Wij stellen een protocol voor het transport van geladen en ongeladen moleculen over gewrichtskraakbeen met behulp van recent ontwikkelde experimentele en numerieke methoden onderzocht.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een experimentele en Finite Element Protocol bij het vervoer van neutrale en geladen opgeloste stoffen over gewrichtskraakbeen Onderzoek
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Osteoartritis (OA) is een slopende ziekte die is geassocieerd met degeneratie van gewrichtskraakbeen en subchondrale bot. Degeneratie van gewrichtskraakbeen verslechtert de dragende functie vrijwel zoals ervaart enorme chemische afbraak, namelijk proteoglycanverlies en collageenfibril verstoring. Een veelbelovende manier om chemische schade mechanismen te onderzoeken tijdens de OA is aan het kraakbeen monsters bloot te stellen aan een externe opgeloste stof en bewaken van de diffusie van de moleculen. De mate van kraakbeenschade (dwz concentratie en configuratie van essentiële macromoleculen) is toegevoegd botsingsstralingsmodellen energieverlies externe opgeloste stoffen tijdens het bewegen over gewrichtskraakbeen creëert verschillende diffusie-eigenschappen in vergelijking met gezonde kraakbeen. In deze studie introduceren we een protocol, dat bestaat uit meerdere stappen en is gebaseerd op eerder ontwikkelde experimentele micro-C14px; "> omputed T omography (micro-CT) en eindige elementen modellering Het transport van geladen en ongeladen gejodeerde moleculen eerst geregistreerd met behulp van micro-CT, gevolgd door het aanbrengen bifasische opgeloste stof en meerfasige eindige elementenmodel diffusie coëfficiënten te verkrijgen. en vaste ladingsdichtheden in kraakbeen zones.
Inleiding
Moleculair transport speelt een cruciale rol bij de homeostase van scharnierende verbindingen, afgifte van therapeutische middelen aan gewrichtskraakbeen en contrast-versterkte beeldvorming kraakbeen 1, 2, 3. Factoren zoals kraakbeen integratie en intactheid, opgeloste lading en grootte alsmede osmolaliteit en concentratie bad in contact met kraakbeen kan de transportsnelheid 4, 5, 6 te beïnvloeden. Het transport van opgeloste stoffen, hetzij neutraal of geladen, kunnen verschillend tussen gewrichtskraakbeen zones, omdat elke zone bestaat uit verschillende concentraties en oriëntaties van grote extracellulaire matrix moleculen, namelijk proteoglycanen (PG) en collageen type II 1, 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, 11. Wat nog belangrijker is, kan het transport van geladen opgeloste stoffen in hoge mate afhankelijk van de concentratie van proteoglycanen die negatieve vaste ladingen in de extracellulaire matrix die toeneemt in gewrichtskraakbeen 8, 9 zijn. Die parameters bijzonder vaste ladingsdichtheid (FCD), kan de oriëntatie van collageenfibrillen en het watergehalte variatie tussen kraakbeen veranderingen ondergaan osteoartritis (OA) verloopt, waarbij het belang van het bestuderen diffusie door kraakbeen betekent.
In de huidige studie, een protocol gebaseerd op vooraf vastgestelde experimentele en computationele studies 6, 8, 9 voorgesteld om nauwkeurig onderzoeken diffusie onder verschillende randvoorwaarden met neutrale en geladen opgeloste stoffen in een eindig-bad model diffusie. THij voorgestelde methoden bestaan uit micro-CT beeldvorming (micro-CT) van een systeem dat kraakbeen en een eindig-bad met geavanceerde bifasische opgeloste stof en meerfasige eindige elementenmodel. Deze modellen stellen verkrijgen van de diffusiecoëfficiënten van neutrale en geladen moleculen en fcds in verschillende zones van gewrichtskraakbeen. Met deze modellen kan een beter inzicht in het gedrag van de diffunderende neutraal geladen moleculen die kunnen worden gebruikt om de interacties tussen kraakbeen en overlappen eindige-bad onderzoeken krijgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Het protocol hier gepresenteerde is overgenomen uit de experimentele en computationele procedures van de recente research papers 6, 8, 9. Het protocol wordt weergegeven in figuur 1.
De kadavers materialen werden verzameld met toestemming van de veterinaire faculteit van de Universiteit Utrecht.
1. Monster bereiding en Bath
- Boor cilindrische osteochondrale plugs (diameter 8,5 mm) van dode equine femurcondylen behulp maat boorbeitel (figuur 1) tijdens het spuiten koel fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om oververhitting gevolgd kraakbeenschade voorkomen.
- Warmtekrimp de osteochondrale pluggen een kunststof krimpende mof de laterale diffusie van de bovenliggende bad minimaliseren.
- Monteer de osteochondral stekker met kraakbeen bij The bovenkant eerst in de kunststof krimpen huls en te volgen door het blazen van hete lucht aan. Voeg de natte katoen stukken op het oppervlak van het kraakbeen om warmte-gerelateerde schade te voorkomen.
- Bereid eindige-baden van geladen (bijvoorbeeld 650 pl, 420 mM, ioxaglaat, molecuulgewicht (MW) = 1.269 Da, lading = -1) en neutrale (650 pl, 420 mM, iodixanol, MW = 1.550 Da) opgeloste stoffen afzonderlijk.
- Laad de bereide eindige-baden op het oppervlak van het kraakbeen met een injectiespuit en plaats een kurk stekker aan het verpakte monster verdamping bij experimenten bij kamertemperatuur (figuur 2A) te voorkomen. De neutrale opgeloste stoffen bestuderen, plaats de iodixanol bad en de negatief geladen stoftransport plaats ioxaglaat bad op het kraakbeenoppervlak bestuderen.
2. Imaging and Image Processing
- Leg de ingepakte monsters geïsoleerd met kurk stekker op een op maat gemaakte houder aan de gemotoriseerde fase van een micro-CT. plaats tHij monster zodat kraakbeen oppervlak bedekt met contrastmiddel oplossing naar boven.
- Scannen met de micro-CT (voxel grootte van 40 x 40 x 40 micrometer 3, scantijd van 2 min, buisspanning 90 kV en buisstroom van 180 uA) een gezichtsveld bestaande uit kraakbeen, subchondrale plaat en finite- bad in verschillende tijdstippen tot evenwichtstoestand (48 h) bereikt (figuur 2A). De evenwichtstoestand wordt bereikt wanneer de concentratie waarden niet veranderen in de tijd.
- Registreer de 3D-beelden op verschillende tijdstippen op basis van de oorspronkelijke afbeelding om de positionering van de regio of Interest (ROI) te vergemakkelijken met behulp van software van de fabrikant (bv Analyse).
- Zet de 3D gereconstrueerde micro-CT-beelden in 2D Tagged Image File Format (TIFF) stapel voordat u ze verwerkt met behulp van software van de fabrikant.
- Wereldwijd segment (ImageJ> Adjust> Threshold) het kraakbeen van het subchondrale bot steedsliggend bad in de software.
- Het verkrijgen van de gemiddelde grijswaarde van kraakbeen op verschillende tijdstippen (ImageJ> Analyze> Measure) met behulp van de gegenereerde kraakbeen masker in de vorige stap.
- Gezien de aanvankelijke badconcentratie en beginconcentratie contrastmiddel in het kraakbeen, gebruikt een lineaire kalibratiecurve de gemiddelde grijswaarden converteren naar het feitelijke concentratie van opgeloste stoffen. Eerdere gegevens ondersteunen dat grijswaarden onderhouden van een lineair verband met de concentratie van contrastmiddelen.
- Plot de opgeloste stof concentraties versus experimentele tijdstippen.
3. Computational Modelling
OPMERKING: De diffusie van dit probleem wordt verondersteld plaatsvinden in 1D (langs de z-as), die aan de experimentele randvoorwaarde. Derhalve kan de geometrie willekeurig worden gecreëerd.
- Build eindige bad gebaseerde kraakbeen meerdere zones modellen: 1) kraakbeen uit oppervlaktezone (20% van de totale kraakbeendikte) middenzone (50% van de totale kraakbeendikte) en diepe zone (30% van de totale kraakbeendikte) 12 en 2) eindige-bad in FEBio 13, 14 (figuur 2B).
- Wijs de mechanische en fysische eigenschappen van de verschillende zones van kraakbeen en bad in FEBio. Young's modulus (10 MPa) werd verondersteld hoog genoeg om de osmotische druk van de bovenliggende bad te weerstaan en daardoor het kraakbeen te beschermen tegen overmatige vervormingen te zijn.
- Gebruik een hydraulische permeabiliteit van 10 mm -3 4 / Ns en Poissonverhouding van 0. Gebruik opgeloste werkelijke diffusiecoëfficiënt van het bad in de simulaties 8, 9.
- Genereren maas (8-knooppunt trilineair hexahedrale elementen) en verfijnen de grensvlakken (figuur 2B)class = "xref"> 8, 9.
- Bifasisch-opgeloste stof model
- Toepassen aanvankelijke concentratie van opgeloste stof in het bad en effectieve druk die hiervoor geschikt is. Kijk naar de beschrijving van effectieve druk in 9, 15.
- Draaien van het model in voorbijgaande modus oplosconcentratie verkrijgen versus tijdcurve volgens de voorgeschreven diffusiecoëfficiënten in verschillende zones kraakbeen.
- Multiphasic model
OPMERKING: De elektrische fluctuatie tussen bad en weefsel kan worden omzeild door twee monovalente tegenionen zowel het bad en het weefsel.- Voor stationaire modellen: Gebruik dezelfde effectieve fluïdumdrukken en concentraties in kraakbeen en overliggende bad terwijl het verhogen FCD zijn gewenste waarde.
- Voor kortstondige modellen: maak een goed geroerde eindige-bad door het houden van de opgeloste stof diffusiecoëfficiënt in het bad voldoende hoog. Spuit deopgeloste stof uit het bad-luchtinterface in het bad om de gewenste concentratiewaarde bereikt.
- Transiënte: verwijder de voorgeschreven concentratie opgeloste randvoorwaarde in de vorige stap en herstellen de diffusiecoëfficiënt van de eindige-bad tot de werkelijke diffusiecoëfficiënt.
- Draaien het model opgeloste concentratie-tijd curven op basis toegepast fcds en diffusiecoëfficiënten in verschillende zones kraakbeen te verkrijgen.
- FEBio-MATLAB-interface
- Ontwikkelen van een MATLAB code automatisch uitvoeren simulatie FEBio en grafiek concentratie-tijd curven (FEBio MATLAB-interface) 8, 9.
- Veranderen diffusiecoëfficiënten en fcds in kraakbeen zones behulp FEBio MATLAB-interface. Run modellen in FEBio en extract opgeloste concentratie-tijd curves 8, 9.
- Vergelijk het verkregen opgeloste concentratie-tijdcurve de experimentelegegevens en het verkrijgen van reeksen diffusiecoëfficiënten en fcds kraakbeen in verschillende zones op basis van minimale gemiddelde kwadratische fout (RMSE) 8, 9.
Figuur 1: Experimentele Setup. A) Sample extractieprocedure met gebruik van een op maat boor. B) micro-CT beeldvorming procedure om diffusie te monitoren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Schematische.A) Proefopzet. B) meerdere zones rekenmodel uit de eindige bad, oppervlakkig, middelste en diepe zones van kraakbeen en bijbehorende mesh. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De representatieve resultaten die hier worden overgenomen uit eerder onderzoek papers 6, 8, 9, 16.
OA, kraakbeen ondergaat aanzienlijke veranderingen belangrijker GAG verlies en collageenfibrillen beschadigingen 17, 18,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Stelden wij een experimenteel protocol in combinatie met een eindige elementen modellering procedure om de diffusie van neutrale en geladen opgeloste stoffen in gewrichtskraakbeen bestuderen. Volgens de recente studies zou het voorgestelde modellen nauwkeurig te beschrijven het transport van neutrale (bifasische-opgeloste stof) en negatief geladen (meerfasige) opgeloste stoffen in verschillende zones van gewrichtskraakbeen 8, 9. Het wordt algemeen aangenomen dat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag hun dank aan de heer Jeroen van den Berg en de heer Matthijs Wassink uit de groep ontwikkeling monteurs aan het UMC Utrecht bedanken voor hun hulp bij het verpakken van proces van de osteochondrale pluggen. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van Nederlands Arthritis Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatief geladen contrastmiddel |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Neutraal contrastmiddel |
| PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) | Life technologies | 10010023 | Medium |
| micro-CT | Perkin Elmer | Bewaking van diffusie | |
| Bevriezpuntosmometer | Advanced instruments | Meten van osmolaltiteit van de oplossing |
Referenties
- Arkill, K. P., Winlove, C. P. Solute transport in the deep and calcified zones of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 16 (6), 708-714 (2008).
- Chin, H. C., Moeini, M., Quinn, T. M. Solute transport across the articular surface of injured cartilage. Arch Biochem Biophys. 535 (2), 241-247 (2013).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-specific effects of compression on macromolecular diffusion in articular cartilage. Biophys J. 95 (10), 4890-4895 (2008).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Annals of Biomedical Engineering. 31 (7), 753-760 (2003).
- Gu, W. Y., Yao, H. Effects of hydration and fixed charge density on fluid transport in charged hydrated soft tissues. Ann Biomed Eng. 31 (10), 1162-1170 (2003).
- Pouran, B., Arbabi, V., Zadpoor, A. A., Weinans, H. Isolated effects of external bath osmolality, solute concentration, and electrical charge on solute transport across articular cartilage. Medical Engineering and Physics. 38 (12), 1399-1407 (2016).
- Kulmala, K. A. M., et al. Diffusion coefficients of articular cartilage for different CT and MRI contrast agents. Medical Engineering & Physics. 32 (8), 878-882 (2010).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of Neutral Solute Across Articular Cartilage: The Role of Zonal Diffusivities. Journal of Biomechanical Engineering. 137 (7), 071001-071001 (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. J Biomech. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined artificial neural networks for robust estimation of the diffusion coefficients across cartilage. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined inverse-forward artificial neural networks for fast and accurate estimation of the diffusion coefficients of cartilage based on multi-physics models. Journal of Biomechanics. , (2016).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Holzapfel, G. A., Kuhl, E. Ch. 17. Computer Models in Biomechanics. , Springer. Netherlands. 231-249 (2013).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Multiphasic Finite Element Framework for Modeling Hydrated Mixtures With Multiple Neutral and Charged Solutes. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (11), 111001-111001 (2013).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of neutral solute across articular cartilage and subchondral plate. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Pouran, B., Arbabi, V., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of multiphysics models to efficient design of experiments of solute transport across articular cartilage. Comput Biol Med. 78, 91-96 (2016).
- Hosseini, S. M., Wu, Y., Ito, K., Donkelaar, C. C. The importance of superficial collagen fibrils for the function of articular cartilage. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 41-51 (2013).
- Alexopoulos, L. G., Williams, G. M., Upton, M. L., Setton, L. A., Guilak, F. Osteoarthritic changes in the biphasic mechanical properties of the chondrocyte pericellular matrix in articular cartilage. Journal of Biomechanics. 38 (3), 509-517 (2005).
- Felson, D. T., et al. Osteoarthritis: new insights. Part 1: the disease and its risk factors. Ann Intern Med. 133 (8), 635-646 (2000).
- Kokkonen, H. T., Jurvelin, J. S., Tiitu, V., Toyras, J. Detection of mechanical injury of articular cartilage using contrast enhanced computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 19 (3), 295-301 (2011).
- Raya, J. G., et al. Diffusion-tensor imaging of human articular cartilage specimens with early signs of cartilage damage. Radiology. 266 (3), 831-841 (2013).
- Tavakoli Nia, H., et al. Aggrecan Nanoscale Solid-Fluid Interactions Are a Primary Determinant of Cartilage Dynamic Mechanical Properties. ACS Nano. 9 (3), 2614-2625 (2015).
- Arbabi, V., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Estimation of cartilage properties using indentation tests, finite element models, and artificial neural networks. 11th World Congress on Computational Mechanics & 5th European Conference on Computational Mechanics, Barcelona, Spain, , (2014).
- Arbabi, V., Pouran, B., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Determination of the mechanical and physical properties of cartilage by coupling poroelastic-based finite element models of indentation with artificial neural networks. Journal of Biomechanics. 49 (5), 631-637 (2016).
- Kokkonen, H. T., et al. Computed tomography detects changes in contrast agent diffusion after collagen cross-linking typical to natural aging of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1190-1198 (2011).
- Decker, S. G., Moeini, M., Chin, H. C., Rosenzweig, D. H., Quinn, T. M. Adsorption and Distribution of Fluorescent Solutes near the Articular Surface of Mechanically Injured Cartilage. Biophysical Journal. 105 (10), 2427-2436 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, S. J., Tiitu, V., Quinn, T. M., Töyräs, J. Bath Concentration of Anionic Contrast Agents Does Not Affect Their Diffusion and Distribution in Articular cartilage In Vitro. Cartilage. 4 (1), 42-51 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, J. S., Lammi, M. J., Töyräs, J. pQCT study on diffusion and equilibrium distribution of iodinated anionic contrast agent in human articular cartilage - associations to matrix composition and integrity. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (1), 26-32 (2009).
- Pouran, B., Arbabi, V., Villamar, J., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Contrast agent's transport across healthy articular cartilage under various bath conditions. Orthopaedic Research Society Annual Meeting, Las Vegas, Nevada, , (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of a biphasic-solute model in predicting diffusive properties of osteochondral interface. International Workshop on Osteoarthritis Imaging (IWOAI), Oulo, Finland, , (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
