Het testen van de Vasculaire Invasieve Vermogen van kankercellen in zebravis (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

Samenvatting

Deze werkwijze gebruikt zebravisembryo's efficiënt testen vasculaire invasieve vermogen van kankercellen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiac sinus of dooierzak ontwikkelende embryo's. cel kanker vasculaire invasie en extravasatie wordt beoordeeld via fluorescentie microscopie van de staart regio 24-96 uur later.

Samenvatting

Vasculair binnendringen en extravasatie van kankercellen is een kenmerk van metastatische progressie. Traditionele in vitro modellen van kankercel-invasie van endotheel missen doorgaans de vloeistofdynamica waaraan binnendringende cellen in vivo anders worden blootgesteld. Echter, in vivo systemen zoals muismodellen, hoewel fysiologisch relevanter, vereisen langere experimentele tijdschalen en stellen unieke uitdagingen met betrekking tot monitoring en data-analyse. Hier beschrijven we een zebravistest die deze technische kloof probeert te overbruggen door een snelle beoordeling van vasculaire invasie en extravasatie van kankercellen mogelijk te maken. De aanpak omvat het injecteren van fluorescerende kankercellen in de precardiale sinus van transparante 2-dagen oude zebravis-embryo's waarvan de vaatwand is gemarkeerd door een contrasterende fluorescerende reporter. Na injectie moeten de kankercellen in circulatie overleven en vervolgens extravaseren uit de bloedvaten in weefsels in het staartgebied van het embryo. Extravaseerde kankercellen worden efficiënt geïdentificeerd en gescored in levende embryo's via fluorescentiebeeldvorming op een vast tijdstip. Deze techniek kan worden aangepast om intravasatie en/of competitie tussen een heterogene mix van kankercellen te bestuderen door de injectieplaats te veranderen naar de dooierzak. Samen kunnen deze methoden een kenmerkend gedrag van kankercellen evalueren en mechanismen onthullen die indicatief zijn voor kwaadaardige progressie naar het metastatische fenotype.

Inleiding

Metastatische ziekte is een belangrijke oorzaak van kankersterfte en vele mechanismen waarmee kankercel disseminatie nog worden ontdekt ^1. Om een ​​kankercel met succes uitzaaien, moet het eerst binnen te dringen door het stroma dat een primaire tumor omringt, in te voeren (intravasate) in de bloedsomloop, overleven in transit, afslag (extravasaat) uit de circulatie, en tot slot de oprichting van een microflora naar de verre orgaan met ^2. Intravasation en extravasatie zijn dus cruciale stappen in de metastatische cascade, maar toch elke kankercel is niet inherent bedreven in het verstoren en het migreren door middel van endotheliale kruispunten ....

Protocol

Ethiek Verklaring: zebravis embryo's werden geproduceerd volgens een goedgekeurde IACUC protocol. Deze experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Georgetown University Animal Care en gebruik Comite.

1. Organiseren Embryo's voor injectie en Create Stock Solutions

1. Genereer vereiste zebravis larven kankercel vasculaire invasie te beoordelen.
   1. Opzetten paarsgewijze of groep in-cross paring met Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa ^b692; ednrb1 ^B140 vis.
      LET OP: Wij gegenereerd Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa ^b692;

Resultaten

Hier hebben we getest de vasculaire invasieve vermogen van veelgebruikte borstkankercellijnen in een zebravis embryo model (figuur 1). Strenge criteria werden gebruikt in het noteren extravasatie voor deze verschillende cellijnen, waarbij positieve gebeurtenissen alleen werden geteld als de kankercellen duidelijk had geëxtravaseerd, dit gebeurt vooral om eventuele vals-positieven die kunnen voortvloeien uit het maken cellulaire afval te beperken.

Discussie

Deze techniek maakt gebruik van de zebravis model om de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen (zie figuur 1) efficiënt testen. Hier pasten we de techniek om een panel van borstkankercellijnen teneinde een basislijn waarop andere onderzoekers vervolgens hun studies bouwen verschaffen (zie tabel 1, figuren 2-3). De waarneming dat MDA-MB-231-cellen gemakkelijk binnengevallen in de caudale regio van de zebravis embryo's zou deze cellijn ideaal voor het testen v.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
100 mm Dishes	Corning Incorporated	3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass	Fisher Brand	13-678-20B
60 mm Dish	Corning Incorporated	3160-60
Agarose, Low Melting	Fisher	BP165-25
Agarose, Molecular Grade	Bioline	BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller	Hofstra Group	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0 mm	World Precision Instruments, Inc	E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)	Fluka	A5040
Eyelash Brush	Ted Pella, Inc	113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes	ThermoFisher Scientific	13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Brand	02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm)	ThermoFisher Scientific	150680
Glass Depression Slide	VWR	470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt	Pentair	IS50
Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8 Confocal Microscope	Leica
Micromanipulator	Narishige
Eclipse E600	Nikon
PBS	Life Technologies	10010-023
Penicillin-G Potassium	Fisher Biotech	BP914-100
Petri Plates, 100 mm x 15 mm	Fisher Brand	FB0875713
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
Streptomycin Sulfate	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	ThermoFisher Scientific	V22885
Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886
Zebrafish	Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.