Methodenartikel

Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

12 december 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden de experimentele protocollen beschreven voor het voorbereiden van Drosophila in verschillende ontwikkelingsstadia en het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van Drosophila hartslagen met behulp van een aangepast systeem voor optische coherentiemicroscopie (OCM). De morfologische en dynamische veranderingen in het hart kunnen kwantitatief worden gekenmerkt door het analyseren van de structurele en functionele parameters van het hart uit OCM-beelden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longitudinaal onderzoek van de hartslag bij kleine dieren draagt bij aan het begrijpen van structurele en functionele veranderingen tijdens de ontwikkeling van het hart. Het is aangetoond dat optische coherentiemicroscopie (OCM) in staat is om harten van kleine dieren te beeld met hoge ruimtelijke resolutie en ultrahoge beeldsnelheid. De hoge beeldcontrast en niet-invasieve eigenschappen maken OCM ideaal voor het uitvoeren van longitudinale studies zonder weefseldissecatie of kleuring. Drosophila wordt veel gebruikt als modelorganisme in studies over hartontwikkeling vanwege het hoge aantal orthologe menselijke ziektegenen, de gelijkenis van moleculaire mechanismen en genetische routes met gewervelden, de korte levenscyclus en de lage kweekkosten. Hier worden de experimentele protocollen beschreven voor de voorbereiding van Drosophila en optische beeldvorming van de hartslag met een aangepast OCM-systeem gedurende de hele levenscyclus van het specimen. Door de stappen in dit rapport te volgen, kunnen transversale M-mode en 3D OCM-beelden worden verkregen om longitudinale studies uit te voeren van de Drosophila hartmorfologie en -functie. De en face en axiale doorsnede OCM-beelden en de hartslag (HR) en hartactiviteitsperiode (CAP) histogrammen, werden ook getoond om de structurele veranderingen van het hart te analyseren en om de hartdynamiek tijdens Drosophila metamorfose te kwantificeren, gecombineerd met de video's die zijn samengesteld met M-mode beelden om de hartactiviteit intuïtief te traceren. Vanwege de genetische gelijkenis tussen Drosophila en gewervelden, zou longitudinale studie van hartmorfologie en -dynamiek bij fruitvliegen kunnen helpen de oorsprong van menselijke hartziekten te onthullen. Het protocol hier zou een effectieve methode bieden om een breed scala aan studies uit te voeren om de mechanismen van hartziekten bij mensen te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longitudinaal onderzoek naar het hart bij gezelschapsdieren bijdraagt tot het begrijpen van diverse humane gerelateerde hart- en vaatziekten, zoals gentherapie betrekking aangeboren hartafwijkingen 1,2. In de afgelopen decennia verschillende diermodellen zoals muizen 3,4, 5,6 Xenopus, zebravis 7,8, vogel 9 en Drosophila 10-16, zijn gebruikt om het menselijk hart ontwikkelingsgerelateerd onderzoek. Het muizenmodel is op grote schaal gebruikt om de normale en abnormale ontwikkeling van het hart en hartafwijking fenotypes vanwege de overeenkomsten met het menselijk hart 3,4 bestuderen. De Xenopus embryo is bijzonder nuttig bij de studie van ontwikkeling van het hart vanwege de gemakkelijke hantering en gedeeltelijke transparantie 5,6. De transparantie van het embryo en de vroege larve van de zebravis model zorgt voor eenvoudige optische observatie van de ontwikkeling van het hart 7,8. De aviaire model is een gemeenschappelijk onderwerp van ontwikkelingsstoornissen hart studies Because het hart is eenvoudig te bereiken na verwijdering van de eierschalen en de morfologische gelijkenis van aviaire harten voor de mens 9. De Drosophila model heeft een aantal unieke eigenschappen waardoor het ideaal is voor het uitvoeren van longitudinale studies van het hart te maken. Ten eerste, het hartbuis van Drosophila is ~ 200 urn onder het dorsale oppervlak, die gemak biedt voor optische toegang en observatie van het hart. Bovendien zijn veel moleculaire mechanismen en genetische pathways zijn geconserveerd tussen Drosophila en vertebraten. De orthologen van meer dan 75% van humane ziekte genen gevonden in Drosophila, waardoor het al op grote schaal gebruikt in transgene studies 11,13. Bovendien heeft het een korte levensduur en lage onderhoudskosten, en is vaak gebruikt als een specimen model voor de ontwikkelingsbiologie onderzoek 14-16.

Eerdere rapporten beschreven protocollen voor het bewaken Drosophila hartfunctie zoals hijArtbeat. Er werden echter dissectie vereiste procedures 17,18. Optische beeldvorming is een effectieve manier om ontwikkeling van het hart bij dieren visualiseren gezien het niet-invasieve karakter. Verschillende optische beeldvormende technieken zijn toegepast bij het uitvoeren van dierlijke cardiale studie, zoals twee-foton microscopie 19, confocale microscopie 20,21, licht blad microscopie 22, en optical coherence tomography (OCT) 16,23-26. Relatief, oktober is in staat om grote diepte beeldvorming in kleine dieren harten zonder contrastmiddelen, terwijl een hoge resolutie en een ultrahoge snelheid van de beeldvorming, die belangrijk zijn voor beeldvorming levende dieren. Bovendien heeft de lage kosten van het ontwikkelen van een systeem oktober deze techniek voor optische beeldvorming van monsters populair. Oktober is met succes gebruikt voor longitudinale studie van Drosophila. Met behulp van oktober, cardiale morfologische en functionele beeldvorming is uitgevoerd naar het hart structuren te bestuderen, de funcnele functies van genen en de mechanismen van cardiovasculaire defecten in mutant modellen tijdens ontwikkeling van het hart. Zo werd leeftijdsafhankelijke hartfunctie daling bevestigd-down gereguleerd-angiotensine converting enzyme-gerelateerde (ACER) gen in Drosophila met 27 oktober. Fenotypering van gen-gerelateerde cardiomyopathie werd aangetoond in Drosophila met behulp van oktober 28-33. Onderzoek met behulp van oktober bleek ook de functionele rol van het menselijke SOX5 gen in het hart van Drosophila 34. In vergelijking met oktober, OCM maakt gebruik van een objectief met een hogere numerieke lensopening om een ​​betere transversale oplossing te bieden. In het verleden heeft het hart disfunctioneren veroorzaakt door silencing een ortholoog circadiane gen dCry / dClock bestudeerd met behulp van een aangepast systeem OCM 15,16, evenals het effect van vetrijk dieet op cardiomyopathie in Drosophila tot obesitas geïnduceerde humane begrijpen hartziekten. 15

Hier, the experimentele protocol is samengevat voor longitudinaal onderzoek naar de cardiale morfologische en functionele veranderingen in Drosophila op het tweede instar (L2), derde instar (L3), pop dag 1 (PD1), pop dag 2 (PD2), pop dag 3 (PD3) , poppen dag 4 (PD4), pop dag 5 (PD5) en volwassen (figuur 1) via OCM om het onderzoek naar menselijke-gerelateerde aangeboren hartziekten vergemakkelijken. Cardiale functionele parameters, zoals HR en GLB werden kwantitatief geanalyseerd in verschillende ontwikkelingsstadia om de cardiale ontwikkelingsfuncties onthullen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de OCM-systeem voor optische beeldvorming van Drosophila 16

  1. Selecteer een spectrometer en een hogesnelheidslijn scan camera met een frame rate van ten minste 80 frame / sec biedt zodat de OCM-systeem in staat om de hartslag van Drosophila te lossen zal zijn.
  2. Gebruik een breedband lichtbron om de axiale resolutie van 2 urn te garanderen aan de hartstructuur van Drosophila identificeren.
  3. Gebruik een 10X doelstelling om een ​​hoge transversale resolutie te verkrijgen.
  4. Gebruik een 45 ° staaf spiegel om de referentie-arm lichtstraal reflecteren en om een ​​ringvormig monster arm lichtbundel om de diepte van de focus in de monsters uit te breiden te genereren.
  5. Ontwikkelen van een aangepaste computer programma om het OCM systeem te bedienen en het uitvoeren van metingen.

2. Drosophila Cultuur

  1. Standard Fly Voedselbereiding
    1. Put ~ 5 ml direct Drosophila formule in een polystyreen flesjebuis met de hulp van een papieren goot.
    2. Giet ~ 8 ml water in de formule goed te verzadigen eten.
    3. Voeg verschillende aanvullingen op de standaard vlieg voedsel voor verschillende experimenten. Bij de voorbereiding van all-trans -retinal (ATR) voedsel voor de optogenetic pacing experiment 35, gebruik dan een pipet tot 100 mM ATR halen en oplossen in ~ 8 ml water aan de ATR concentratie van 1 mM krijgen in voedsel. Na het mengen van de oplossing uniform, giet de oplossing in de formule en roer het voldoende.
    4. Een vetrijk dieet bereiden bestuderen obesitas gerelateerde stoornissen hart in Drosophila, 10,15 mix ~ 10 ml formule met 15 ml water in een beker en verwarm gedurende 30 seconden in een magnetron. Doe wat biologische extra vierge kokosolie in een kopje en verwarm het voor 90 seconden in de magnetron.
    5. Extract 7,5 ml kokosolie en meng met de formule bereid voldoende om het gewicht / volumeverhouding kokosolie maken voedsel ~ 30/100 en then extract ~ 2 ml gemengd voedsel en hiermee aan de bodem van een buis.
    6. Wacht 1 min tot het medium goed verzadigd. Compact De voedsel voorzichtig met een vlakke ondergrond om de levensomstandigheden van de Drosophila optimaliseren. Voeg 6-8 korrels van gist op de voorbereide formule, en steek de buis met een cluster van katoen.
  2. Fruit Fly Kruisen en Cultuur
    1. Neem een ​​buis met voorbereide standaard vlieg voedsel, en verwijder de aangesloten katoen. Breng voorzichtig de volwassen vliegen (mannen en vrouwen) aan de buis en steek de buis met katoenen onmiddellijk. Controleer de katoen om ervoor te zorgen dat er geen kloof tussen de katoen en de buiswand om vliegen te voorkomen dat ontsnappen uit de buis.
    2. Houd de fruitvliegen in de incubator bij 25 ° C gedurende kruisen. De meeste genen actief en cellulaire eiwitten worden gesynthetiseerd bij 25 ° C 36-39.
    3. Neem de buis uit de incubator na 8 kant overdracht van de aDult vliegt uit de buis om de eieren op dezelfde leeftijd voor experimentele controle te krijgen.
    4. Verder kweken van de eieren in de incubator bij 25 ° C, wat de standaard temperatuur Drosophila ontwikkeling met de ontwikkelingsperiode van 8,5 dagen 40,41.
      LET OP: De temperatuur beïnvloedt de ontwikkelingsperiode (ei tot volwassen) en de expressie van verschillende genen.

3. Het uitvoeren van optische beeldvorming met OCM

  1. Mount Fly larve voor Optical Imaging
    Opmerking: Het ei van Drosophila luiken in 22-24 uur bij 25 ° C om het eerste instar larven (L1). De tweede fase larve komt na de andere 24 uur. De grootste larvale vorm is de derde instar larve, die vervellingen na ongeveer 24 uur. Structurele kenmerken larve kan worden gebruikt om hun verschillende ontwikkelingsstadia onderscheiden. De grootte van de monddelen tussen de eerste en de tweede instar instar verschillend. De mondhaken van het eerste instar larven zijn zeer klein en lijken twee paar kleine zwarte vlekken, terwijl de mond haken van het tweede instar larven zijn groter en de structuur duidelijker. De siphonen worden meestal gebruikt om de tweede larvestadium en de derde instar identificeren. De tweede fase larve heeft anterior siphonen doodgeknuppeld, terwijl voor de derde instar, de voorste siphonen vertakt. Een donkeroranje ring begint te verschijnen op het uiteinde van het achterste siphonen in het derde instar larven.
    1. Breng een stukje dubbelzijdige tape om een ​​schone microscoop glasplaatje. Verdrijf de luchtbellen onder de tape om de reflecties veroorzaakt door luchtbelletjes tijdens de beeldvorming te voorkomen.
    2. Neem een ​​van de buizen met de gekweekte vliegen uit de couveuse in het larvale stadium.
    3. Identificeer de larve in de media, haal hem uit de media met een zachte borstel en leg ze op een schone tissue. Verwijder levensmiddelen vast aan de larve met een natte zachte borstel en droog het op het weefsel.
    4. Verplaats de cleaned vliegen naar een weefsel onder de objectieflens van een microscoop breed.
    5. Pas de focus van de microscoop om een ​​duidelijk beeld van de vlieg te vinden. Zij maken het ontwikkelingsstadium van de larve van de structurele kenmerken van de microscoop.
    6. Plaats de vliegen met behulp van de zachte borstel. Verzekeren het lichaam is recht met de rugzijde naar boven te bereiden voor montage op het glaasje door de rugzijde. Voer deze stap onder de microscoop.
    7. Zorg ervoor dat de larve volledig droog is voor montage op de tape. Anders zal de larve niet aan de tape.
    8. Plak de dorsale zijde van de gepositioneerde vliegen naar de dubbelzijdige tape op het glaasje met matige druk. Merk op dat er te veel druk kan de vliegen en te weinig kracht te doden zal leiden tot beweging tijdens beeldvorming vliegen.
  2. Optische beeldvorming van Drosophila bij larvale stadia (L2 en L3) met OCM
    LET OP: Een brede lumen van het hart buis kan worden found in de segmenten tussen A5 tot A8 de larvale stadia (figuur 1). De dwarse OCM M-modus beelden (2D + tijd) werden verworven op de A7 segment van het hart buis voor elke larve van de systolische en diastolische analyse te vergemakkelijken.
    1. Plaats de gemonteerde larve op de instelbare monsterstellage van de OCM systeem langs de y-dwarsrichting met de rugzijde naar boven onder de objectieflens. Een kleine opening in de monstertafel noodzakelijk voor het plaatsen van de larve haar contact met de fase vlak voorkomen.
    2. Stel het monster podium te bewegen het hart buis van de fruitvlieg op het brandvlak van de beeldvormende bundel. Om gemakkelijk de A7 segment, vind het achterste gebied van het hart buis met de real-time dwarsdoorsnede OCM beelden in de afbeelding acquisitie software. Verplaats vervolgens het podium naar voren totdat de A7 segment zichtbaar is.
    3. Stel de parameters van het beeld acquisitie software tot 100 A-scans per B-scan (frame), 100 B-scans, en de scanner spanning dekking ~ 0,28 mm in de x-dwarsrichting en 0 V in de y-dwarsrichting. Klik op de knop "start" in de software om de achtergrondruis data voor de achtergrond aftrekken verwerven door het blokkeren van het monster stralengang met een donkere doek.
      Opmerking 3 van 100 frames kunnen worden gebruikt voor de achtergrond aftrekking.
    4. Parameters van de data-acquisitie software 128 A-scans per B-scan 4096 B-scans en de scanner spanning dekking ~ 0,28 mm in de x-dwarsrichting en 0 V in de y-dwarsrichting. Klik op de knop "start" in de software om de dwarse M-modus beelden over de A7 segment van de vlieg hartbuis over een gebied met betrekking tot 0,28 x 0,57 mm 2 voor ongeveer 30 sec te verwerven.
    5. Blokkeer de beeldvormende bundel met een donkere doek tijdens de data opslaan proces om langdurige blootstelling van de vlieg hart naar de beeldvorming licht te vermijden.
    6. Herhaal de meting voor 5 keer om een ​​betrouwbare meting van het hart plezier te krijgenctie.
    7. Parameters van de beeldacquisitie software 400 A-scans per B-scan, 800 B-scans en de scanner spanning dekking ~ 1,7 mm in de x-dwarsrichting en ~ 4 mm in de y-dwarsrichting. Verplaats het podium in beide richtingen om ervoor te zorgen het hele fruitvlieg kunnen worden afgebeeld. Klik op de knop "start" in de software om een ​​dataset te verwerven om beelden van de fruitvlieg in 3 dimensies te verkrijgen. Opmerking: De 3D vlieg structuur kan worden gemaakt met behulp van 3D-software Amira
    8. Gebruik een natte zachte borstel om de gemeten fly bevochtigen en voorzichtig verwijderen uit het glaasje. Verplaats het in een afzonderlijke buis voor de continue ontwikkeling. Label de buis voor longitudinale studie door de volgende ontwikkelingsstadia.
  3. Afbeelding Drosophila bij Pupal Stages
    LET OP: Alle fruitvliegjes werden genomen voor de beeldvorming van PD1 tot PD5. Zoals in de larve schema in figuur 1b, een breed lumen blijft A5 A8 segmenten vae hartbuis tot PD1. Van PD2, een conische kamer begint te ontstaan ​​tussen A1 tot A4 segmenten. Om consistente beelden te verwerven en het hart analyse te vergemakkelijken, werden dwarse M-modus beelden verkregen uit de A7 segment PD1 en van A1 segment na PD2, zoals aangegeven in Figuur 1b.
    1. Afbeelding Drosophila bij PD1
      LET OP: Drosophila zal een witte puparium voor een korte tijd raam (0-1 uur) tijdens PD1. Dit tijdvenster is ideaal voor het uitvoeren van optische beeldvorming van de vroege pop omdat de hoge transparantie leidt tot hogere lichtinval voor de OCM beeldvorming.
      1. Aangezien de fruitvliegjes bevinden zich aan de buiswand wanneer zij pop, verwijder de pop uit afzonderlijke buizen voor beeldvorming bij PD1 met een natte zachte borstel en reinig de pop met de borstel als er voedsel vast aan het lichaam.
      2. Monteer de fruitvlieg op een klein glasplaatje rechtstreeks met de natte borstel en houd de dorsale zijde naar boven (figuur 1a ). Controleer het glaasje is klein genoeg om terug te passen in de buis na beeldvorming in deze fase is voltooid.
      3. Verwijderen overmatig water uit de zijkant van de vlieg lichaam.
      4. Zet het glaasje op het monster etappe van de OCM-systeem, het bijhouden van de fruitvlieg op de top. Vind duidelijke real-time beeld van de A7 segment van de vlieg hart gebruik te maken van dezelfde strategie in de larve meting beschreven.
      5. Stel dezelfde parameters van de data-acquisitie software zoals in paragraaf 3.2, en het beeld van de hartslag bij de A7 segment dwarse M-modus en 3D-beelden te verwerven.
      6. Na beeldvorming, gebruik dan een pincet om het glaasje met pop plaatsen terug in de buis voor continue cultuur.
    2. Afbeelding Drosophila bij PD2 om PD5 Stages
      OPMERKING: Aangezien het specimen wordt steeds ondoorzichtige tijdens het popstadium stadia, de penetratiediepte van het beeldvormingssysteem worden verminderd.
      1. Gebruik een pincet om voorzichtig de glazen sLiDE gemonteerd met de vlieg op PD2 uit de buis voor de beeldvorming. Bij PD2, het monster reservoir wordt geel en het lichaam minder transparant opzichte PD1 (figuur 1).
      2. Zet de schuif op het monster etappe van de OCM-systeem.
      3. Stel de monster etappe naar de vliegen te verplaatsen naar de focal plane van beeldvorming straal van het OCM-systeem. Vind het voorste einde van het hart buis beeld real-time cross-sectionele OCM met. Verplaats ~ 50 urn terug in het achterste richting de A1 segment van het hart buis te vinden.
        LET OP: Op dit punt van de ontwikkeling van het hart (PD2), de kegelvormige kamer zal zeer klein zijn en mogen niet worden verslaan.
      4. Verzamel transversale M-mode datasets van het A1 segment alsmede 3D data op dezelfde manier als eerdere ontwikkelingsstadia.
      5. Zet de schuif terug naar de buis zorgvuldig voor continue cultuur.
        OPMERKING: Bij PD3, de kleur van het monster in de schaal is donkerder dan die PD2 stadium. Bij PD4 stadium, zwarte strepen can in acht worden genomen in de schil van de monsters. Sommige vliegt zal ontwikkelen tot volwassenen van deze fase van de volgende dag, terwijl anderen zullen evolueren naar PD5. Bij PD5 stadium, zwarte strepen zijn nog duidelijk te zien in de fruitvliegjes. Deze vliegen worden volwassenen in de volgende dag worden.
  4. Afbeelding Drosophila bij het volwassen stadium
    OPMERKING: Bij het volwassen stadium, kunnen vrouwelijke en mannelijke vliegen worden onderscheiden door de grootte van het lichaam en de kleur van de onderbuik. Vrouwelijke volwassenen hebben groter formaat, terwijl de mannetjes zijn kleiner en donker gekleurd in de onderbuik.
    1. Neem de buis uit de incubator als de fruitvlieg zich ontwikkelt tot een volwassen, en de overdracht van de volwassen vliegen naar een ~ 45 ml lege flacon.
    2. Dompel het absorberende uiteinde (~ 1 cm lengte, ~ 3 mm diameter) van een wand in de anesthesie, zet de wand in de flacon en sluit de buis met een cluster van katoen aan het verdovingsmiddel einde net onder de aangesloten katoen en te houden Anesthetize de vlieg voor 3 min. De duur van de anesthesie afhankelijk van de grootte van de vlieg en kan variëren tussen 2,5 tot 3,5 min (bijvoorbeeld 2,5 min voor mannelijke, vrouwelijke 3 of 3,5 min).
    3. Bereid een glasplaatje met een stukje dubbelzijdige tape.
    4. Verplaats het verdoofd vlieg op het glas dia met dorsale zijde naar boven met behulp van de zachte borstel.
    5. Scheid de vleugels met behulp van een pincet en plak de vleugels op de band onder een microscoop om de vliegen te lossen en bloot de hartstreek voor beeldvorming.
    6. Het imago van de vlieg van de A1 segment van de vlieg hart (figuur 1). Na afloop van het experiment, kan de vlieg worden opgeofferd.

4. Imaging Analyse 16

  1. Ontwikkelen van Matlab programma's om de 2D- en 3D-binaire bestanden verzameld met het beeld acquisitie software om image bestanden te converteren.
  2. Gebruik ImageJ om het hart buis regio in de dwarse M-modus foto's en een toverstaf algoritme te identificeren createa masker van het hart streek voor elk beeld transversale M-mode. Segment de gemaskerde gebied en gebruik een piek vinden algoritme om de systolische en diastolische locaties te identificeren. Bereken tijdsafhankelijke veranderingen het hart diameter van de dwarse M-modus beelden.
  3. Op basis van de verworven tijdsafhankelijke hart diameters, het berekenen van de cardiale parameters zoals HR, hartactiviteit periode (CAP), eind diastole diameter (EDD), eind systole diameter (ESD), eind diastole gebied (EDA), en eindigen systole gebied ( ESA). Bereken de fractionele verkorting (FS) met figure-protocol-1
  4. Gebruik ImageJ om de 3D OCM beelden te analyseren om de structurele ontwikkeling van de vlieg hart te visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De longitudinale cardiale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de fruitvliegen met 24B-GAL4 / + rek bij kamertemperatuur OCM. De metingen werden uitgevoerd bij L2, L3, en 8 uur intervallen van PD1 tot PD4, en volwassen dag 1 (AD1) aan de metamorfoseprocédé (tabel 1) te volgen. Larven, poppen vroege, late poppen en volwassen vliegen werden gemonteerd op glasplaatjes zoals in Figuur 1A. Het segment kenmerken van het hart voor larven en volwassen vliegen werden getoond in de schemat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De snelle hartslag van Drosophila, met een maximum HR rond de 400 slagen per minuut bij larven en volwassen stadia, vereist een hoge snelheid van de beeldvorming naar het hart diastoles en systolen (niet minder dan 80 beelden / sec op basis van ervaringen) op te lossen. Vanwege de kleine afmetingen en hartkamer micron schaal hart wanddikte (5-10 urn), een hoge ruimtelijke resolutie (beter dan 2 pm) vereist voor het oplossen van het hartbuis structuren. In deze studie, een hoge resolutie en ultrahoge snelheid OC...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot het huidige onderzoek.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Lehigh University Start-Up Fund, de NIH (R00EB010071 aan C.Z., R15EB019704 aan C.Z. en A.L., R03AR063271 aan A.L., en R01AG014713 en R01MH060009 aan R.E.T.), de NSF (1455613 aan C.Z. en A.L.), de Cure Alzheimer's Fund (aan R.E.T.), en het Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award aan A.L.). M.C. en Y.M. werd ondersteund door het National Key Basic Research Program of China (973 Program) onder subsidienummer 2014CB340404.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Custom OCM imaging systemOntwikkeld in ons lab
my Temp Mini Digital IncubatorBenchmarkH2200-HC
Cover glassAmScope200PCS
Cotton BallRITE AID
Instant Drosophila FormulaCAROLINAformule 4-24
YeastActiveDry
MicroscopeSONYWILD M420
BrushLoew-Cornell245Bwordt gebruikt om monsters te verplaatsen
Labview softwareNational Instruments
ImageJNational Institutes of Health
MatlabMathworks
TweezerWihaAA SAom de vleugels van de fruitvlieg te fixeren
FlyNapCarolina Biological Supply Company4.224.898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 MScotch
PipetteFisherbrandMU18837
Organic Extra Coconut OilSpring Valley13183
Microscope SlideCapitolBrandM3504-E
Drosophila VialsSEOH8401SS
All-trans-retinalSigma-Aldrich Co.R2500

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021(2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213(2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236(2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425(2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425(2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014(2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313(2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020(2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639(2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila hartbeeldvorming van hartfunctietransversale M modus3D OCM beeldvormingkwantificering van de hartslagperiode van cardiale activiteitDrosophila metamorfoseniet invasieve beeldvorminglongitudinale studie

Gerelateerde artikelen