Method Article

Ontwikkeling van een Direct-Pulp aftopping model voor de evaluatie van pulpal wondgenezing en Reparative Dentin Formation in Muizen

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een stap voor stap methode om direct pulp aftopping op muizen tanden voor de evaluatie van pulpa wondgenezing en vorming herstellende dentine in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De tandpulp is een vitaal orgaan van een tand dat volledig beschermd wordt door glazuur en dentine. Wanneer de pulp wordt blootgesteld door cariogeen of iatrogeen letsel, wordt deze vaak bedekt met biocompatibele materialen om de genezing van de pulpwond te versnellen. Het uiteindelijke doel is het regenereren van reparatieve dentine, een fysische barrière die functioneert als een "biologische verzegeling" en het onderliggende pulpweefsel beschermt. Hoewel deze directe pulpkappenprocedure al lang wordt gebruikt in de tandheelkunde, is het onderliggende moleculaire mechanisme van pulpgenezing en de vorming van reparatief dentine nog steeds slecht begrepen. Om reparatief dentine te induceren, is pulpkappen experimenteel uitgevoerd bij grote dieren, maar minder bij muizen, waarschijnlijk vanwege hun kleine omvang en de daaruit voortvloeiende technische moeilijkheden. Hier presenteren we een gedetailleerde, stap-voor-stap methode om een pulpkappenprocedure bij muizen uit te voeren, inclusief de voorbereiding van een Klasse-I-achtige holte, het plaatsen van pulpkappenmaterialen en de restauratieprocedure met behulp van tandcomposiet. Ons pulpkappen muismodel zal instrumenteel zijn bij het onderzoeken van de fundamentele moleculaire mechanismen van pulpgenezing in de context van reparatief dentine in vivo door het mogelijk te maken om transgene of knockout-muizen te gebruiken die wijd beschikbaar zijn in de onderzoeksgemeenschap.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tandcariës is een van de meest voorkomende orale ziekten en de belangrijkste oorzaak van chirurgische ingrepen aan de gebitsopstelling bij bijna alle individuen1,2. De prognose van chirurgische ingrepen en restauraties van een tand hangt grotendeels af van een goede pulpale respons en succesvolle wondgenezing. Inderdaad, tandcariës die diep door het tandglazuur en dentine penetreren, leiden vaak tot de blootstelling van het onderliggende pulpweefsel dat vaak wordt "afgedekt" met tandheelkundige materialen, zoals calciumhydroxide (Ca(OH)2) of hydraulische calcium-silicaatcementen (HCSC's), inclusief minerale trioxide aggregaten (MTA). Het uiteindelijke doel van een dergelijke pulpa-afdekprocedure is om de pulpale wondgenezing te versnellen door regeneratieve dentine te vormen, een fysische barrière die functioneert als een "biologische afdichting" om het onderliggende pulpweefsel te beschermen en de levensverwachting van de tand en de algehele mondgezondheid te verlengen. De onderliggende mechanismen van pulpale wondgenezing en regeneratieve dentinevorming zijn echter niet volledig begrepen.

Om de mechanismen van pulpale wondgenezing en regeneratieve dentinevorming in vivo beter te begrijpen, zijn eerder verschillende dieren gebruikt, waaronder apen, honden en varkens3-5. Onder hen worden ratten vaak gebruikt omdat ze relatief kleiner zijn in vergelijking met de andere dieren, maar hun tanden zijn groot genoeg om directe pulpa-afdekking uit te voeren zonder technische moeilijkheden6-10. Deze diermodellen zijn ideale alternatieven voor menselijke studies om pulpale reacties en regeneratieve dentinevorming te onderzoeken. Hun gebruik is echter beperkt tot observationele studies op cellulair niveau en ze geven nauwelijks mechanistische inzichten tijdens de regeneratieve dentinevorming op moleculair niveau.

Recente technische vooruitgang in genetische techniek heeft waardevolle en onmisbare onderzoeksinstrumenten opgeleverd - muizen die een gen bevatten dat ofwel overgeëxpresseerd of verwijderd is - die onmisbaar zijn voor het bestuderen van moleculaire mechanismen van menselijke ziekten in vivo. Het aantal verschillende stammen van transgene of knockout muizen die op strategische wijze op celspecifieke wijze inducibel zijn, groeit voortdurend in de wetenschappelijke gemeenschap. Daarom zou het onderzoeken van pulpale wondgenezing en regeneratieve dentine in deze muizen sterk helpen om ons begrip van deze processen op moleculair niveau te versnellen. Het gebruik van muizen wordt echter aanzienlijk geremd, omdat het uitvoeren van een pulpa-afdekprocedure op een muis-tand technisch uitdagend is vanwege de miniatuurgrootte. Hier presenteren we onze reproduceerbare methode om directe pulpa-afdekking uit te voeren bij muizen voor de evaluatie van pulpale wondgenezing en regeneratieve dentinevorming in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory en bewaard in een pathogeen-vrij vivarium in het UCLA afdeling Laboratory Animal Medicine (DLAM). De experimenten werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde institutionele richtlijnen van het Comité van de kanselier's Animal Research (ARC # 2016-037).

1. Mouse verdoving

  1. Met acht weken oude vrouwelijke C57 / BL6 muizen (n = 3).
  2. Verdoven de muizen middels ketamine (80-120 mg / kg muis gewicht) / xylazine (5 mg / kg muis gewicht) oplossingen en beheren intraperitoneaal (ip) bij een dosis van 10 mL / kg.
  3. Bereid ketamine (80-120 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) en oplossingen dienen ze intraperitoneaal (ip) bij een dosis van 10 mL / kg.
  4. Controleer of de muizen volledig verdoofd door het uitvoeren van een teen knijpen.

2.-Pulp aftopping Procedure

  1. Plaats de mond houder in de mond van de muis.
  2. Zet de mond houder op de tafel, zodat de hijadvertentie is naar boven gericht.
  3. Plaats de microscoop (10X) bovenop de mond zodat de eerste bovenkaak molaar volledig zichtbaar.
  4. Met de ¼-ronde boor in een high-speed handstuk bij 200.000 rpm, verwijdert het glazuur gedeelte van de tand in het midden totdat de pulp zichtbaar door de transparante dentine. Laat de pulp met de boor niet bloot.
  5. Met behulp van een # 15 endodontic K-bestand (met een diameter van 150 micrometer), perforeren door de dentine en bloot de pulp.
    LET OP: Speciale aandacht moet worden genomen, zodat de dentine afval niet wordt geduwd in de pulp. Dit kan vermeden worden door rotatie van de K-bestand kwartaal plaatsen en de K-bestand out.
  6. MTA mengen met steriel H2O volgens de instructies van de fabrikant. Lever en plaats de MTA op de blootgestelde pulp met de punt van de onderzoeker. Gebruik de achterkant van het papier punt (fijn) aan de MTA te verpakken in de blootgestelde pulp door zachtjes te tikken. Hoe dikker zijde van het papier punt is vlak en daarom laatvoor een goede condensatie van de MTA in de blootliggende pulp.
  7. Etsen tand gedurende 15 s door het plaatsen van het 35% fosforzuur etsmiddel waar het alleen betrekking op de tand. Wees extra voorzichtig om de plaatsing van het etsmiddel te beperken, zoals het tandvlees weefsels kunnen irriteren.
    Opmerking: Het etsmiddel wordt geleverd in een injectiespuit en wordt gebruikt om de tanden te ruwen zodat adhesieven in kan stromen naar micromechanische binding mediëren op de tand. Omdat ze viskeus, kan het onafhankelijk door toepassing van kleine hoeveelheden direct op de tand.
  8. Gebruik negatieve druk zuigkracht aan het etsmiddel te verwijderen. Gebruik een wattenstaafje dat licht is doordrenkt met H 2 O om de resten van het etsmiddel te verwijderen. Herhaal deze stap tot het etsmiddel volledig van de tand wordt verwijderd.
  9. Met behulp van een perslucht stofdoek, voorzichtig droog de tand.
  10. Breng de dentale hechtmiddelen via de achterzijde van het papier punt.
  11. Maak de kleeflaag dunne met behulp van perslucht voor 3 s.
  12. Cure de tandheelkundige kleefstoffen voor 20 s met behulp van de uitharding-light unit.
  13. Plaats de vloeibare composiet in kleine hoeveelheden op de tand die werd afgesloten met MTA. Gebruik de punt van de verkenner op de samengestelde stromen in de tand groeven.
  14. Genezen van de composiet gedurende 30 seconden met behulp van een licht uitharden unit te polymeriseren. Bevestigen dat de samengestelde volledig is uitgehard en hard met behulp van de verkenner.

3. Post-op Care

  1. Dien carprofen (5 mg / kg) subcutaan (sc) onmiddellijk na de capping-pulp procedure.
  2. Leg de muizen op een verwarmingselement op laag vermogen om de dieren warm te houden voordat ze wakker worden.
  3. Zet de muizen om het terrarium voor huisvesting.

4. Tissue Procurement

  1. Na 5-6 weken, euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie onder een volledige narcose staat met isofluraan.
  2. Verwijder voorzichtig de bovenkaak uit de basis van de schedel en zet het in een 50-mL buis. Bevestig de entire maxilla dat zowel de pulp bedekte tanden en de contralaterale uncapped tand in 4% paraformaldehyde in PBS, pH 7,4 bevat, bij 4 ° C overnacht, en bewaar vervolgens in een 70% ethanoloplossing.
    LET OP: Paraformaldehyde is giftig en kankerverwekkend. Het juiste gebruik paraformaldehyde moeten worden gecontroleerd zoals beschreven in de standaard operationele procedures (SOP).
  3. Scan de muis maxillae met behulp van de μCT scan. Om de maxillae te beveiligen tijdens het scannen, wikkel de monsters met een gaasje doordrenkt met 70% ethanol en plaats ze in de 15-mL celcultuur buis.

5. μCT Scanning

  1. Bereid de monsters voor μCT scannen. In het kort, wikkel de monsters met een gaasje doordrenkt met 70% ethanol en zet ze in een algemene 15-mL celkweek conische buis. Monteer de slang op de μCT scannende platform, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.
  2. Stel de röntgenbron om een ​​stroom van 145 uA, een spanning van 55 kVp en een belichtingstijd van 200 ms.
  3. Voer beeldacquisitie met de μCT scanner op een 20-um-resolutie en met een 0,5 mm Al filter.
  4. Reconstrueren van het beeld en visualiseren 11.
  5. Zodra de μCT scan is voltooid, start ontkalking met 5% EDTA en 4% sucrose in PBS (pH 7,4) gedurende 2 weken.

6. Weefsel bewerken en kleuring

  1. Insluiten de ontkalkt weefsels in paraffine. Voor het inbedden, trim de bovenkaak door het maken van een sagittale snede onmiddellijk anterior naar de eerste kies. Terwijl inbedden plaatst dit oppervlak omlaag, zodat de langsdoorsnede van de eerste molaar is het snijoppervlak.
  2. Met behulp van de microtoom, voor te bereiden 5 urn dikke dia's. De pulp capping gebieden meestal samen met de distopalatal (DP) wortel, die kan worden gebruikt als een mijlpaal. Bepaal het precieze gebied van belang door onderzoek van de histologie onder de lichtmicroscoop en het vergelijken van de μCT beelden.
  3. Voor H & E kleuring, deparaffinize en hydrateren de glaasjes met xyleen (2 x) en serieel verdunde ethanol (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x en 70% EtOH 1x).
  4. Spoel de dia's met stromend water.
  5. Vlek met Hematoxylin oplossing voor 2,5 minuten en spoel af met leidingwater.
  6. Dompel de glaasjes in 95% ethanol gedurende 1 minuut.
  7. Vlek met Eosine oplossing voor 1 min en spoel af met leidingwater.
  8. Dehydrateren met serieel verdunde ethanol (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x en 3x 100% EtOH) en xyleen (3x).
  9. Monteer de dia's met montage-oplossing.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier toonden we de procedures stap-voor-stap om pulp uit te voeren aftopping op muizen tanden. Een van de belangrijkste aspecten van de pulp aftopping in muizen is om de juiste apparatuur hebben. In dit verband heeft de microscoop met 10x vermogenvergroting essentieel (Figuur 1A). Een klasse-I-achtige preparaat in de tand maken, gebruikten we een ¼-round burr in een elektrische hoge snelheid handstuk bij 200.000 rpm (Figuur 1B). Alternatief andere motore...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Momenteel zijn er verschillende experimentele modellen voor de in vivo effecten van tandheelkundige materialen, scaffolds of groeifactoren op odontogene differentiatie van dentale pulp stamcellen (DPSC's) 13 te valideren. Deze modellen omvatten ectopische autologe transplantatie van DPSC's in een orgaan, zoals de renale capsule of subcutane transplantatie van DPSC in immuungecompromitteerde muizen met steigers 14,15. Echter, deze methoden beperkt hun odontogene effect op DPSC's...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door R01DE023348 (RHK) van NIDCR / NIH en de Faculteit Research Grant (RHK) van de Raad voor onderzoek van de Academische Senaat van de afdeling Los Angeles van de Universiteit van Californië.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED stereo microscopeMEIJI TechnoMicroscoop 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Elektrische motormotor
isofluraneHenry schein diergezondheidNDC 11695-0500-2
1/4 ronde stiftBrasseler001092T0
Endodontische K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Papier puntHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent product Inc.Fosforzuur etser
OptiBond SoloPlusKerr29669Klevende middelen
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Uithardingslicht unit
Karakterisering tintBiscoT-14012Flowable composiet
SkyscanBreuker1275uCT scanner
MicromThermoHM355SMicrotoom
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Montage oplossing

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197(2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40(2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from: http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf (2011).
  12. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  13. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).
  14. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  15. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  16. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  17. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  18. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  19. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  20. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  21. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  22. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  23. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  24. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503(2016).
  25. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  26. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  27. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  28. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  29. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  30. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  31. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  32. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Pulp cappingPulpal Wound HealingReparative Dentin FormationMouse ModelCavity PreparationMTA PlacementDental CompositeMicro CT ScanHistological AnalysisDMP1 Staining

Related Articles