Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

Jing Men; Jason Jerwick; Penghe Wu; Mingming Chen; Aneesh Alex; Yutao Ma; Rudolph E. Tanzi; Airong Li; Chao Zhou

doi:10.3791/55002

Methodenartikel

Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

12 december 2016

Jing Men¹^,² , Jason Jerwick²^,³ , Penghe Wu¹^,² , Mingming Chen³^,⁴ , Aneesh Alex²^,³ , Yutao Ma⁴ , Rudolph E. Tanzi⁵ , Airong Li⁵ , Chao Zhou¹^,²^,³

¹Bioengineering Program, Lehigh University, ²Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, ³Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, ⁴State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, ⁵Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden de experimentele protocollen beschreven voor het voorbereiden van Drosophila in verschillende ontwikkelingsstadia en het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van Drosophila hartslagen met behulp van een aangepast systeem voor optische coherentiemicroscopie (OCM). De morfologische en dynamische veranderingen in het hart kunnen kwantitatief worden gekenmerkt door het analyseren van de structurele en functionele parameters van het hart uit OCM-beelden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longitudinaal onderzoek van de hartslag bij kleine dieren draagt bij aan het begrijpen van structurele en functionele veranderingen tijdens de ontwikkeling van het hart. Het is aangetoond dat optische coherentiemicroscopie (OCM) in staat is om harten van kleine dieren te beeld met hoge ruimtelijke resolutie en ultrahoge beeldsnelheid. De hoge beeldcontrast en niet-invasieve eigenschappen maken OCM ideaal voor het uitvoeren van longitudinale studies zonder weefseldissecatie of kleuring. Drosophila wordt veel gebruikt als modelorganisme in studies over hartontwikkeling vanwege het hoge aantal orthologe menselijke ziektegenen, de gelijkenis van moleculaire mechanismen en genetische routes met gewervelden, de korte levenscyclus en de lage kweekkosten. Hier worden de experimentele protocollen beschreven voor de voorbereiding van Drosophila en optische beeldvorming van de hartslag met een aangepast OCM-systeem gedurende de hele levenscyclus van het specimen. Door de stappen in dit rapport te volgen, kunnen transversale M-mode en 3D OCM-beelden worden verkregen om longitudinale studies uit te voeren van de Drosophila hartmorfologie en -functie. De en face en axiale doorsnede OCM-beelden en de hartslag (HR) en hartactiviteitsperiode (CAP) histogrammen, werden ook getoond om de structurele veranderingen van het hart te analyseren en om de hartdynamiek tijdens Drosophila metamorfose te kwantificeren, gecombineerd met de video's die zijn samengesteld met M-mode beelden om de hartactiviteit intuïtief te traceren. Vanwege de genetische gelijkenis tussen Drosophila en gewervelden, zou longitudinale studie van hartmorfologie en -dynamiek bij fruitvliegen kunnen helpen de oorsprong van menselijke hartziekten te onthullen. Het protocol hier zou een effectieve methode bieden om een breed scala aan studies uit te voeren om de mechanismen van hartziekten bij mensen te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longitudinaal onderzoek naar het hart bij gezelschapsdieren bijdraagt tot het begrijpen van diverse humane gerelateerde hart- en vaatziekten, zoals gentherapie betrekking aangeboren hartafwijkingen ^1,2. In de afgelopen decennia verschillende diermodellen zoals muizen ^3,4, ^5,6 Xenopus, zebravis ^7,8, vogel ⁹ en Drosophila ^10-16, zijn gebruikt om het menselijk hart ontwikkelingsgerelateerd onderzoek. Het muizenmodel is op grote schaal gebruikt om de normale en abnormale ontwikkeling van het hart en hartafwijking fenotypes vanwege de overeenkomsten met het menselijk hart ^3,4 bestuderen.....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de OCM-systeem voor optische beeldvorming van Drosophila ¹⁶

Selecteer een spectrometer en een hogesnelheidslijn scan camera met een frame rate van ten minste 80 frame / sec biedt zodat de OCM-systeem in staat om de hartslag van Drosophila te lossen zal zijn.
Gebruik een breedband lichtbron om de axiale resolutie van 2 urn te garanderen aan de hartstructuur van Drosophila identificeren.
Gebruik een 10X doelstelling om een hoge transversale resolutie te verkrijgen.
Gebruik een 45 ° staaf spiegel om de referentie-arm lichtstraal reflecteren en om een ringvormig monste....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De longitudinale cardiale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de fruitvliegen met 24B-GAL4 / + rek bij kamertemperatuur OCM. De metingen werden uitgevoerd bij L2, L3, en 8 uur intervallen van PD1 tot PD4, en volwassen dag 1 (AD1) aan de metamorfoseprocédé (tabel 1) te volgen. Larven, poppen vroege, late poppen en volwassen vliegen werden gemonteerd op glasplaatjes zoals in Figuur 1A. Het segment kenmerken van het hart voor larven en volwassen vliegen werden getoond in de schemat.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De snelle hartslag van Drosophila, met een maximum HR rond de 400 slagen per minuut bij larven en volwassen stadia, vereist een hoge snelheid van de beeldvorming naar het hart diastoles en systolen (niet minder dan 80 beelden / sec op basis van ervaringen) op te lossen. Vanwege de kleine afmetingen en hartkamer micron schaal hart wanddikte (5-10 urn), een hoge ruimtelijke resolutie (beter dan 2 pm) vereist voor het oplossen van het hartbuis structuren. In deze studie, een hoge resolutie en ultrahoge snelheid OC.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot het huidige onderzoek.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Lehigh University Start-Up Fund, de NIH (R00EB010071 aan C.Z., R15EB019704 aan C.Z. en A.L., R03AR063271 aan A.L., en R01AG014713 en R01MH060009 aan R.E.T.), de NSF (1455613 aan C.Z. en A.L.), de Cure Alzheimer's Fund (aan R.E.T.), en het Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award aan A.L.). M.C. en Y.M. werd ondersteund door het National Key Basic Research Program of China (973 Program) onder subsidienummer 2014CB340404.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Custom OCM imaging system	Ontwikkeld in ons lab
my Temp Mini Digital Incubator	Benchmark	H2200-HC
Cover glass	AmScope	200PCS
Cotton Ball	RITE AID
Instant Drosophila Formula	CAROLINA	formule 4-24
Yeast	ActiveDry
Microscope	SONY	WILD M420
Brush	Loew-Cornell	245B	wordt gebruikt om monsters te verplaatsen
Labview software	National Instruments
ImageJ	National Institutes of Health
Matlab	Mathworks
Tweezer	Wiha	AA SA	om de vleugels van de fruitvlieg te fixeren
FlyNap	Carolina Biological Supply Company	4.224.898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M	Scotch
Pipette	Fisherbrand	MU18837
Organic Extra Coconut Oil	Spring Valley	13183
Microscope Slide	CapitolBrand	M3504-E
Drosophila Vials	SEOH	8401SS
All-trans-retinal	Sigma-Aldrich Co.	R2500

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila hart beeldvorming van hartfunctie transversale M modus 3D OCM beeldvorming kwantificering van de hartslag periode van cardiale activiteit Drosophila metamorfose niet invasieve beeldvorming longitudinale studie

Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen