Methodenartikel

3D Whole-hart myocard Tissue Analyse

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54974

⸱

12 april 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Division Heart and Lungs, University Medical Center Utrecht, 2MIRA Institute, University Twente

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor de vergelijking van 3D gehele hart hartspierweefsel met MRI. Dit is bedoeld voor nauwkeurige vaststelling van intramyocardiale injecties in het infarct grensgebied van een chronische varkensmodel van myocardiaal infarct.

Samenvatting

Cardiale regeneratieve therapieën gericht op de bescherming en het herstel van de gewonde hart bij patiënten met een ischemische hartziekte. Door het injecteren van stamcellen of andere biologische stoffen die angio of vasculogenese te verbeteren in de infarct randgebied (ALC) wordt weefselperfusie verbeterd en het myocardium te beschermen tegen verdere beschadiging. Voor een maximaal therapeutisch effect, is de hypothese dat de regeneratieve stof is het beste geleverd aan de IBZ. Dit vereist een nauwkeurige injecties en heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe injectietechnieken. Om deze nieuwe technieken te valideren, hebben we een validatie protocol ontworpen op basis van hartspierweefsel analyse. Dit protocol omvat hele hart myocardiaal weefsel processing uitvoerige tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) analyse van de cardiale anatomie en intramyocardiale injecties mogelijk maakt. In een varken, werd myocardiaal infarct door een 90 min occlusie van de linker voorste dalende kransslagader. Vier weken later, een mixture van een hydrogel met superparamagnetische ijzeroxidedeeltjes (SPIOs) en fluorescente korrels werd geïnjecteerd in de IBZ gebruikmaking van een minimaal-invasieve endocardiale benadering. 1 uur nadat de injectieprocedure, werd het varken euthanized en het hart werd uitgesneden en ingebed in agarose (agar). Na het stollen van de agar werd magnetische resonantie beeldvorming (MRI), snijden van het hart en fluorescentie beeldvorming uitgevoerd. Na het post-processing, werd 3D-analyse uitgevoerd om de IBZ targeting nauwkeurigheid te beoordelen. Dit protocol verschaft een gestructureerde en reproduceerbare werkwijze voor het beoordelen van de targeting nauwkeurig intramyocardiale injecties in de ALC. Het protocol kan gemakkelijk worden gebruikt bij de behandeling van littekenweefsel en / of valideren van de injectie nauwkeurigheid van het gehele hart gewenst.

Inleiding

Ischemische hartziekte heeft 's werelds grootste doodsoorzaak in de afgelopen decennia 1. Acute behandeling na een myocardinfarct is bedoeld om de bloedstroom naar de hartspier te herstellen via percutane coronaire interventie of coronaire bypass operatie. In ernstige infarcten, is een groot gebied van het myocardium littekens en deze gevallen vaak tot ischemisch hartfalen (HF) 2. De huidige behandeling opties voor het HF aandacht voor preventie en het behoud van de hartfunctie van de HF-patiënten, maar niet op regeneratie.

In de afgelopen tien jaar hebben cardiale regeneratieve therapieën onderzocht als een optie voor de behandeling HF 3. Deze therapie is gericht op biologische, zoals stamcellen of groeifactoren leveren direct naar gewonden myocardium revascularisatie, bescherming cardiomyocyten, differentiatie induceren en groei 4. voor een optimaletherapeutische werking, wordt verondersteld dat de biologische het infarct grenszone (ALC) moet worden geïnjecteerd om goede weefselperfusie voor het voortbestaan van de biologische en voor een optimaal effect op de doelzone 5, 6 te vergemakkelijken. Meerdere technieken zijn ontwikkeld voor de identificatie en visualisatie van de IBZ uitvoeren om intramyocardiale injecties 7, 8, 9, 10, 11 geleiden. Naast de identificatie en visualisatie van de IBZ de levering voert tevens aan biomaterialen en injectie katheters. Aan de injectie nauwkeurigheid van de afgiftetechnieken valideren, is een nauwkeurige en reproduceerbare kwantitatieve methode vereist.

We hebben een protocol voor het hele hart hartspierweefsel verwerking die tweedimensionale (2D) biedt en drie-Dimensio ontwikkeldNal (3D) beeldvorming, die kan worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve studie beoogt. Het protocol omvat het inbedden en digitale beeldanalyse. In dit artikel tonen we een protocol voor de beoordeling van de richtende nauwkeurigheid van intramyocardiale injecties in de IBZ een grote varkensmodel van chronische myocardiaal infarct.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De in vivo experiment werd uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren opgesteld door het Institute of Laboratory Animal Research. Het experiment werd goedgekeurd door de lokale Dierexperimentencommissie.

1. Bereiding van injecteerbare and Embedding Solution

  1. Bereid de injecteerbare gel.
    1. Bereid 1 ml ureido-pyrimidinon (UPy) gel volgens eerder beschreven protocollen 12, 13.
    2. Voeg superparamagnetische ijzeroxidedeeltjes (SPIOs) aan de oplossing tot een concentratie van 15 ug / ml te krijgen en roer het mengsel gedurende 5 minuten voor gelijkmatige verdeling.
    3. Voeg de fluorescente microkraaltjes aan de oplossing tot een concentratie van 10.000 kralen / ml te krijgen en roer het mengsel gedurende 5 minuten voor gelijkmatige verdeling.
    4. Bewaar het resulterende mengsel bij kamertemperatuur in een donkere omgeving. Warme en vortex of roer thij oplossing kort voor de injectie procedure.
  2. Bereid de inbedding oplossing.
    1. Begin met leidingwater bij kamertemperatuur en voeg agarose (agar) tot een concentratie van 4 gew%.
    2. Langzaam verwarmen van de oplossing tot het kookpunt onder toepassing van een microgolfoven en roer regelmatig tijdens het verwarmen. Bij het bereiken van het kookpunt, opslaan en houd de agar oplossing boven 70 ° C gedurende 2 uur om luchtbellen naar het oppervlak.
    3. Laat de agar afkoelen bij kamertemperatuur tot een temperatuur tussen 50 en 60 ° C tot het tijdstip van inbedden.

2. Injectie Procedure

  1. Voeren premedicatie (anti-aritmica, anti-bloedplaatjes therapie en pijnstillers), verdoving, veneuze toegang en intubatie, zoals eerder beschreven 14.
  2. Injecties voeren via een injectie intramyocardiale katheter (Table of Materials). Voor elke injectie, 0.2 ml van het mengsel geïnjecteerd in een bolus met een constante snelheid van ongeveer 0,3 ml / min met behulp van een injectie-inrichting. Plaats de injecties op verschillende plaatsen langs de IBZ 12.
  3. Toedienen van 0,2 ml / kg (1,0 mmol / ml) van een op gadolinium gebaseerde contrastmiddel 15 minuten voorafgaand aan euthanasie het dier.
  4. Dienen 20 ml 7,5% kaliumchloride intraveneus toegediend aan het dier inslapen.
  5. Veilige toegang mediastinale onderstaande voorschriften stappen 8,2-8,3, zoals beschreven door Koudstaal et al. 14. Snijd de inferieure vena cava 5 cm van de rechter atrium en verwijder uitstromende bloed met een zuiginrichting. Accijnzen het hart en spoel deze met 0,9% zoutoplossing bij kamertemperatuur.

3. Inbedding Procedure

  1. Bereid het hart.
    1. Verwijder het hartzakje van het hart terwijl de boezems en kamers intact. Ontleden de opgaande aorta ± 1 cm boven de aortaklep via Klinkenbergschaar. Snijd de inferieure vena cava ± 1 cm van het atrium, en doe hetzelfde voor de longaders.
    2. Hechten de apex van het hart naar de bodem van een plasticinsluiting houder (17 x 15 x 15 cm, B x D x H) met een 2-0 hechtdraad flotatie van het hart tijdens het inbedden voorkomen (Figuur 1A).
    3. Hechten het resterende deel van de aorta naar de randen van de container via 2-0, ervoor zorgen dat het hart wordt gecentreerd en de wanden van de houder (figuur 1B) niet aanraken.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave en de Foto van Embedding Container. (A) Schematische weergave van het inbeddingsproces. Het hart (rood) is bevestigd in de container (blauw) met behulp van hechtingen. Na het vullen van het hart met de agar-oplossing, wordt de ruimte rond het hart gevuld. Tenslotte,twee stijve kunststofbuizen (geel) zijn gepositioneerd in het vat, naast maar niet aanraken van het hart, om te dienen als referentie tijdens beeldregistratie. (B) Foto van een hart vastgezet in de inbedding container. De hechtingen worden vastgeklemd aan de rand van de houder via mosquito klemmen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

  1. Insluiten het hart in een eind-diastolische-achtige geometrie.
    NB: Het voorkomen van luchtbel schepping nodig is. Indien grote aanwezige lucht in de agaroplossing bellen, houdt de agar bij 40 ° C, zodat de luchtbellen naar het oppervlak.
    1. Klem de inferieure vena cava gebruik mosquito klemmen. Injecteer langzaam het vloeibare agar met een 50 ml spuit in het rechter atrium via de superior vena cava totdat zowel het rechter atrium en ventrikel volledig gevuld zijn.
    2. Klem de longaders behulp mosquito klemmen. Voorzichtig langs een agar-gevulde 50 ml spuit retrograde door de aortaklep. Injecteer langzaam de oplossing in de linker ventrikel (LV) totdat de LV en het linker atrium volledig gevuld. Na het vullen van de LV, klem de aorta om de agar op de LV houden.
    3. Giet de rest van agar in de container, totdat het hart volledig is afgewerkt. Plaats twee stijve kunststof buizen binnen de inbedding houder dienen als referentiestructuren voor latere beeldregistratie (Figuur 1A). Zorg ervoor dat de buizen niet over de wanden van de container of het hart te raken.
    4. Laat de agar vast worden bij 2-7 ° C.

4. Image Acquisition

  1. Voer transversale ex vivo MRI-scans van het hart dat is ingebed in de container.
    1. Plaats de container met de embedded hart binnen een kopspoel (Table of Materials).
    2. Angulate de segmenten parallel aan de bodem van de houder. Gebruikdezelfde oriëntatie en gehoekt elke ex vivo MRI sequentie.
    3. Om myocardium visualiseren Voer een fluïdum verzwakt inverse recovery (FLAIR) sequentie met de volgende parameters: herhalingstijd [TR] / echotijd [TE] = 10 s / 140 ms, flip = 90 °, pixelgrootte = 0,5 x 0,5 mm, gezichtsveld [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 matrix en 3 mm plakdikte.
    4. Het myocardinfarct visualiseren, voert een late gadoliniumversterkte (LGE) sequentie met de volgende parameters: [TR] / [TE] = 5,53 ms / 1,69 ms, flip-hoek = 25 °, pixelgrootte = 1,0 x 1,0 mm, [ FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 matrix en 3 mm plakdikte.
    5. SPIOs te visualiseren Voer T2 * gewogen gradiëntecho-sequentie met de volgende parameters: [TR] / [TE] = 88,7 ms / 15 gelijkelijk verdeelde TEs met een bereik van 1,9-24,6 ms, flip-hoek = 15 °, pixel size = 0,5 x 0,5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 matrix en 3 mm plakdikte.
  2. tissue proceszingen
    1. Draai de houder ondersteboven en er lucht tussen de agar en de zijkanten van de houder naar de vaste agar-oplossing te verwijderen, met inbegrip van het hart, van de houder. Verwijder het plastic staven van de vaste agar.
    2. Gedeelte agar blok met het hart in 5 mm segmenten van de apex tot de basis van het hart met behulp van een vlees snijmachine. Houd de angulatie van de gesneden plakken hetzelfde als in de verworven MR-beelden door parallelle snijden aan de bodem van de agar blok.
    3. Vlekken op de agar plakjes (met inbegrip van het hart) gedurende 15 min bij 1 gew% 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) opgelost in 0,9% zoutoplossing bij 37 ° C en fotograferen de segmenten aan weerszijden van een verticaal aanzicht (figuur 2A). Vervolgens zorgvuldig spoelen segmenten in 0,9% zoutoplossing.
      LET OP: In deze studie, gebruikten we een dSLR setup met een geschikte lens / objectief, een statief, en uniforme verlichting. Echter, de foto's er alleen maar als een controle voor de beoordeling van het litteken gebied,dus konden we een andere opzet hebben gebruikt.
  3. fluorescentiebeeldvorming
    Opmerking: Afhankelijk van de excitatie- en emissiegolflengten van de fluorescerende microbolletjes, de juiste filterblok en excitatie lasers (bijvoorbeeld rood microkralen hier gebruikt hebben excitatie- en emissiegolflengte van 580 nm en 605 nm, respectievelijk, dus de geselecteerde excitatielaser en banddoorlaatfilters werden ingesteld op 532 nm, 580/30 nm en 610/30 nm, respectievelijk).
    1. Selecteer fluorescentie beeldvormende van de variabele-modus scanner. Stel de fotovermenigvuldigerbuis tot 430 V of equivalent en pixelgrootte 100 x 100 urn. Selecteer een excitatie laser (532 nm) het dichtst bij de excitatiegolflengte van het fluorescerende microbolletjes.
    2. Voor het eerste filterblok, selecteer een banddoorlaatfilter (580/30 nm) die overlapt met de emissiegolflengte van de geïnjecteerde fluorescentie korrels (kanaal 1). Selecteer een banddoorlaatfilter voor het tweede filterblok (610/30) buiten het emissie golflengte (kanaal 2).
      OPMERKING: De tweede filterblok dient als een negatieve controle en auto-fluorescentie te verwijderen terwijl de injectieplaatsen intact.
    3. Scant beide zijden van de segmenten in de agar fluorescentiemodus van de variabele-modus laserscanner met de twee kanalen. Zorg ervoor dat elk segment volledig wordt gescand, met inbegrip van de referentie-holes.

5. Post-processing

LET OP: De eerste stap in het post-processing is de handmatige segmentatie van het myocard met behulp van in-house ontwikkelde scripts om de endo- en epicardiale grenzen, evenals de injectieplaats traceren. Dit is hetzelfde voor zowel MRI en fluorescentie scans.

  1. Segment het myocard in de MRI-scans.
    1. Segment de endocardiale en epicardiale LV grenst aan het FLAIR MRI reeks beelden.
    2. Kopieer LV segmentatie van stap 5.1.1 naar LGE-MRI dataset segment litteken op de LGE MRI sequentie.
    3. Kopieer het myocard segmentatie van stap 5.1.1 om de T2 * gewogen dataset en het segment van de SPIO afzettingen in de LV myocard.
  2. Verwerk de fluorescentiebeelden en voer segmentaties.
    1. Laad de bestanden verkregen uit de variabele-modus scanner en een afzonderlijk beeld van elke dwarsdoorsnede hart slice.
    2. Flip de plakken die in de basis zijn gescand oriëntatie apex en fluorescentiebeelden tot een stapel gekozen voor beide kanalen die gericht van apex naar basis.
    3. Segment de endocardiale en epicardiale LV grenst aan de fluorescentie beelden.
    4. Segment het litteken met de hand op de fluorescentie beelden en gebruik de LGE-MRI-scan en de foto te litteken morfologie bevestigen.
    5. Trek de afbeeldingsstapel van kanaal 2 van de afbeeldingsstapel van kanaal 1 tot auto-fluorescentie sluiten. Handmatig segment de fluorescerende microbead deposities en het gebruik van de T2 * beelden ter bevestiging.
  3. Makeneen anatomisch correcte 3D geometrie Voer een rigide registratie van de segmenten in de afbeeldingsstapel basis van de referentiestructuren (de gaten door de stijve buizen). Berekenen en de toegepaste translatie en rotatie van elke afbeelding.
  4. Breng de opgeslagen transformaties om het beeld stacks en de segmentaties. Lineair interpoleren van de segmentaties van beide zijden van de segmenten naar de oorspronkelijke plakdikte reconstrueren en een 3D-model van de gegevens.

6. Analyse

  1. Voeren 2D en / of 3D-metingen van de afstand tussen de centra van de injectieplaatsen en IBZ op de injectie nauwkeurig te beoordelen. Meet de afstand langs de endocardgrens van de LV segmentatie. In figuur 2C en 2F is een voorbeeld van 2D- en 3D-metin- gen door de rode lijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

tissue Embedding

Door het inbedden werd een eind-diastolische-achtige geometrie vastgesteld. De agar succes gehecht aan het hartweefsel, waardoor het weefsel te snijden op de gewenste angulatie gelijke plakdikten (figuur 2A en 2C).

Schaarser en de injectieplaats Assessment

Voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Whole-hart 3D hartspierweefsel verwerken volgens dit protocol een gestructureerd methode die de 3D-analyse van het infarct, de IBZ en de uitgevoerde injecties met betrekking tot de cardiale anatomie mogelijk. Het vulvolume van het hart afhankelijk van de gewenste analyse. In deze studie, op de injectie nauwkeurig te beoordelen, hebben we geprobeerd om het hart te vullen tot het einde-diastolische geometrie zo dicht mogelijk lijken. Om dit te dwingen, wordt de LV apex aan de bodem van de houder en de LV wordt gevuld met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Marlijn Jansen, Joyce Visser en Martijn van Nieuwburg bedanken voor hun hulp bij de dierproeven. We sterk erkennen Martijn Froeling en Anke Wassink voor hun hulp bij de MRI-beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% SalineBraun
AgaroseRoche DiagnosticsWetenschappelijke kwaliteit multifunctionele agar
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410 GE Healthcare
Inbedding containerKunststof, afmetingen 17 x 14,5 x 14 cm
FluoSpheres Polystyrene MicrospheresInvitrogenF8834rood, 10 µm
GadoliniumGadovist1,0 mmol/mL
dS 32 kanaals hoofdspoelPhilipsOf soortgelijk
MatlabMathworksVoor compatibiliteit 2015a of nieuwer
VleessnijderBerkel
Myostar injectiekatheterBiosense Webster
Superparamagnetische ijzeroxidedeeltjesSinerem
Trifenyl-tetrazoliumchlorideMerck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0Ethicon
```

Referenties

  1. Nowbar, A. N., Howard, J. P., Ja Finegold,, Asaria, P., Francis, D. P. 2014 global geographic analysis of mortality from ischaemic heart disease by country, age and income: statistics from World Health Organisation and United Nations. Int J Cardiol. 174 (2), 293-298 (2014).
  2. Kannel, W. B., Belanger, A. J. Epidemiology of heart failure. Am Heart J. 121 (3), 951-957 (1991).
  3. Ibáñez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van De Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
  4. Bartunek, J., Vanderheyden, M., Hill, J., Terzic, A. Cells as biologics for cardiac repair in ischaemic heart failure. Heart. 96 (10), 792-800 (2010).
  5. Orlic, D., Kajstura, J., et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
  6. Nguyen, P. K., Lan, F., Wang, Y., Wu, J. C. Imaging: Guiding the Clinical Translation of Cardiac Stem Cell Therapy. Circ Res. 109 (8), 962-979 (2011).
  7. Psaltis, P. J., Worthley, S. G. Endoventricular electromechanical mapping-the diagnostic and therapeutic utility of the NOGA XP Cardiac Navigation System. J Cardiovasc Transl Res. 2 (1), 48-62 (2009).
  8. Tomkowiak, M. T., Klein, A. J., et al. Targeted transendocardial therapeutic delivery guided by MRI-x-ray image fusion. Catheter Cardiovasc Interv. 78 (3), 468-478 (2011).
  9. Dauwe, D. F., Nuyens, D., et al. Three-dimensional rotational angiography fused with multimodal imaging modalities for targeted endomyocardial injections in the ischaemic heart. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 15 (8), 900-907 (2014).
  10. van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. Multimodality infarct identification for optimal image-guided intramyocardial cell injections. Neth Heart J. 22 (11), 493-500 (2014).
  11. van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. Three dimensional fusion of electromechanical mapping and magnetic resonance imaging for real-time navigation of intramyocardial cell injections in a porcine model of chronic myocardial infarction. Int J Cardiovasc Imaging. 32 (5), 833-843 (2016).
  12. Pape, aC. H., Bakker, M. H., et al. An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart. J Vis Exp. (100), (2015).
  13. Bastings, M. M. C., Koudstaal, S., et al. A fast pH-switchable and self-healing supramolecular hydrogel carrier for guided, local catheter injection in the infarcted myocardium. Adv Healthc Mater. 3 (1), 70-78 (2014).
  14. Koudstaal, S., Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J. Vis. Exp. (86), (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D verwerking van weefsel van het gehele harttargeting van de randzone van het infarctMRI scanningfluorescentiebeeldvorminginbedding in agaroseweefselsnedenpost processing van beelden3D modelreconstructiebeoordeling van de injectienauwkeurigheid

Gerelateerde artikelen