Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

8.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

27 december 2016

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van intracellulaire signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd in levensvatbare cellen door fysische interactie met aangrenzende dode of stervende cellen. Het protocol richt zich op signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd door receptor-gemedieerde herkenning van de dode cellen, in tegenstelling tot hun fagocytische opname of afgifte van oplosbare mediatoren.

Samenvatting

Afsterven door apoptose, ook wel aangeduid als gereguleerde celdood verkrijgen meerdere nieuwe activiteiten waarmee ze de functie van aangrenzende levende cellen beïnvloeden. Vitale activiteiten, zoals overleving, proliferatie, groei, en differentiatie, behoren tot de vele celfuncties gemoduleerd door apoptotische cellen. Het vermogen om te herkennen en reageren op apoptotische cellen blijkt een algemene kenmerk van alle cellen, ongeacht geslacht of orgaan van oorsprong. De diversiteit en complexiteit van de respons op apoptotische cellen mandaat dat grote zorg worden genomen bij het ontleden van de signalerende pathways en gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor een bepaalde uitkomst. Met name moet een onderscheid worden gemaakt tussen de verschillende mechanismen die apoptotische cellen kunnen beïnvloeden intracellulaire signaleringsroutes in levensvatbare responder cellen, inclusief:-receptor gemedieerde opname van de apoptotische cellen, afgifte van oplosbare mediators van de apoptotische cellen en / of inzet van de phagocytic machines. Hier bieden we een protocol voor het identificeren van intracellulaire signalering gebeurtenissen die geïnduceerd worden in levensvatbare responder cellen na hun blootstelling aan apoptotische cellen. Een groot voordeel van het protocol ligt in de aandacht die het besteedt aan dissectie van het mechanisme waarmee apoptotische cellen moduleren signalering evenementen binnen reagerende cellen. Terwijl het protocol specifiek is voor een conditioneel onsterfelijk muizennier proximale tubulaire cellijn (BU.MPT cellen), is het gemakkelijk aangepast cellijnen die niet-epitheliale oorsprong en / of afkomstig uit andere dan de nier organen. Het gebruik van dode cellen als een stimulans introduceert een aantal unieke factoren die de detectie van intracellulaire signalering gebeurtenissen kunnen belemmeren. Deze problemen, alsmede strategieën om deze te minimaliseren of te omzeilen, zijn in het protocol beschreven. De toepassing van dit protocol moet onze groeiende kennis van de brede invloed die dode of stervende cellen uit te oefenen op hun live buren te helpen, zowel in de gezondheidszorg en in disease.

Inleiding

Apoptose of gereguleerde celdood 1, draagt op een essentiële manier om het onderhoud en de ontwikkeling van de weefsels. Het eenvoudigst bekeken, apoptose vergunningen oud, beschadigd, of overtollige cellen worden verwijderd zonder schade aan omringende weefsels 2,3. De bijdrage van apoptose aan weefsel homeostase echter aanzienlijk dynamischer en gevarieerd. Afsterven door apoptose verwerven meerdere nieuwe activiteiten, zowel uitgescheiden en celgebonden, waardoor zij de functie van aangrenzende levende cellen 4-10 beïnvloeden. Eerdere studies gericht op het vermogen van cellen om apoptotische 11-16 ontsteking onderdrukken, maar ook apoptotische cellen moduleert een breed scala van cellulaire functies, met inbegrip van vitale activiteiten 4,9,10 overleving, proliferatie 4,9,10, 17 differentiatie, 18 migratie en groei 19. Bovendien worden deze effecten niet beperkt tot professionele fagocyten, zoals macrofaags, maar breiden tot vrijwel alle geslachten en cellen, ook traditioneel niet-fagocytische cellen, zoals epitheel- en endotheelcellen 7,9,10,18-21.

De specifieke reactie van aangrenzende levende cellen na blootstelling aan apoptotische cellen afhankelijk van factoren die betrekking hebben op zowel de levensvatbare reagerende cellen en apoptotische cellen zelf. Hoewel bijvoorbeeld blootstelling aan apoptotische cellen de proliferatie van zowel murine macrofagen en nier proximale tubulaire epitheelcellen (PTECs) remt deze twee celtypen verschillen aanzienlijk in hun overlevingsreactie apoptotische cellen 4,6,9,10. Apoptotische cellen bevorderen van de overleving van macrofagen, maar wekken de apoptotische dood van PTECs 4,6,9,10. Met name kan de reactie op apoptotische cellen ook verschillen tussen reagerende cellen van dezelfde stam, afhankelijk van de reagerende cel orgaan van oorsprong 10 (bijvoorbeeld nier PTECs versus mammaire epithelialecellen) of de toestand van de activering 22 (bijvoorbeeld neutrofielen). Omgekeerd kan apoptotische cellen verschillende reacties oproepen in dezelfde cel afhankelijk van de aard van de apoptotische stimulus 10,23 of het stadium van apoptose 10,14.

Gezien de diverseness en complexiteit van de respons op apoptotische cellen, moet grote zorg worden genomen bij het ontleden van de signalerende pathways en gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor een bepaalde uitkomst. Ten eerste moet de reacties vereisen directe fysieke interactie tussen levensvatbare en apoptotische cellen worden onderscheiden van die opgewekt door oplosbare mediators vrijgelaten of gegenereerd door de apoptotische cellen 3,6-10. Als fysische interactie vereist is, dan een verder onderscheid moet worden uitgevoerd. Signaleringsgebeurtenissen kan afhangen van receptor-gemedieerde opname van de gladde spiercellen, onafhankelijk latere afblazen, of fagocytische opname, onafhankelijk van de specifieke receptor die de apoptotische cel bindt 3-7,9,10,19. In het laatste geval, de reactie is niet specifiek voor apoptotische cellen, en kan worden geactiveerd door een fagocytische materiaal 4,6.

Het belang van dit onderscheid kan weer worden gewaardeerd door de contrasterende responsen van macrofagen en nieren PTECs. Voor beide celtypen, blootstelling aan apoptotische cellen verandert de activiteit van het pro-survival Akt kinase. Modulatie is afhankelijk van de fysieke interactie, omdat de scheiding van reageren en apoptotische cellen door een 0,4 micrometer polycarbonaat membraan schaft de reactie 4,9,10,19. De reactie van PTECs is receptor-gemedieerde en onafhankelijk van fagocytose, terwijl de respons van macrofagen wordt aangedreven door fagocytose 4,9,10,19. Deze conclusie wordt ondersteund door het feit dat de blootstelling aan latex bolletjes, een neutrale fagocytische stimulus, heeft geen effect op Akt activiteit PTECs, maar imiteert het effect van apoptotische cellen in macrofagen 4,9.

"> Hoewel minder goed bestudeerd, afsterven door necrose of toevallige celdood 1, ook moduleren van de functie van het nabijgelegen levensvatbare cellen 3-10,19. Zoals apoptotische cellen, necrotische cellen hun werking uitoefenen via verschillende mechanismen, met name de lekkage intracellulaire inhoud door hun gescheurde celmembraan 3,5,6,9,24. Veel cellen, waaronder PTECs en macrofagen, beschikken over verschillende niet-concurrerende receptoren voor cellen sterven door necrose 5,9. Engagement van deze receptoren induceert signalering gebeurtenissen die vaak tegengesteld aan die geïnduceerd door blokkering van de receptoren voor apoptotische cellen 4-10,19. bijvoorbeeld in PTECs, necrotische cellen verhogen fosforylatie van Akt, terwijl apoptotische cellen verminderen fosforylering 9,10,19.

We beschrijven hier een protocol voor het identificeren van intracellulaire signalering gebeurtenissen geïnduceerd in vatbare nier PTECs doorgaande receptor gemedieerde opname van aangrenzende apoptotische PTECs 9,10,19. Terwijl het protocol specifiek is voor een conditioneel onsterfelijk gemaakte cellijn PTEC zogenaamde BU.MPT cellen 9,10,19,25,26, wordt gemakkelijk aangepast aan cellijnen die niet-epitheliale oorsprong en / of afkomstig van andere organen dan de nier. Belangrijk is dat het gebruik van apoptotische cellen als cel stimulus levert bepaalde inherente experimentele problemen vertonen met oplosbare liganden. De belangrijkste daarvan is dat apoptotische cellen moeten worden toegevoegd als een suspensie in plaats van als een oplossing. Deze moeilijkheden, alsmede strategieën om deze te minimaliseren of te omzeilen, zijn in het protocol beschreven. Bijna alle in het protocol beschreven technieken zijn eenvoudig en standaard celcultuur. Het voordeel van dit protocol ligt in de aandacht op het mechanismen waarmee apoptotische cellen moduleren signaaltransductie in reagerende cellen. Deze mechanismen omvatten het bindende oppervlak via determinanten of doorverbinden moleculen aan specifieke receptoren op de restige cel, de vrijlating van oplosbare mediators, en / of de betrokkenheid van de fagocytische machines. Necrotische cellen zijn in alle experimenten opdat resultaten zijn specifiek voor de wijze van celdood, en niet een algemene reactie op dode cellen. Een zorgvuldige benadering, zoals aanbevolen in dit protocol, is van cruciaal belang voor ons begrip van de steeds groeiende invloed die stervende cellen uit te oefenen op hun live buren, zowel in gezondheid en ziekte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereidingen

Opmerking: In dit protocol twee of meer cellijnen of primaire celculturen, onafhankelijk bereid onder specifieke omstandigheden. Deze preparaten omvatten apoptotische cellen (Protocol 1), necrotische cellen (protocol 2) en gezonde responder cellen (protocol 3). Na onafhankelijke bereiding worden apoptotische of necrotische cellen tot responder cellen toegevoegd en het resulterende signaal transductie wordt bewaakt (protocollen 4, 5 en 6).

  1. Bereid cultuur media en reagentia
    1. Bereid 500 ml kweekmedium A (voor gebruik bij het kweken cellen onder permissieve omstandigheden, zie paragraaf 1.2) door het volgende te combineren: 1x Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 4,5 g / l glucose, 584 mg / l ʟ-glutamine, 110 mg / l natriumpyruvaat, 100 eenheden / ml penicilline-streptomycine, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 10 eenheden / ml interferon-γ (IFN-γ).
    2. Bereid 500 ml kweekmedium B (voor gebruik when-serum uitgehongerde cellen onder niet-permissieve condities, zie paragraaf 1.2) door het weglaten van FBS en IFN-γ van het recept van kweekmedium A. Om cellen groeien onder niet-permissieve omstandigheden (voorafgaand aan serum-uithongering), voeg 10% v / v FBS aan kweekmedium B.
    3. Bereid 0,4% (v / v) paraformaldehyde, pH 7,2, in 1 x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) van 4% paraformaldehyde voorraad voor fixatie van dode cellen.
      Opmerking: Paraformaldehyde is giftig, en de nodige voorzichtigheid moet worden betracht bij het gebruik ervan.
  2. Cultuur BU.MPT cellen
    1. Dooi van vloeibare stikstof één flacon BU.MPT cellen.
      Opmerking: BU.MPT een muis nier proximale tubulaire epitheel cel (PTEC) lijn afgeleid van een transgene muis die van een temperatuurgevoelige (ts) mutatie (tsA58) van het SV40 grote tumor-antigeen (TAg) onder controle van de muis belangrijkste histocompatibility complex (MHC) H-2Kb klasse I promotor 25,26.
    2. Plaat cellen op steriele polystyrene vacuüm-gasplasma behandeld weefselkweek gerechten (~ 5 x 10 6 cellen per 100 mm diameter gerecht).
    3. Kweek cellen onder permissie-omstandigheden in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer.
      Opmerking: permissie-omstandigheden, die worden gedefinieerd als kweek bij 33-37 ° C in aanwezigheid van IFN-γ, zorgen voor stabiele expressie van de gemuteerde tsA58-TAg transgen. In tegenstelling tot de primaire kweken van muis nier PTEC, die niet meer overleven dan een enkele passage of twee, BU.MPT gekweekt onder permissieve omstandigheden voor onbepaalde tijd kan worden gepasseerd.
      1. Passage cellen minstens driemaal na ontdooien alvorens ze in een experiment.
        1. Om passage cellen, voeg 1 ml 0,05% trypsine per 100 mm schaal en incuberen in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 10 ml van medium A. Zuig het losgemaakte cellen en gesplitst 1: 3 tot 1: 5 in nieuwe 100 mm steriele polystyreen vacuüm-gasplasma behandelde tissue cultuur gerechten. Voeg een medium om het volume tot een totaal van 10 ml per 100 mm schaal brengen.
    4. Ter voorbereiding voor experimentele toepassing als reagerende cellen, groei cellen tot confluentie in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer onder niet-permissieve omstandigheden (bijvoorbeeld bij 39 ° C bij afwezigheid van IFN-γ [medium B met 10% v / v FBS]).
      Opmerking: Onder niet-permissieve omstandigheden wordt expressie van tsA58-gemuteerde TAg transgen geremd met> 95% en BU.MPT cellen gedragen als primaire, muizennier PTEC.

2. Voorbereiding van apoptotische BU.MPT Cells (Protocol 1)

Opmerking: Dit protocol is specifiek voor BU.MPT cellen als bron van apoptotische cellen en staurosporine als de methode van apoptose-inductie. Als alternatief kan een andere cellijn of primaire celkweek, worden gebruikt als een bron van apoptotische cellen, apoptose geïnduceerd door gestandaardiseerde protocoIs voor dat specifieke celtype en werkwijze voor inductie van apoptose.

  1. Na passage op 100 mm diameter steriele polystyreen vacuüm-gasplasma behandelde weefselkweekplaten, groei BU.MPT cellen tot confluentie in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer onder permissieve omstandigheden (bijvoorbeeld bij 37 ° C in kweekmedium A bij 10 ml per 100 mm schaal), zoals beschreven in paragraaf 1.2.3.
  2. Spoel de hechtende cel monolaag driemaal met kweekmedium B, met behulp van 10 ml per spoeling.
  3. Induceren apoptose door de cellen te incuberen in kweekmedium B dat staurosporine, een selectieve proteïne kinase remmer, bij 1 ug / ml gedurende 3 uur in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C.
  4. Zuig het staurosporine-bevattend medium met "zwevend" apoptotische cellen die zijn losgemaakt van de monolaag. Centrifuge dit medium 10 min bij 500 xg, verwijder het supernatant, was de pellet driemaal met kweekmedium B, envoeg de pellet terug naar cellen verzameld in de volgende stap, 2,5.
  5. Maak de overblijvende hechtende cellen van stap 2,3 en 2,4 door toevoeging van 5 mM (ethyleendiaminetetraazijnzuur) EDTA in 1 x Ca2 + - en Mg2 + -vrij DPBS bij 1 ml per schaal gedurende 5 min. Zuig het EDTA-bevattend medium met vrijstaand apoptotische cellen en verzamel het losgemaakte cellen met de "zwevende" apoptotische cellen uit stap 2.4 in een steriele 15 ml centrifugebuis polystyreen.
  6. Was de apoptotische cellen drie keer door centrifugeren gedurende 10 min bij 500 xg en resuspensie in 10 ml 1x Ca + 2 - en Mg + 2 -vrij DPBS per wasbeurt.
  7. Na de laatste wasbeurt, schorten de apoptotische cellen in vers kweekmedium B bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml voor gebruik om de responder cellen te stimuleren. Als alternatief fix gewassen apoptotische cellen in 0,4% (v / v) paraformaldehyde in 1x DPBS gedurende 30 minuten, en was daarna drie keer met cultuurmedium B, voordat schorsing in kweekmedium B.
  8. Eventueel bevestigen inductie van apoptose door flowcytometrie met een afzonderlijke bereiding van apoptotische cellen (of cellen bewaar wat hiervoor), zoals eerder beschreven 6,9,10,15.
    Opmerking: Vroege apoptotische cellen intacte celmembranen, en verschijnen als propidiumjodide (PI) -negatieve en annexine V-positieve cellen verminderde celgrootte (ten opzichte van levensvatbare cellen). Late apoptotische cellen niet intacte celmembranen en weergegeven als PI-positieve en annexine V-positieve cellen verminderde celgrootte. Met behulp van het huidige protocol, typische preparaten bevatten ~ 85% vroege apoptotische en ~ 15% laat apoptotische cellen.
  9. Voeg apoptotische cellen aan responder cellen (protocol 3) BU.MPT tegen apoptotische naar responder cel verhouding van 1: 1, hetzij rechtstreeks of na fixatie van apoptotische cellen gedurende 30 min met 0,4% (v / v) paraformaldehyde in 1x DPBS .
    Opmerking: apoptotische cel fixatie voorafgaand aan de stimulatie van responders moetenlaat resultaten, tenzij de waargenomen signalering gebeurtenissen gevolg van het vrijkomen van een oplosbare mediator (tabel 1).

3. Voorbereiding van Necrotic BU.MPT Cells (Protocol 2)

Opmerking: Dit protocol is specifiek voor BU.MPT cellen als bron van necrotische cellen en verwarming als de methode van necrose inductie. Als alternatief kan een andere cellijn of primaire celkweek, worden gebruikt als een bron van necrotische cellen, met necrose geïnduceerd door gestandaardiseerde protocollen voor dat specifieke celtype en de wijze van necrose inductie.

  1. Na passage op 100 mm diameter steriele polystyreen vacuüm-gasplasma behandelde weefselkweekplaten, groei BU.MPT cellen tot confluentie in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer onder permissieve omstandigheden (bijvoorbeeld bij 37 ° C in kweekmedium A bij 10 ml per gerecht), zoals beschreven in paragraaf 1.2.3.
  2. Spoel de hechtende cel monolaag driemaal met kweekmedium B, met behulp10 ml per spoeling.
  3. Maak de cellen door toevoeging van 5 mM EDTA in 1 x Ca2 + - en Mg2 + -vrij DPBS bij 1 ml per schaal gedurende 5 min. Zuig het EDTA-bevattend medium met losgemaakte cellen en voeg de celsuspensie naar een steriele 15 ml centrifugebuis polystyreen.
  4. Was de cellen drie keer door centrifugeren gedurende 10 min bij 500 xg en resuspensie in 10 ml Ca 2 + - en Mg + 2 -vrij DPBS per wasbeurt.
  5. Na de laatste wasbeurt, schorten de cellen in vers kweekmedium B bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml.
  6. Necrose induceren door verhitting cellen 70 ° C gedurende 45 min in een waterbad voorzichtig vortexen de celsuspensie elke 10 min.
  7. Incubeer cellen gedurende 2 uur in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Voorzichtig vortex de celsuspensie elke 15 min.
  8. In voorkomend geval, bevestigen inductie van necrose door flowcytometrie met een aparte voorbereiding van de necrotic cellen (of cellen bewaar wat hiervoor), zoals eerder beschreven 6,9,10,15.
    Opmerking: necrotische cellen celmembranen gebroken en weergegeven als PI-positieve cellen van grotere celgrootte (ten opzichte van levensvatbare cellen). Met het huidige protocol typische preparaten ≥ 95% necrotische cellen. Als alternatief kan inductie van necrose en verlies van membraan integriteit worden bevestigd door trypan blauwe vlekken.

4. Voorbereiding van BU.MPT Responder Cells (Protocol 3)

Opmerking: Dit protocol is specifiek voor BU.MPT cellen als bron van responder cellen. Als alternatief kan een andere cellijn of primaire celkweek, worden gebruikt als responder cellen. Voorafgaand aan experimenteel gebruik, kan rust 's nachts worden veroorzaakt door gestandaardiseerde protocollen in het laboratorium.

  1. Groeien BU.MPT cellen in steriele 100 mm weefselkweekplaten onder permissie-omstandigheden in kweekmedium A bij 10 ml per schaal totdat ze bereiken ~85% samenvloeiing.
  2. Aspireren kweekmedium A, en spoel de cellen drie keer met kweekmedium B bij 10 ml per spoeling. Serum-verhongeren de cellen 's nachts voor 18 tot 24 uur in een bevochtigde 5% (v / v) CO 2 atmosfeer onder niet-permissieve omstandigheden (dat wil zeggen op 39 ºC in kweekmedium B bij 10 ml per gerecht), zoals beschreven in paragraaf 1.2 0,4, om rust te induceren. Als alternatief, groeien de cellen in kweekmedium B plus 10% (v / v) FBS op 39 ºC gedurende één dag voor serum uitgehongerde cellen overnacht in kweekmedium B zonder FBS.
  3. Label een aparte weefselkweek schotel van confluente BU.MPT cellen voor elke experimentele conditie.
  4. Onder de volgende zes voorwaarden: stimulering van levensvatbare BU.MPT responders met ofwel groei voertuig of epidermale factor (EGF) gedurende 15 min, na hun blootstelling gedurende 30 min ofwel geen cellen, apoptotische cellen of necrotische cellen.
    Opmerking: Blootstelling aan dode cellen kan ofwel stimuleren of remmen het niveau van de activiteit van een given signalering molecuul. Stimulatie is het best gedetecteerd boven een lage uitgangswaarde (bv afwezigheid van EGF), terwijl de remming wordt het best gedetecteerd uit een hoge uitgangswaarde (bijvoorbeeld, de aanwezigheid van EGF). Omdat het effect van stimulatie met dode cellen is a priori bekend is, is het aan al studies uitgevoerd in zowel de afwezigheid en de aanwezigheid van EGF.

5. Stimulatie van Responder Cellen met apoptotische en necrotische cellen (Protocol 4)

  1. Aspireren kweekmedium B van pre-gelabelde gerechten van latente (serum-uitgehongerde) BU.MPT responder cellen (Protocol 3).
    Let op: Na een nacht kweken onder niet-permissieve omstandigheden BU.MPT cellen moeten gedragen als primaire culturen van muis nier PTEC.
  2. Per 100 mm schaal, voeg 2 ml van een van de volgende: B kweekmedium (geen cellen); apoptotische cellen suspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 1); of necrotische celsuspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 2).
    1. Verdeel de 2 ml suspensie van dode cellen gelijkmatig over de 100 mm schaal, en houdt de tijd voor hen om zich te vestigen tot een minimum. Hiertoe distribueren dode celsuspensie druppelsgewijs met een pipet brede punt over het gehele oppervlak van de responder cel gerechten. Gebruik een volume van 2 ml als compromis tussen de zettijd minimaliseren en het vermijden van de samenklontering van dode cellen.
      Opmerking: Het gebruik van een suspensie van dode cellen als een stimulus brengt een aantal speciale overwegingen, die hieronder nader (Tabel 2 en bespreking) worden beschreven.
    2. Het bereiken van een dode-to-responder cel verhouding van ~ 1: 1 door toevoeging van 2 ml van dode cellen op ~ 5 x 10 6 cellen per ml van een confluente 100 mm schaaltje dat ~ 10 x 10 6 cellen bevat. Als alternatief, om de dosisafhankelijkheid van elke waargenomen signaleringsgebeurtenissen stellen, variëren de verhouding van dood reagerende cellen voortdurend door geleidelijke verdunning in culture medium B van de doden celsuspensies bereid in de Protocollen 1 en 2.
  3. Zwenk de gerechten, dan incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% (v / v) CO 2 atmosfeer.
  4. Na 30 min, stimuleren de responder cellen met ofwel drager of 50 nM EGF, volgens de pre-labeling van de kweekschaal.
  5. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer.
  6. Wegspoelen de dode cellen door toevoeging van 5 ml ijskoude 1x DPBS, wervelende het gerecht, en opzuigen van de wasvloeistof. Herhaal dit drie keer.
  7. Onmiddellijk in zijn responder cel gerechten op ijs voor verdere verwerking.
  8. Bereid cellysaten
    1. Bereid cellysis buffer met de volgende: 1 x Tris gebufferde zoutoplossing (TBS), 10 mM natriumpyrofosfaat, 0,5% w / v deoxycholaat, 0,1% w / v SDS, 10% glycerol en 25 mM natriumfluoride.
      1. Onmiddellijk voorafgaand aan cellysis, voeg de volgende in de exacte volgorde gegeven bij de INDvoor bestemde concentraties: Mini EDTA-vrije proteaseremmer cocktail (1 tablet per 10 ml lysis buffer), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM dithiothreïtol (DTT), 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) en 10 mM natriumorthovanadaat.
    2. Voeg 700 ul ijskoude cellysis buffer per 100 mm schaal van vers gestimuleerde reagerende cellen op ijs uit stap 5.7. Schraap cellen met een cel schraper, en breng het lysaat pre-gekoelde 1,5 mL microbuizen. Handhaaf de buizen op ijs gedurende 15 min.
    3. Sonificeer lysaten op ijs met 10 pulsen van 20 Hz, minder dan een seconde per duren. Vermijd de vorming van schuim op de gas / vloeistof-interface, omdat dit de monsters kunnen oververhit raken. Volledig onder te dompelen de ultrasoonapparaat sonde in de microbuizen met lysaten voordat u het ultrasoonapparaat op, en schakel het ultrasoonapparaat uit voordat het verwijderen van de sonde uit de lysaten.
    4. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng de supernatanten in vers voorgekoeld microbuizen, En bewaar bij -70 ºC.
    5. Voeren gelelektroforese en immunoblotting op supernatanten van lysaten, zoals hiervoor beschreven 6,9,10,15.

6. Het voorkomen van direct fysiek contact tussen Doelen en Responders Met behulp van een Semi-permeabel Polycarbonaat membraan (Protocol 5)

  1. Bereid BU.MPT responder cellen volgens Protocol 3, met één uitzondering; groeien cellen in steriele polystyreen weefselkweek behandelde 12-well clusters.
  2. In geselecteerde putten, plaatst u een doorlaatbare support systeem met een 0,4 micrometer polycarbonaat membraan naar de fysieke interactie tussen doden en responder cellen te voorkomen. Omvatten controleputjes zonder membraan in hetzelfde experiment.
  3. Aspireren kweekmedium B van experimentele putjes van serum uitgehongerde BU.MPT responder cellen.
  4. Volg Protocol 4 voor stimulatie van reagerende cellen met apoptotische of necrotische cellen, met de volgende wijzigingen:
    1. Per putje van de 12-well cluster, voeg 0,1 ml van een van de volgende: B kweekmedium (geen cellen); apoptotische cellen suspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 1); of necrotische celsuspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 2).
      Opmerking: Als confluente putje van een 12-well cluster bevat ~ 0,5 x 10 6 cellen, het toevoegen van 0,1 mL van dode cellen op ~ 5 x 10 6 cellen per ml levert een dead-to-responder cel verhouding van ~ 1: 1.
    2. Aan putjes die de permeabele ondersteuningssysteem, voeg de dode cellen boven de 0,4 urn polycarbonaatmembraan binnen de permeabele drager systeem, zodat er geen directe fysieke interactie tussen dode en responder cellen.

7. Remming van fagocytose met cytochalasine D (Protocol 6)

  1. Bereid BU.MPT responder cellen volgens protocol 3.
  2. Bereid de cytoskelet remmer cytochalasine D in dimethyl sulfoxide (DMSO) en 4 mg / ml (1000 X). Naar gelabelde gerechten BU.MPT responder cellen hetzij 10 uL drager (DMSO) of 10 ul van cytochalasine D tot een eindconcentratie van 4 ug / mL bereiken in 10 ml kweekmedium B.
    Let op: Bij deze concentratie van cytochalasine D, fagocytose door BU.MPT cellen en een macrofaag cellijn werd geremd door ≥90% 9,10.
  3. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer.
  4. Volg Protocol 4 voor stimulatie van reagerende cellen met apoptotische of necrotische cellen.
  5. Eventueel bevestigen remming van fagocytose van dode cellen door flowcytometrie met een afzonderlijke bereiding van dode en responder cellen (of cellen daartoe bestemde), zoals eerder beschreven 9,10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In figuur 1 geven we een schema dat de timing en kritische stappen van de bereiding van apoptotische cellen (Protocol 1) en necrotische cellen (protocol 2) en het stimuleren van responder cellen met suspensies van apoptotische en necrotische cellen (protocol 4).

In figuur 2 geven we representatieve resultaten die het effect van apoptotische cellen op fosforylatie van de twee isovormen van de s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wij bieden hier een protocol voor het karakteriseren van de intracellulaire signalering gebeurtenissen geïnduceerd in levensvatbare cellen na blootstelling aan cellen ondergaan apoptose of andere vormen van celdood. Het protocol benadrukt de verschillende mechanismen die blootstelling aan apoptotische cellen intracellulaire signaalroutes in levensvatbare responder cellen kunnen moduleren. Deze mechanismen omvatten: de interactie (via overbrugging moleculen of oppervlak determinanten dode cel of de schuur blaasjes en mic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund, geheel of gedeeltelijk, door institutionele fondsen van Dr. José A. Arruda en de Sectie Nefrologie, University of Illinois in Chicago (aan J. S. L.); en financiering van de Afdeling Geneeskunde van McGill University en het Onderzoeksinstituut van het McGill University Health Centre (aan J. R.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuurmaterialen
DMEM, 1x met [4,5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & natrium-pyruvaatMediatech (Manassas, VA)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, foetaal bovien serumGE Healthcare (Logan, UT)SH30066.03voeg 10% (v/v)  toe aan het kweekmedium A
Penicilline-Streptomycine-Glutamine, 100xLife Technologies (Grand Island, NY)10378-016voeg 100 eenheden/mL toe aan het kweekmedium A en B
γ-Interferon, muis recombinant, van Escherichia coliCalbiochem, Millipore (Billerica, MA)407303voeg 10 eenheden/mL toe aan het kweekmedium A
Falcon polystyreen weefselkweekbekers, niet-pyrogeen behandeldCorning (Durham, NC)353003steriele, 100 mm diameter
Falcon polystyreen centrifugebuizen, kegelvormige bodemCorning (Durham, NC)352095steriele, 15 mL
Trypsine-EDTA, 0,05%, GibcoFisher (Waltham, MA)25300062steriele, 100 mL
NaamBedrijfCatalogusOpmerkingen
Chemie en remmers
Staurosporine, van Streptomyces sp.Sigma (St. Louis, MO)S4400gebruik bij [1 μg/mL] gedurende 3 u om apoptose te induceren
Epidermaal groeifactor (EGF), [1 mg/mL]Millipore (Billerica, MA)EA140gebruik bij 50 nM om responderende cellen te stimuleren
UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies (Grand Island, NY)15575-038gebruik 5 mM om adherente cellen los te maken
Trypanblauw oplossing, 0,4%MP Biomedicals (Santa Ana, CA)91691049voor dode cellenkleuring
Paraformaldehydeoplossing, 4% in DPBSAffymetrix (Santa Clara, CA)19943gebruik 0,4% (v/v) in 1x DPBS voor celfixatie
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14040133stakoplossing
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), Ca2+- en Mg2+-vrij, 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14190367stakoplossing
Cytochalasin D, 4 mM in dimethylsulfoxide (DMSO), van Zygosporium mansoniiSigma (St. Louis, MO)C8273gebruik bij [4 μg/mL] om fagocytose te remmen
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma (St. Louis, MO)D2650oplosmiddel voor cytochalasin D
[header]
Ingrediënten voor cellysisbuffer
Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), 10x, pH 7,4BioRad (Hercules, CA)1706435voor cellysisbuffer
NatriumpyrofosfaatSigma-Aldrich (St. Louis, MO)22136810 mM voor cellysisbuffer
NatriumdeoxycholaatSigma-Aldrich (St. Louis, MO)D67500,5% w/v voor cellysisbuffer
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)L3771 0,1% w/v voor cellysisbuffer
GlycerolSigma-Aldrich (St. Louis, MO)G551610% voor cellysisbuffer
NatriumfluorideSigma-Aldrich (St. Louis, MO)45002225 mM voor cellysisbuffer
Complete mini EDTA-vrije proteaseremmercocktail tabletRoche Diagnostics (Indianapolis, IN)4693159001voor cellysisbuffer, 1 tablet per 10 mL buffer
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)T878710% voor cellysisbuffer
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)11DTT000051 mM voor cellysisbuffer
Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)48002631 mM voor cellysisbuffer
NatriumorthovanadateMP Biomedicals (Santa Ana, CA)215966410 mM voor cellysisbuffer
NaamBedrijfCatalogusOpmerkingen
Apparatuur
Sorvall T6000B centrifugeDu Pont (Wilmington, DE)T6000B
Fisher Tissuemat, waterbadFisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100Fisher (Waltham, MA)
Diverse
Celtellingskamer, NeubauerHawksley (Lancing, Sussex, UK)AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detectie Kit IIMillipore (Billerica, MA)CBA059voor PI en Annexin V kleuring om het stadium van apoptose te bepalen
Eppendorf microcentrifugebuisjes, 1,5 mLSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T9661
Transwell permeabele ondersteuning, 0,4 μm polycarbonaatmembraanCorning (Corning, NY)3413steriele, polystyreen, weefselkweekbehandeld
NaamBedrijfCatalogus

Referenties

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

RespondercellencelinteractieGSK3 fosforyleringapoptose inductienecrose inductiecelkulturprotocolfagocytose inhibitiefysieke interactie
Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.