blad sectie in de spuit.
    2. Vervang de zuiger en duw voorzichtig naar de bodem van de spuit zonder aandrukken het blad. Trekken water in de spuit totdat het is ongeveer de helft gevuld.
    3. Richt de spuit in te drukken en de zuiger om lucht uit de spuit door de punt te verwijderen. Bedek de punt van de spuit en trek de zuiger langzaam naar beneden om de lucht te verdrijven uit de leaf. Herhaal dit proces meerdere keren totdat het blad verschijnt doorschijnend.
    4. Bedek het oppervlak van een microscoopglaasje met plakband. Snij een vierkant gebied op de band groot genoeg om de bladmonster met een mes tegemoet en schil de vierkant stuk tape met een tang om een ​​specimen kamer te creëren. De band zal dienen als een afstandhouder tussen de glijbaan en dekglaasje.
    5. Leg het blad in de kamer met de abaxiale oppervlak naar boven en vul de resterende ruimte met water. Verzegel het blad binnen de kamer met een glazen dekglaasje en zet de randen van het dekglaasje met plakband.
    6. Onderzoek het blad monster met behulp van de confocale laser scanning microscoop onder een 40x objectief of een 63x water immersie objectief. GFP of RhB fluorescentie kan worden gevisualiseerd op golflengten van 488 nm of 555 nm.

Resultaten

Een serie van nucleïnezuur en eiwit ladingen werden met succes geïntroduceerd in verschillende planten met behulp van de ontworpen peptiden als levering vectoren. Elektrostatische interacties tussen kationische peptiden en negatief geladen lading resulteerde in de vorming van transfectie complexen die direct kunnen worden geïnfiltreerd in bladeren van de planten met behulp van een naaldloze injectiespuit (figuur 1). Geoptimaliseerde formuleringen (empirisch bepaald in deze studies 21,23-26) voor de transfectie van plantencellen zijn samengevat in tabel 1, waarbij elk van de vele geleverde lading (pDNA, dsDNA, dsRNA en eiwit) wordt voorgesteld. De gemiddelde diameters van op peptide gebaseerde formuleringen waren in het bereik van ongeveer 150-300 nm. Op basis van DLS analyse getoond alle formuleringen betrekkelijk geringe omvang polydispersiteiten, wat aangeeft dat het gevormde peptide-aggregaten lading hebben een uniforme grootteverdeling. De morfologie vancomplexen tussen peptide en pDNA (figuur 2A) of eiwit (Figuur 2B), op mica werden afgebeeld door AFM. Homogene bolvormige complexen werden waargenomen voor zowel peptide-pDNA en peptide-eiwit combinaties, in overeenstemming met de gegevens van DLS metingen. In termen van het zeta potentieel van de complexen (tabel 1), pDNA- en dsDNA-afgeleide complexen had netto negatieve oppervlak ladingen terwijl dsRNA gebaseerde complexen had een bijna-neutrale oppervlakte lading. Peptide-eiwitcomplexen, daarentegen, zijn positief geladen.

De rendementen van peptide-pDNA en peptide-dsDNA formuleringen in het bemiddelen van de transfectie van A. thaliana of N. benthamiana als modelplant systemen zijn kwantitatief als kwalitatief. De RLuc genexpressie test werd gebruikt voor de kwantificering van genexpressie niveaus (tabel 1), dus voor dit experiment pDNA ofdsDNA coderend voor het RLuc gen worden gebruikt voor het complexeren met de respectieve dragerpeptiden. Met toets (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering kern gerichte aflevering en expressie van pDNA kan worden bereikt na een incubatietijd van 12 uur, voor een RLU / mg waarde heeft van ongeveer 1 x 10 5. Voor mitochondriale doelgerichte aflevering en expressie van pDNA, een combinatie van peptiden, Cytcox- (KH) 9 en BP100 is vereist voor complexvorming. Met dezelfde optimale incubatietijd van 12 uur, maar een veel lagere transfectie (ongeveer 1 x 10 3 RLU / mg) werd verkregen. Ondertussen soortgelijke incubatieperiode (12 uur) en genexpressie niveau (ongeveer 1 x 10 3 RLU / mg) was vereist / opgenomen voor dsDNA-gebaseerde complexen, formuleerde ook het gebruik van de (KH) 9 -BP100 peptide. Kwalitatieve beoordelingen van genexpressie werden uitgevoerd door directe microscopische observatie van de bladeren die werden behandeld met complexen prepar uitgevoerded gebruik pDNA of dsDNA coderend voor het GFP-reportergen. In cellen die met niet-gerichte peptide-pDNA complexen, diffuse groene fluorescentie die overeenkomt met GFP-expressie duidelijk waargenomen en bleek gelokaliseerd in het cytoplasma (Figuur 3A). Duidelijke verschillen in de lokalisatie patroon van GFP-fluorescentie in cellen zichtbaar waren geïnfiltreerd met mitochondriale gerichte peptide-complexen pDNA. Hier gestippelde groene fluorescentie die colocalize de mitochondriale vlek zichtbaar, hetgeen de specificiteit van genexpressie uitsluitend in het mitochondriale compartiment van cellen (Figuur 3B).

Voor peptide-eiwitformuleringen wordt conjugatie van het proteïne lading (ADH) een fluorofoor (RhB) visualisatie van de afgegeven eiwit in de intracellulaire ruimte mogelijk. Binnen een korte incubatieperiode van 6 uur, ADH-RhB eiwit (blauw) werd gevonden door te verdelenhet cytosol en de vacuole van geïnfiltreerde cellen (Figuur 3C). Ondertussen kan snel en efficiënt neerwaartse regulatie van genexpressie worden uitgevoerd in verschillende installaties die peptide-dsRNA formuleringen. In het eerste experiment werd A. thaliana bladeren geïnfiltreerd met peptide-complexen dsRNA het chalcon synthase gen (CHS) belast anthocyaan (rood pigment) biosynthese bij droogte zwijgen. Het verschil in uiterlijk van A. thaliana bladeren onder normale (Figuur 3D, a) en droogte omstandigheden (figuur 3D, b) die een gemakkelijke manier om CHS zwijgen op te leggen met behulp van de geoptimaliseerde peptide-dsRNA formulering te evalueren (pijl 1 geeft de geïnfiltreerd regio). In het tweede experiment werden peptide-complexen dsRNA geïnfiltreerd in bladeren van transgene A. thaliana tot expressie geel fluorescerend eiwit (YFP). Een schijnbare vermindering van YFP expressie te zien in de epidermiscellen 9 hr post-transfectie (figuur 3E, F). De effectiviteit van de formulering beneden reguleren van genexpressie in een andere plant systeem (populier, 12 uur na transfectie) werd ook onderzocht (Figuur 3G-H).

figure-results-1
Figuur 1: Peptide-gebaseerde formuleringen voor de levering van nucleïnezuur en eiwit Ladingen in levende planten.
De ontworpen carrier peptiden bestaan ​​uit polykationen geconjugeerd naar cel penetrerende of organellen transit sequenties. Polykationen vrijgave binding en / of condensatie van negatief geladen lading evenals ontsnapping uit de endosomale compartiment volgende internalisatie in cellen. Levering van ladingen in cellen en vervolgens specifieke organellen wordt gemedieerd door celpenetrerende sequenties en organellen doorvoer sequenties, respectievelijk. Verschillende ladingen die successfu zou kunnen zijnlly in de plant afgeleverd omvatten nucleïnezuren zoals pDNA, dsDNA en dsRNA, alsook model eiwitten zoals runderserumalbumine (BSA), alcohol dehydrogenase (ADH) en citrien (een variant van geel fluorescerende proteïne). Biologisch actieve moleculen zijn in staat om transfectie complexen met peptidenconjugaten via elektrostatische interacties, die worden geïntroduceerd in bladeren van de planten met een injectiespuit infiltratie te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De morfologieën van de peptide-gebaseerde formuleringen.
(A) AFM amplitude beeld van (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering bij N / P 0,5. AFM hoogte van het beeld van (BP100) 2 K 8 / ADH formule bij mol rati (B)o 10. Overgenomen met toestemming uit gepubliceerde bronnen 23,24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Microscopische evaluatie van de efficiëntie van de transfectie gebruik Geoptimaliseerde op peptiden gebaseerde formuleringen.
(A) cytosolische GFP expressie (groen), duidelijk onderscheidt van chloroplast autofluorescentie (rood), werd waargenomen in het sponsachtige mesofylcellen van A. thaliana bladeren geïnfiltreerd (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5; 12 uur ). (B) GFP expressie (groen) werd gedetecteerd in de mitochondria (rood) in de epidermale cellen van A. thaliana blad geïnfiltreerd met Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5 voor elke peptide; 12 uur). Vergrote afbeeldingen van de mitochondria met GFP expressie worden weergegeven in de extreem-rechts paneel. (C) De levering van ADH-RhB (blauw) in de sponsachtige bladmoes cellen van A. thaliana bladeren gemedieerd door (BP100) 2 K 8 bij een peptide / proteïne molverhouding van 10, gevisualiseerd 6 uur na infiltratie. (D) A. thaliana blad vóór (a) en na (b) behandeling met (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molverhouding 2; 48 uur), waardoor de onderdrukking van anthocyanine biosynthese route. Een soortgelijke formulering met GFP5 dsRNA werd geïnfiltreerd in het blad als negatieve controle (c). Pijlen 1 en 3 geven het geïnfiltreerde gebied terwijl pijlen 2 en 4 geven de niet-geïnfiltreerde gebied binnen het blad. (E) A. thaliana bladeren expressie geel fluorescerend eiwit (YFP) en (F) de verminderde YFP fluorescentie na infiltratie met (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molverhouding 2, 9 uur). (G) transgene populieren bladeren uitdrukken geel fluorescerend eiwit (YFP) en (H) de verminderde YFP fluorescentie na infiltratie met (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molverhouding 2; 12 uur). Overgenomen met toestemming van gepubliceerde bronnen 21,23,24,26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Variatie in Peptide-to-DNA (N / P) Ratio en het effect op de biofysische eigenschappen van de complexen.
Met toenemende peptide DNA verhouding peptide gebaseerde formuleringen in omvang afnemen terwijl hun zeta-potentiaal waarden overgang van negatief naar positief./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Tabel 1: Karakterisering en evaluatie van verschillende peptide-gebaseerde formuleringen. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.

figure-results-6
Tabel 2: een vergelijking van Peptide-gebaseerde en andere bestaande DNA Delivery Technologies voor intacte planten. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.

Discussie

Kritische stappen in het protocol dat empirisch geïdentificeerd worden besproken. Injectiespuit infiltratie, worden de peptide-gebaseerde formuleringen ingebracht in de luchtruimten in de plant via de bladeren huidmondjes. Om maximale opname van de oplossing te waarborgen, moet de infiltratie werkwijze worden uitgevoerd als de planten onder omstandigheden die bevorderlijk zijn voor stomatale opening dwz. Zijn voorzien van voldoende water en tijdens de lichtperiode. Met betrekking tot de bereiding van transfectie complexen van formuleringen die een combinatie van twee peptiden (voor mitochondriale target DNA afgifte) omvatten, de volgorde van toevoeging van elke component is belangrijk en moet niet worden omgekeerd.

Er zijn veel plausibele aanpassingen aan de procedure. Een andere optie voor de infiltratie van plantencellen is het gebruik van vacuüm infiltratie, die in staat is de complexoplossing nemen in gehele planten en / of gedeeltelijke weefsels waaronderapicale meristemen. Voor deze alternatieve procedure wordt zaailingen ondergedompeld in de transfectie oplossing, en gebaseerd op de druk die door het vacuüm, worden de peptide-complexen lading gedwongen door de huidmondjes en in de plantencellen (Yoshizumi, T., ongepubliceerde gegevens).

Transiënte genexpressie, gebaseerd op studies met dierlijke cellen, is aangetoond dat DNA toe met hogere concentraties 29-31. Het is belangrijk op te merken dat de verhouding van peptide tot DNA invloed op de biofysische eigenschappen (grootte, oppervlaktelading) complexen (figuur 4), die transfectie-efficiëntie beïnvloedt; vandaar, de optimale verhouding moet worden gehandhaafd, zelfs met verhoogde DNA-concentratie.

Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik peptiden als een gen / eiwit toedieningsagens is dat de sequentie vatbaar is voor het afstemmen op een gewenste functie. Bijvoorbeeld, de mitochondriale doeldomein van de drager peptide in dit study kan worden vervangen chloroplast of peroxisomale targeting sequenties voor lokalisatie naar deze organellen. Terwijl chloroplastentransformatie in verschillende fabrieken kan via biolistiek 32-34, kan noch de Agrobacterium of de biolistische werkwijze genen in de mitochondriën of andere organellen naast de kern (tabel 2) te introduceren.

Er zijn geen starre gastheerbereik beperkingen voor peptide-gebaseerde transfectie, in tegenstelling tot de Agrobacterium gebaseerde methode (tabel 2). Tot nu toe hebben formuleringen voor de transfectie van A. thaliana, N. benthamiana en populier geoptimaliseerd (Tabel 1), maar de werkwijze kan ook worden toegepast Nicotiana tabacum, tomato cultivar Micro-Tom, rijst (gebaseerd op inleidende experimenten), en andere mono- en dicotyle planten.

Tot dusver is er geen bekende beperking transgen grootte wanneer peptiden worden gebruikt eens transfectievectoren. Daarentegen hebben grote DNA-moleculen is gevonden dat de transformatie-efficiëntie van Agrobacterium-gemedieerde werkwijzen 35,36, en een bovenste limiet voor transgenen van ongeveer 200 kb gerapporteerd 37-39 verminderen. Gebruik biolistiek, anderzijds, grote DNA fragmenten kunnen worden afgeschoven gedurende de bereiding of aflevering in planten 38. Hoewel er geen bovengrens voor biolistische transformatie nu toe is gedaan, zijn fysieke bedwingt gevonden dat de grootte van DNA die kan worden overgedragen naar minder dan 150 kb 40 beperken. De belangrijkste voordelen van het peptide gebaseerd systeem voor genoverdracht vergeleken met bestaande benaderingen die gebruikmaken van Agrobacterium of microprojectielen, hierboven besproken, zijn samengevat in Tabel 2.

Een paar beperkingen bestaan ​​voor deze methode in zijn huidige vorm. Enerzijds gerichte afgifte van pDNA specifieke organellen, zoals mitochondria is mogelijk bewezen door een eenvoudige combinatie van DNA-bindende, cel-penetrerende en organel-transit-sequenties, hoewel het rendement laag was. Transgenexpressie worden gedetecteerd door confocale microscopie, slechts een kleine populatie van mitochondria in cellen. Dus verdere wijzigingen nodig om: (i) verbetering van de translocatie van meer complexen in de cel / organellen membraan, en (ii) het verbeteren van de dissociatie en overdracht van pDNA uit de drager peptide in het doelorganel voor expressie. Ten tweede het gebruik van dit DNA-afgiftesysteem, de tijdelijke expressie van exogene reportergenen werd succesvol bereikt in de cytosolische en mitochondriale compartiment van cellen. Stabiele integratie en expressie van de ingebrachte genen in de plant nucleaire / organellen genoom nog niet vastgesteld, maar vanwege het ontbreken van geschikte selectiestrategieën.

Hoewel zij erkent dat er ruimte voor verbetering of verdere development, de-peptide afgeleide strategie die hier beschreven blijft een eenvoudige en veelzijdige techniek die de weg voor de levering van verschillende ladingen in diverse plantensoorten heeft gebaand.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag tot financiering uit Japan Science and Technology Agency Exploratory Research for Advanced Technology (JST-ERATO), de Nieuwe Energie en Industriële Technologie Development Organization (NEDO), en de Cross-ministeriële Strategic Innovation Promotion Program (SIP), Japan erkennen .

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(KH)9-BP100 peptideCustom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science InstituteN/ASequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptideCustom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science InstituteN/ASequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
KYLKKKKKKKK
BP100 peptideCustom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science InstituteN/ASequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptideCustom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science InstituteN/ASequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS en P35S-RLuc-TNOSN/AN/ACodeert voor groen fluorescerend eiwit en Renilla luciferase genen, respectievelijk, onder controle van CaMV 35S constitutieve promotor (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp en pDONR-cox2:rlucN/AN/ACodeert voor groen fluorescerend eiwit en Renilla luciferase genen, respectievelijk, onder controle van cox2 mitochondriaal-specifieke promotor (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-versterkt van pBI221-P35S-Rluc-TNOS)N/AN/ACodeert voor groen fluorescerend eiwit en Renilla luciferase genen, respectievelijk, onder controle van CaMV 35S constitutieve promotor (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/AN/AVoor RNA interferentie-gemedieerde silencing van groen fluorescerend eiwit (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/AVoor RNA interferentie-gemedieerde silencing van chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 ml en 10 ml plastic spuitenTERUMO CorporationSS-01T, SS-10ESZ
1.5 ml microcentrifugebuisjeAS ONE Corporation151212
96-Well platte bodem plaatAsahi Glass Co., Ltd.3860-096
KleefbandSekisui Chemical Co., Ltd.No. 835
Alcohol dehydrogenaseSigma-Aldrich Co., LLC.A-7011
Atomaire krachtmicroscoopSeiko Instruments Inc.SPI3800, SPA 300HV
Atomaire krachtmicroscoopHitachi High-Tech Science CorporationAFM5300E
BCA eiwit assay kitThermo Fisher Scientific Inc.23227
CantileverHitachi High-Tech Science CorporationK-A102001593
Confocal Laser Scanning MicroscoopCarl ZeissLSM700
KurksponerSigma-Aldrich Co., LLC.Z165220Voor het uitsnijden van bladeren in 1-cm diameter schijven
DekglasMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
CuvetSarstedt759116
Geplooid capillair celMalvern Instruments, Ltd.DTS1070
PincetShimizu Akira Inc.Stainless pincet 150
Homogenisatie stamperIeda Trading Corp.9993
MicaNisshin EM Co., Ltd.LC23Z
MicrocentrifugeBeckman CoulterBKA46472
Microplate lezerMolecular Devices CorporationSpectra MAX M3
Microscoop glaasjeMatsunami Glass Ind., Ltd.S011120
PipetEppendorf Research® plus3120000909
Pipet tipsAS ONE Corporation2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Kunststof petrischaalAS ONE Corporation1-7484-01
Renilla luciferase assay kitPromega corporationE2810
Rhodamine B isothiocyanateSigma-Aldrich Co., LLC.283924
RNase-vrij waterQiagen129112
NatriumcarbonaatWako Pure Chemical Industries, Ltd.199-01585
Chirurgische mes en handvatFEATHER Safety Razor Co., Ltd.Roestvrij staal No. 14 (mes), No. 3L (handvat)
Spuit tip dopMusashi Engineering Inc.NC-3E
WeegschaalSartoriusCPA225D
Zeta potentiometerMalvern Instruments, Ltd.Zetasizer Nano-ZS

Referenties

  1. Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
  2. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  4. Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
  5. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
  6. Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
  7. Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
  8. Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
  9. Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
  10. Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
  11. Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
  12. Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
  13. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
  14. Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
  15. Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
  16. Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
  17. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
  18. Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
  19. Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
  20. Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
  21. Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751(2015).
  22. Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).
  23. Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081(2016).
  24. Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
  25. Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
  26. Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
  27. Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
  28. Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
  29. Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
  30. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
  32. Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
  33. Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
  34. Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
  35. Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
  36. Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
  37. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
  38. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379(2014).
  39. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
  40. Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PeptidenafleveringGentransportProte netransportPlantentransformatieSpuiteninfiltratieDynamische LichtverstrooiingZeta potentiaalmetingAtoomkrachtmicroscopieConfocale MicroscopieRenilla Luciferase assay

Gerelateerde artikelen