Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van cellulair metabolisme in complexe gemeenschappen van meerdere celtypen, met behulp van een combinatie van stabiel isotooptracering, celsortering om specifieke celtypen te isoleren en massaspectrometrie.

Samenvatting

Zoogdiercelltypen vertonen gespecialiseerd metabolisme, en er is voldoende bewijs dat verschillende naast elkaar bestaande celtypen betrokken zijn bij metabolische samenwerking. Bovendien kunnen zelfs culturen van een enkel celtype cellen bevatten in verschillende metabolische toestanden, zoals rustende of cyclische cellen. Methoden om de metabolische activiteiten van dergelijke subpopulaties te meten, zijn waardevolle hulpmiddelen voor het begrijpen van cellulair metabolisme. Complexe celpopulaties worden meestal gescheiden met behulp van een celsorteerder, en subpopulaties die door deze methode zijn geïsoleerd, kunnen worden geanalyseerd met metabolomics-methoden. Een probleem met deze aanpak is echter dat de celsorteringsprocedure cellen onderwerpt aan stress die hun metabolisme kan verstoren.

Om deze problemen te overwinnen, redeneerden we dat de massa-isotopomerverdelingen (MIDs) van metabolieten uit cellen gekweekt met stabiel isotoop-gelabelde voedingsstoffen waarschijnlijk stabieler zijn dan absolute metabolietconcentraties, omdat MIDs worden gevormd over langere tijdschalen en minder zouden worden beïnvloed door kortetermijnblootstelling aan celsorteringscondities. Hier beschrijven we een methode gebaseerd op dit principe, die celsortering combineert met vloeistofchromatografie-hoog resolutie massaspectrometrie (LC-HRMS). De procedure omvat het analyseren van drie soorten monsters: (1) metaboliete extracten verkregen direct uit de complexe populatie; (2) extracten van 'mock sorted' cellen die door het celsorteerder-instrument zijn gepasseerd zonder enige specifieke populatie te scheiden; en (3) extracten van de daadwerkelijk gesorteerd populaties. De mock sorted cellen worden vergeleken met directe extractie om te verifiëren dat MIDs inderdaad niet worden gewijzigd door de celsorteringsprocedure zelf, voorafgaand aan het analyseren van de daadwerkelijke gesorteerd populaties. We tonen voorbeeldresultaten van HeLa-cellen gesorteerd volgens celcyclusfase, die veranderingen in nucleotidemetabolisme onthullen.

Inleiding

Hogere organismen bevatten complexe gemeenschappen van verschillende celtypen die samenwerken om meer complexe functies te brengen. Bijvoorbeeld tumoren bevatten niet alleen kankercellen, maar ook fibroblasten, cellen die bloedvaten vormen, vaak immuuncel infiltraten ^1; bloed bevat een complex mengsel van tientallen immuuncel subtypen ^2; en zelfs gekweekte cellijnen kunnen bestaan uit meerdere subpopulaties, zoals de luminale en basale subtypes van borstkankercellen ^3. Bovendien verschillende celtypen die naast elkaar kunnen metabole "samenwerken" vertonen. Bijvoorbeeld in de hersenen, astrocyten worden verondersteld om glucose om te zetten naar lactaat, die vervolgens "gevoed" neuronen die dit substraat ⁴ oxideren; T-lymfocyten zijn in sommige contexten afhankelijk aangrenzende dendritische cellen als een bron van cysteïne ^5; en kankercellen kunnen samenwerken met assobehorende fibroblasten in tumoren ^6. De metabolische gedrag van dergelijke systemen te begrijpen, is het noodzakelijk te scheiden en meten van de metabolische activiteiten van de verschillende celtypen aanwezig.

Verreweg de meest gebruikte methode voor het scheiden van celtypes is fluorescentie-geactiveerde celsortering. Deze werkwijze is breed toepasbaar, mits het celtype of de toestand van belang kan worden "gemerkt" met fluorescerende antilichamen expressie van fluorescente proteïnen, of andere kleurstoffen. Een optie is om in eerste instantie een aparte cellen types door middel van een cel sorter, re-cultuur van de afzonderlijke celtypen verkregen, en vervolgens uit te voeren onderzoek naar het metabolisme van deze culturen ^7. Dit is echter alleen mogelijk als het type cel of fenotype stabiel in kweekomstandigheden, en kan transient gedrag vangen zoals celcyclus staten, noch de metabolische samenwerking in co-culturen. Voor dergelijke gevallen moet de stofwisseling direct worden gemeten, zodatrted cellen. Dit is een uitdaging, omdat de celsortering procedure onderwerpt cellen om de spanningen die hun metabolisme ⁸ kunnen verstoren, en we zijn ons bewust van de weinige studies die deze aanpak ^{9, 10.} In het bijzonder hebben wij gevonden dat belangrijke metabolieten zoals aminozuren kunnen lekken uit cellen in celsortering buffer gehouden, zodat metingen van absolute metaboliet abundantie niet meer betrouwbaar ¹¹ (hoewel relatieve vergelijking tussen gesorteerde fracties nog steeds waardevol kan zijn).

Om deze problemen te omzeilen, We noemen cellen met stabiele isotopen uit te sorteren, en focus op de MID in cellulaire metabolieten, plaats metaboliet abundanties. Sinds MID's worden gevormd over langere tijdschalen, moeten ze minder worden beïnvloed door kortdurende blootstelling aan het sorteren van omstandigheden. We kwantificeren MID's met behulp van full-scan met hoge resolutie massaspectrometrie, die gevoelig genoeg is om da te biedenta op honderden metabolieten vanaf ongeveer 500.000 gesorteerde cellen, die ongeveer 30-60 min van celsortering tijd. Een vergelijking tussen een "mock gesorteerd" controle (cellen doorgegeven via de celsorteerinrichting instrument zonder gating specifieke populatie) en metaboliet extractie direct uit de kweekschaal wordt nagegaan of de waargenomen MID representatief zijn voor die welke in het oorspronkelijke cultuur. Afhankelijk van de keuze van stabiele isotopen kunnen diverse metabole pathways bestudeerd worden met deze methode.

Protocol

1. Metabolite Extraction

1. Extractie uit schotel
   1. Kweekcellen in een 6-wells plaat in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen (serum of andere groeisupplementen) tot cellen 75% confluent.
      OPMERKING: Hier kweek HeLa cellen gedurende 48 uur in RPMI dat 40% U- ¹³ C-glucose en 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N2-glutamine en 5% gedialyseerd FBS (foetaal runderserum). Gedialyseerd FBS wordt gebruikt om zich te ontdoen van de kleine moleculair gewicht metabolieten die de gelabelde media kunnen besmetten. Het kweken van cellen in aanvulling gedialyseerd voorafgaand aan de werkelijke experiment wordt aanbevolen om te verzekeren cellen worden normaal groeien in het medium. Supplementen worden gedialyseerd in 0,15 M NaCl-oplossing 's nachts met behulp van snake skin dialyse tubing.
   2. Op de dag van de winning teruggooi cultuur media, spoel putten tweemaal met 500 pi koude HBSS en dan gooi hem weg.
      LET OP: Hier gebruiken HBSS met 40% U-13 C-glucose omdat het ook in het kweekmedium.
   3. Voeg 600 ul 100% methanol voorgekoeld op droog ijs.
   4. Breng het gerecht om ijs te drogen en verwijder celmateriaal met een cel schraper.
   5. pipet voorzichtig de celextracten aan een microcentrifugebuis en bewaar bij -80 ° C tot massaspectrometrie analyse.
2. Extractie van mock gesorteerde cellen
   1. Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen.
      OPMERKING: Hier kweek HeLa cellen gedurende 48 h in 100 mm schaal omdat een groot aantal cellen (4 x 10 ~ ⁶⁾ nodig zijn gesorteerd 500.000 cellen te verkrijgen. Dit aantal HeLa-cellen extract gehouden is de meting van metabolieten te verkrijgen. De gebruikte kweekmedia was RPMI dat 40% U- ¹³ C-glucose en 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N2-glutamine en 5% gedialyseerd FBS.
   2. Op de dag van de winning, de teruggooi cultuur media, spoel putten wide 1,5 ml warm HBSS en dan gooi hem weg.
   3. Los cellen door toevoeging van 1,5 ml trypsine / EDTA gedurende 4 min bij 37 ° C. De volgende stappen van 4 ° C of op ijs.
   4. Deactiveren trypsine door het toevoegen van 3 ml ijskoude HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) + gedialyseerd supplement.
   5. Verzamel cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 750 xg gedurende 3 min.
   6. Resuspendeer de pellet in HBSS + gedialyseerd supplement + 1 mM EDTA bij een concentratie van 1-2 x 10 ⁶ cellen / ml, passeren 40 urn cel zeven tot enkele cellen te verkrijgen en over te dragen aan een 5 ml buis.
   7. Soort cellen door celsortering gating alleen singlets en centrifugeer gesorteerd cellen bij 750 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
      LET OP: Hier soort HeLa-cellen met een snelheid 1.000 evenementen / s, met een instrument druk 27 psi, en met behulp van een 100 urn mondstuk. HeLa-cellen zijn groot, dus ze moeten worden gesorteerd in een traag tempo evenement en grote sproeier zo intact pellet mogelijk te krijgen. Houd de cellen in koud blokken throughout sorteren om het metabolisme te verminderen. Een grondige beschrijving van het sorteren procedure is eerder ¹² beschreven.
   8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ul ijskoud dH ₂ O tot een homogeen pellet te verkrijgen voor het toevoegen van methanol. Toevoeging van koude methanol rechtstreeks pellet vormt een stevige pellet die moeilijk te mengen.
   9. Extract metabolieten door de toevoeging van 540 ul methanol in droog ijs gehouden en houden extracten bij -80 ° C tot vloeistofchromatografie - hoge resolutie massaspectrometrie (LC-HRMS) analyse.
3. Extractie van de celcyclus gesorteerde cellen
   1. Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in kweekmedium + gedialyseerd supplementen.
      LET OP: Hier kweek HeLa-cellen die Geminin Fucci Green (MAG1-hGem) sonde ¹³ die het mogelijk maakt voor het sorteren van de G1 (negatief) en SG2M (positief) cellen. Cellen kunnen worden gekweekt in stabiele isotoop opsporen media voor eens lang als nodig. Hier hebben we ze gekweekt gedurende 46 uur in ongelabelde media, dan hebben we naar RPMI dat 40% U- ¹³ C-glucose en 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N2-Glutamine 2 uur voor het begin sortering. Dit werd gedaan om te kunnen de celcyclus fasen korte puls labeling vereist bestuderen.
   2. Op de dag van de winning, de teruggooi cultuur media, spoel putten met 1,5 ml warm HBSS en dan gooi hem weg.
   3. Los cellen door toevoeging van 1,5 ml trypsine / EDTA gedurende 4 min bij 37 ° C. De volgende stappen van 4 ° C of op ijs.
   4. Deactiveren trypsine door het toevoegen van 3 ml ijskoude HBSS + gedialyseerd supplement.
   5. Verzamel cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 750 xg gedurende 3 min.
   6. Resuspendeer de pellet in HBSS + gedialyseerd supplement + 1 mM EDTA bij een concentratie van 1-2 x 10 ⁶ cellen / ml, passeren 40 urn cel zeven tot enkele cellen te verkrijgen en over te dragen aan een 5 ml buis.
   7. Sorteren cellen door de cel sorter gAting puin en wambuizen, dan gating voor de cel merker van interesse, en centrifugeer gesorteerd cellen bij 750 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
      LET OP: Hier soort HeLa-cellen met een snelheid 1.000 evenementen / s, met een instrument druk 27 psi, en met behulp van een 100 urn mondstuk. Houd de cellen in koud blokken gedurende het sorteren van de stofwisseling te verlagen.
   8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ul ijskoud dH ₂ O tot een homogeen pellet te verkrijgen voor het toevoegen van methanol. Toevoeging van koude methanol rechtstreeks pellet vormt een stevige pellet die moeilijk te mengen.
   9. Extraheer de metabolieten door toevoeging van 540 pi methanol in droogijs gehouden en houdt extracten bij -80 ° C totdat LC-HRMS analyse.

2. massaspectrometrie Analyse

Let op: Hier het protocol beschrijven we voor het analyseren van celextracten op een LC-HRMS systeem. Elke metabolomics voor de analyse van celextracten worden gebruikt. Volledige scananalyse kan nuttig zijn voor het detecteren van een groot aantal metabolieten.

1. Kalibreren van het instrument met behulp van een massaspectrometrie referentiekalibratie mix.
2. Dooi celextracten op ijs gedurende 30 min en vortex gedurende 15 s.
3. Breng 100 pi van het celextract op een spin filter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 xg bij 4 ° C.
4. Injecteer 12,5 pl van het filtraat op de LC-HRMS systeem.
5. Afzonderlijke metabolieten met een zwitterionen Hydrofiele Interactie vloeistofchromatografie (ZIC-HILIC) kolom (150 mm x 4,6 mm, 5 urn deeltjesgrootte) voorzien van een ZIC-HILIC voorkolom (20 mm x 2,1 mm) met een gradiënt elutie van 0,1% mieren- zuur in water (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B). Start de gradiëntelutie van 20% oplosmiddel A en verhogen tot 80% in 17 min. Handhaaf dit percentage gedurende 4 minuten met een stroomsnelheid van 400 pL min ^-1 en kolomtemperatuur en monsterblad bij 23 ° C en 4 ° C.
6. Gebruik een instrument gekoppeld aan de chromatografische scheiding van metabolieten detectie verwarmd elektrospray (H-ESI II) in zowel positieve als negatieve modes ionisatiebron, en een volledige scan acquisitiemodus met een massa oplossend vermogen van 70.000 volle breedte half maximum (FWHM) ( m / z 200).
7. Gebruik stikstof (zuiverheid> 99,995%) van het omhulsel gas en hulpgas met een debiet van 45 en 10 au (arbitraire eenheden) en stel verdampertemperatuur bij 350 ° C en de electrospray spanning op 4 kV positieve modus -3,5 kV in negatieve mode.

3. Gegevensanalyse

1. Selecteer een aantal metabolieten waarvoor normen beschikbaar zijn en die laten zien een goede kwaliteit pieken in de monsters. Goede kwaliteit pieken hoge signaal-ruisverhouding. Het is belangrijk om te verifiëren piek kwaliteit en zorg valse isotopen te omvatten. Isotoop pieken die verschillen in vorm en / of retentietijd waarschijnlijk vals.
2. Voor-isotoop gelabelde monsters te berekenen massa isotopomeer (MI) fracties van het piekoppervlak van elk MI delen met totale piekoppervlak van alle MI.
3. Bereken de gelabelde koolstof / stikstof fracties verrijking van ¹³ C en ¹⁵ N, respectievelijk, zoals
   
   waarbij n het totale aantal koolstofatomen (of stikstofatomen, respectievelijk) in de metaboliet en MIx is de MI fractie van x.
   Opmerking: Alle berekeningen worden uitgevoerd onder toepassing programmeertalen.

Resultaten

Als voorbeeld beschrijven we een experiment onderzoek naar het metabolisme van HeLa cellen gesorteerd volgens celcyclus fase. Een groot aantal centrale metabolieten zowel koolstofatomen en stikstofatomen labelen we gekweekte cellen gedurende 48 uur met gebruik van ^{U-13C-glucose} en U- ¹³ C, ¹⁵ N-glutamine als tracers. Rijke MID voor validatieproef verkrijgen we hier gekozen voor een mengsel van 40% U- ¹³ C-glucose en 70% U- ¹³ C,

Discussie

Onze werkwijze is gebaseerd op het principe dat MID in cellulaire metabolieten weerspiegelen de "geschiedenis" van metabolische activiteiten van een cel. Dit maakt het mogelijk om metabolische activiteiten onderzoeken subpopulatie van cellen, zoals ze zich in het complex door cellen, vóór de celsortering procedure. In tegenstelling piekoppervlakken van metabolieten verschillen sterk tussen de extracten van gesorteerde cellen en directe extractie uit de cultuur schotel ^11. Voor een deel ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)	BD Biosciences
U-13C-Glucose	Cambridge isotopes	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutamine	Cambridge isotopes	CNLM-1275-H-0.1
Methanol (JT Baker), HPLC grade	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC	Thermo Fisher scientific
Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer	Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm)	Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q water	Millipore		Geproduceerd met een Milli-Q Gradient systeem
Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid)	Fisher Scientific	11423423
X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps)	Thermo Fisher scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Calibratie kit
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10	Wolfram Research