Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Samenvatting

We zijn erin geslaagd een methode te ontwikkelen voor RNA-isolatie uit plantenzaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen bevatten, die remmende effecten hebben op RNA-isolatie met hoge zuiverheid. Onze methode is geschikt voor het monitoren van de expressie van genen met transcripten op laag niveau in zaden.

Samenvatting

Plantenzaden accumuleren grote hoeveelheden opslagreserves die bestaan uit biologisch afbreekbare organische stof. Mensen zijn afhankelijk van de opslagreserves van zaden voor voedsel en als industriële materialen. Genexpressieprofielen zijn krachtige hulpmiddelen voor het onderzoeken van metabole regulatie in plantencellen. Daarom zijn gedetailleerde, nauwkeurige genexpressieprofielen tijdens de ontwikkeling van zaden noodzakelijk voor gewasveredeling. Het verkrijgen van hoog gezuiverde RNA is essentieel voor het produceren van deze profielen. Efficiënte methoden zijn nodig om hoog gezuiverd RNA uit zaden te isoleren. Hier beschrijven we een methode voor het isoleren van RNA uit zaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen bevatten, die remmende effecten hebben op de isolatie van hoog-zuiverheid RNA. Onze methode maakt het mogelijk om hoog gezuiverd RNA uit zaden te verkrijgen zonder het gebruik van fenol, chloroform of aanvullende processen voor RNA-zuivering. Deze methode is toepasbaar op Arabidopsis-, koolzaad- en sojazaden. Onze methode zal nuttig zijn voor het monitoren van de expressiepatronen van laagwaardige transcripten in ontwikkelende en volwassen zaden.

Inleiding

Planten produceren zaden, die aanleiding geven tot de volgende generatie te geven. Zaden accumuleren van grote hoeveelheden opslagreserves, zoals oliën, koolhydraten en eiwitten, na kiemkracht groei. Mensen maken gebruik van zaad opslag reserves als bron van levensmiddelen en diervoeders, en dus plantenzaden zijn een van de belangrijkste leveranciers van eetbare organische stof wereldwijd. Het verhogen van zaad opbrengst is een belangrijke uitdaging in de plantkunde.

Sinds zaad opslag reserves zijn in de handel waardevolle bronnen van voedsel en industriële materialen, hebben de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van het metabolisme van deze reserves op grote schaal onderzocht ^1-6. Verder ophelderen van deze mechanismen nuttig zijn voor het verhogen van zaadopbrengst in gewassen. Zaden ontwikkelen fabriek eierstokken na de bevruchting, en ze volwassen worden door middel van een reeks van ontwikkelingsstadia ^1,6,7. Verder inzicht in de moleculaire mechanisme onderliggende zaad ontwikkeling vereist gedetailleerdeNauwkeurige genexpressieprofielen van een aantal ontwikkelende zaden te produceren. De grote hoeveelheden van oliën, eiwitten, koolhydraten en polyfenolen in plantenzaden bemoeilijken sterk gezuiverd RNA, dat nauwkeurige profilering van genexpressie uitsluit isoleren.

Hier introduceren we een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit oliezaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen. Bij deze methode zal onderzoekers kunnen sterk gezuiverde RNA te bereiden. Dergelijke RNA zal nuttig zijn voor het bewaken van transcriptionele veranderingen in de belangrijkste genen regelen van de metabole regulatie van het zaad opslag reserves in het ontwikkelen en volwassen oliehoudende zaden zijn.

Protocol

1. Extractie van Totaal RNA van Plant Seeds

1. Bereid buffer sets, spinkolommen, 1,5 en 2,0 ml polypropyleen buizen en nuclease-vrij 1,5 ml polypropyleen buizen.
2. Voeg 1% (w / v) moleculaire biologie graad polyvinylpyrrolidon (hierna PVP) met lysisbuffer cel voor RNA-extractie en vortex krachtig. Incubeer gedurende 20 minuten bij 25 ° C tot volledig oplossen. Na 20 min incubatie meng de buffer voorzichtig door de buis ondersteboven om de vorming van bellen te voorkomen. Bewaren bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voor gebruik.
3. Oogst fruit uit Arabidopsis thaliana planten en plaats in 1,5 ml polypropyleen buizen op ijs. Plaats vruchten op aluminium platen bewaard bij 4 ° C en isoleren zaden uit de vruchten onder een stereomicroscoop.
   1. Plaats de zaden geïsoleerd (ongeveer 200 zaden) in 1,5 ml polypropyleen buizen die zijn opgeslagen in een aluminium rek op ijs en onmiddellijk in zijn buizen in vloeibare nitrogen.
4. Verwijder de buizen uit de vloeibare stikstof en terug te geven aan de aluminium rek op ijs. Voeg 100 pi van de buffer die 1% PVP en centrifugeer gedurende 1 min bij 1000 xg bij 4 ° C.
5. Homogeniseren van het monster met een roestvrijstalen stamper met een motor-slijper voor 60 s terwijl de buis in de aluminium rek op ijs.
6. Voeg 550 pi van de buffer die 1% PVP, meng de buffer voorzichtig door de buis ondersteboven en incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C.
7. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8000 xg bij 25 ° C en overdracht 550 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml polypropyleen buis.
8. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 10.000 xg bij 25 ° C en overdracht 450 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml polypropyleen buis.
9. Gebruik het supernatant als het cellysaat voor RNA-extractie. Hierna volgt u de aanwijzingen van de fabrikant beschreven in de handel verkrijgbare kit.
10. Elueer deRNA met behulp van een minimaal volume van de elutiebuffer om een ​​voldoende hoge concentratie van RNA te zorgen voor de bewaking van de expressie patronen van de lage niveau transcripten. Bewaar het RNA in een vrieskast tot gebruik.

2. Verificatie van RNA Quality

1. Ontdooi de totale RNA, meng door zachtjes te tikken, en plaats de buis in een aluminium rack op ijs.
2. Meet de RNA-concentratie, A260 / A280-verhouding, en A260 / A230-verhouding met behulp van een microvolume spectrofotometer.
3. Verdun het totale RNA in RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 70 ng / ul.

3. Reverse transcriptie van totaal RNA van zaden

1. Ontdooi de totale RNA en buffer sets van het commerciële kit. Houd de enzymen uit de kit op ijs na zachtjes te tikken. Bereid nuclease-vrij 0,2 ml polypropyleen buizen.
2. Voeg 5 ul totaal RNA, 1 pl Oligo dT primer (50 uM), en 1 pM van willekeurige 6-mer (50 uM) aan de 0,2 ml polypropeenlene buis op ijs.
3. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C en plaats op ijs.
4. Hierna volgt u de aanwijzingen van de fabrikant beschreven in de reverse transcriptie-PCR kit.
5. Plaats de reverse transcriptie producten op ijs voor gebruik.

4. Kwantitatieve real-time PCR-analyse

1. Construct plasmiden die het doelgen sequenties behulp protocol van de fabrikant.
2. Stel de concentraties 100-500,000 kopieën / ul voor DNA-matrijzen voor de standaard curves.
3. Verdun de cDNA oplossing (1: 100) met gedestilleerd water.
4. Voeg 2 pi van de verdunde oplossingen cDNA en de plasmiden voor de standaard curves de master mix van de kwantitatieve real-time PCR kit.
5. Opgericht real-time PCR met de volgende cyclingcondities: 95 ° C gedurende 30 s en vervolgens 40 cycli bij 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 35 s.
6. Analyseer de kopie nummers volgens de manbrikant van instructies voor de real-time PCR systeem.

Resultaten

We hebben eerst onderzoek gedaan naar de optimale concentratie van PVP gebruik van Arabidopsis rijpe zaden. Totaal RNA werd geïsoleerd uit ongeveer 1000 zaden volgens bovenstaande behulp cellysis buffer die 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% of 2,0% PVP beschreven protocol. Na homogenisatie en centrifugatie werd het supernatant verzameld met vermijding van de olielaag en zaden afval (Figuur 1A).

Discussie

Genexpressieprofielen bijdragen aan ons begrip van plantenfysiologie; Daarom zijn specifieke RNA isolatiemethoden ontwikkeld voor elk monster staat ^9-12. Onderzochten we de processen die tijdens de RNA-isolatie werden geremd uit zaden en vond dat RNA binding aan silica membranen was ernstig geremd. Grote hoeveelheden olie, eiwitten en polyfenolen remmen RNA-isolatie. We pasten de RNA-extractiewerkwijze om deze verbindingen te verwijderen met een lysisoplossing voor het proces van RNA binding aan silica membra...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidon	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGENIZER S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit	Kapa biosystems	KK4601