Door inoculatie met kralen maakt de beschreven techniek het mogelijk om de melaniseringsrespons van de mug in het circulerende hemolymphesysteem te stimuleren. De hoeveelheid melanine die de kralen bedekt, kan na dissectie worden gemeten als een maatstaf voor de immuunrespons.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het stimuleren van immuunresponsen is een gemeenschappelijk instrument in ongewervelde studies om de werkzaamheid en de mechanismen van immuniteit onderzocht. Deze stimulatie is gebaseerd op de injectie van niet-pathogene deeltjes in insecten, aangezien de deeltjes gedetecteerd worden door het immuunsysteem en de productie van immuuneffectoren induceren. Wij richten ons hier op de stimulatie van de melanisatie respons in de mug Anopheles gambiae. De melanisatie reactie resulteert in de inkapseling van vreemde deeltjes en parasieten met een donkere laag van melanine. Om deze reactie te bevorderen, worden muggen geïnoculeerd met kralen in de borstholte via microcapillaire glazen buizen. Dan, na 24 uur, de muggen worden ontleed om de kralen te halen. De mate van melanisatie van de parel wordt gemeten met beeldanalyse software. Kralen niet de pathogene effecten van parasieten of hun vermogen te ontwijken of onderdrukken de immuunreactie. Deze injecties zijn een manier om measure immuun doeltreffendheid en de impact van het immuunsysteem stimuleringen op andere levensgeschiedeniskenmerken, zoals vruchtbaarheid of levensduur. Het is niet precies hetzelfde als direct bestuderen van gastheer-parasiet interacties, maar het is een interessant instrument om de immuniteit en de evolutionaire ecologie te bestuderen.
Inleiding
Insecten afhankelijk immuunreacties om zich te beschermen tegen parasieten en pathogenen 1-3 schenden die door hun cuticula of hun middendarm epitheel 4. In muggen, deze reacties zijn efficiënt tegen bacteriën 5, virussen 6, filarial nematoden 7 en malariaparasieten 1,8,9. Muggen, een belangrijke immuunrespons is het inkapselen van deeltjes met melanine 10-12. Deze inkapseling kan gebeuren in de middendarm of de hemolymfe circulatiesysteem 10-12. Dit melanisatie reactie is het gevolg van de pro-fenoloxidasesubstraat cascade 10-12, en kan leiden tot de dood van de parasieten of hun fagocytose. Bij volwassen muskieten, waarbij het aantal cellen hemocytes beperkt, melanisatie een humorale respons, zoals tegen plasmodium parasieten of filarial nematoden 7.In sommige andere insecten, het ligt direct aan de hemocytes cellen die zich verzamelen rond de parasiet om ze 7 melanize. Trouwens, melanine is ook essentieel voor een aantal andere fysiologische processen, zoals de productie van eieren en cuticula wonden helen van 7.
Het stimuleren van immuunresponsen wordt gebruikt als een middel om insecten immuniteit bestuderen in verscheidene landbouw- en volksgezondheid modelsystemen 13-18. Het wordt gebruikt in Anopheles gambiae muggen, de belangrijkste vector van malaria in Afrika, gastheer-parasiet interacties 14 bestuderen - 16,19. Deze technieken zijn gebaseerd op het vermogen van insecten detecteren van parasieten met hun patroonherkenning receptoren (PRR) 2. Muggen kunnen ook detecteren andere moleculen interfereren met hun biologische als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) of detecteren eigen beschadigde cellen door het vrijkomen van collageen en nucleïnezuren. De mug immuuncels zoals hemocytes worden gebruikt voor detectie 20-23. De belangrijkste immuun signaalwegen zijn IMD Toll, JAK / STAT 24 en ribonucleïnezuur interferentie (RNAi) 25,26. Zowel Toll en Imd paden invloed op de melanisatie respons en interactie met de pro-fenoloxidasesubstraat cascade 10-12.
De standaard instrument dat wordt gebruikt om de melanisatie reactie te bevorderen is het inenten van een mug met een kleine kraal in de hemolymfe van de borstholte. De mate van melanine inkapseling kan dan worden gemeten 19 na het ophalen van de kraal door de dissectie van de mug. In de meeste studies werd slechts één kraal geïnjecteerd per mug 15,16,27, maar met groter beads mogelijk om de grenzen van de melanisatie reactie 19 bestuderen. Deze kralen worden geïnjecteerd met een injectieoplossing (fysiologisch serum) verstoring van de mug fysiologie beperken ende verdroging van de mug 15,16,27. Een kleurstof wordt toegevoegd aan deze oplossing tot hiel selectie vergemakkelijken. Het is hetzelfde voor de dissectie is gebruikt voor de kraal 15,16,27 halen.
Het voordeel van insecten enten met niet-pathogene stimuli is het vermogen zich te concentreren op het directe effect op de immuunrespons. Er zijn geen complicerende effecten als gevolg van parasieten pathogene 28, immunosuppressie 29-31, of immuun belastingontduiking 31-34. Trouwens, de gevolgen van de stimuleringen op andere levensgeschiedenis eigenschappen, zoals duurzaamheid of vruchtbaarheid, kan ook worden bestudeerd. Zo kunnen onderzoekers bestuderen de evolutionaire ecologie dergelijke instrumenten 2,35,36 vereisen. Bijvoorbeeld-immuno uitgedaagd hommels hebben een verkorte levensduur onder hongersnood. Dezelfde negatieve effecten van immune stimulatie en implementaties zijn waargenomen bij verschillende ongewervelde modellen, vaak resulterend in een korteer levensduur of minder voortplantingssucces 13,27,37. Dergelijke studies kunnen worden uitgevoerd in verschillende omgevingen 2,4,38. Het stimuleren van de immuniteit is ook van belang voor degenen die direct gericht op immunopathologie 39,40.
Dit protocol is gebaseerd op de inoculatie van kralen met muggen melanisatie de reactie te bevorderen en is rechtstreeks meet de hoeveelheid melanine. Hierdoor kwantitatieve en kwalitatieve studie van de melanisatie respons in verschillende experimentele instellingen. Zo'n instrument kan worden uitgebreid tot het stimuleren van andere immuunresponsen, zoals antibacteriële reactie op warmte-gedode bacteriën 41. Het kan ook worden uitgevoerd in vele ecologische instellingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Saline oplossing voor injectie en Dissection
- Bereid de zoutoplossing door toevoeging van NaCl, KCl, CaCl2 en gedistilleerd water tot 1,3 mM NaCl, 0,5 mM KCl en 0,2 mM CaCl2 verkregen bij pH = 6,8.
- Voeg 1 ml 0,1% methylgroen oplossing van 99 ml van pekeloplossing de transparante korrels kleuren. Dit is de 0,001% methylgroen "injectieoplossing".
- Voeg vervolgens 5 ml 0,1% methylgroen oplossing van 45 ml zoutoplossing. Deze 0,01% methylgroen "dissectie oplossing" is 10 maal geconcentreerder in methylgroen de kleur van de kralen en de waarneming tijdens de dissectie te bevorderen.
LET OP: Filter steriliseren de buffer indien nodig.
2. capillaire Voorbereiding
- Heat-pull microcapillaire glazen buizen tot een zeer fijne punt iets groter dan de kleinste kralen (φ = 40 pm) 42 te verkrijgen.
- Open en eendjust elk capillair door het breken van de tip met een pincet of door zagen de tip.
3. Mosquito Het grootbrengen
- Achter A. gambiae op 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% relatieve vochtigheid en een 12:12 uur licht: donker cyclus. Houd volwassen vrouwtjes en geef ze toegang tot een 10% suikeroplossing.
4. Bead Selecties met de capillaire
- Pour 0,009 g negatief geladen korrels (40-120 urn in diameter) in een 5 cm Petrischaal en voeg 5 ml injectieoplossing 30 min vooraf.
LET OP: Het doel is om te laten de kleurstof kleur van de kralen om kraal selectie te maken voor injectie makkelijker. Autoclaaf de kralen als ze niet komen in een steriel potje. - Met behulp van een capillair aangebracht in een capillaire pipet bol, selecteert visueel de kleinste korrel in 0,1 pi van zoutoplossing onder een binoculaire microscoop.
OPMERKING: Wanneer tegelijkertijd het enten van verschillende kralen, selecteert drie kralen van een totaal volume van 0,1 pl.
5. Mosquito Handling en Inenting
- Met behulp van een insect aspirator, leg elke mug in een 50 ml buis.
- Chill elke mug kort door het plaatsen van de buis in gemalen ijs (2-5 min).
- Plaats een mug op de rechterzijde onder de binoculair microscoop.
- Onder een stereomicroscoop, beënt de mug met de capillair door stevig doordringen door de linkerzijde van de borstholte cuticula en vervolgens het injecteren van de vloeistof en de kraal.
LET OP: Zorg ervoor dat u de vlucht spieren beschadigen door het vasthouden van de capillaire als loodrecht op de mosquito mogelijk. - Verwijder het capillair.
- Met behulp van een tang vedergewicht entomologie, leg elke vrouw afzonderlijk in een 180 ml plastic beker bedekt met klamboe; geef ze toegang tot een 10% suikeroplossing.
LET OP: Voorzichtigheid is geboden met de suiker oplossing, omdat de mug kan vast komen te zitten op suikeroplossing druppels.
6. MosquitoDissection en Bead Fotografie
- Controleer of de muggen in leven zijn 24 uur na de inenting. Als dat zo is, check hun conditie en houdt alleen de muggen die in staat zijn om te vliegen zijn.
- Bevries deze muggen bij -20 ° C.
OPMERKING: Ze kunnen enkele dagen tot maanden worden bewaard vóór versnijding, indien nodig. - Verwijder de muggen 'wings met een pincet onder een binoculair microscoop bij 32x vergroting. Bevestig de vleugels op glas dia's met transparante tape. Noteer de code die gebruikt wordt voor elke individuele mug.
- Zet de objectglaasjes in een scanner en scant ze 1200 dpi.
LET OP: Controleer of de code leesbaar is voor elk individu mug. - Op een microscoopglaasje en dissectie oplossing, een tang om de borstkas te scheiden van het hoofd en buik.
- Open de thorax met een tang om de kralen te halen.
OPMERKING: Parels die niet naar de buik, niet in contact met elkaar en de meeste zweven vrij in thij hemolymfe. Voorzichtig de kraal met de tang niet te breken, als niet-gemelanizeerd bead moeilijk te vinden zijn. Wacht 1-5 min gedurende kralen kleur te verkrijgen. - Overdracht van de parels in een druppel dissectie oplossing op een glazen microscoopglaasje, voordat u de opname maakt.
LET OP: Geen behoefte om de kralen te wassen. - Met behulp van een microscoop uitgerust met een camera, neemt een digitaal beeld van elke korrel in een standaard belichtingsinstellingen en 400X vergroting.
NB: Laat de verlichting niet wisselen tussen de verschillende foto's om hun vergelijking mogelijk te maken.
7. Picture Analyse: Bead melanisatie
- Open de beeldanalyse software. Klik op "file" en dan op "open" om het beeld een kraal te vinden.
- Klik op "te analyseren." Klik op "set metingen." Vink het vakje "bedoel je grijswaarde" in het venster "ingestelde metingen".
- Klik op het icoon cirkel selectie tool. Selecteer de kraal omtrek; blijven inde kant van de kraal en te voorkomen dat de lichtgevende halo eromheen.
- Klik op de "analyseren" menu. Klik op "maatregel." Haal de gemiddelde grijswaarde en grootte van de dwarsdoorsnede van de kraal.
- Om de melanisatie waarde van elke kraal te krijgen, voert u de volgende handeling met behulp van een rekenmachine of calculator software: "256 - gemiddelde grijswaarde." De melanisatie maatregel is een waarde tussen 0 en 256, waarbij 0 beeld helemaal wit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Muggen niet alle melanize de kralen op dezelfde wijze, zoals sommige korrels werden bekleed met minder melanine dan andere (figuur 1). Sterker nog, sommige kralen bleef blauw als gevolg van een gebrek aan melanisatie, terwijl anderen waren volledig donker (figuur 1). De melanisatie waarde werd gestandaardiseerd door lineaire interpolatie op een waarde tussen 0 (wat overeenkwam met een blauwe en unmelanized bead) en 100 (overeenkomend met een donker...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze injectie techniek is handig te stimuleren en de studie van de melanisatie reactie in muggen. Bijvoorbeeld, hier hebben we het effect van het immuunsysteem stimuli belasting.
De kritische stap in deze procedure is om de mug goed inoculeren. Buitensporige schade aan de vlucht spieren of de mug zelf kan de mug uit voeding te voorkomen of kan het doden voordat de dissectie. Een tweede belangrijke stap is om de muggen op ijs lang genoeg om ze knock-out zonder ze te doden houden. Een kleine c...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek was mogelijk dankzij financiering van de Universiteit van Neuchâtel. We willen alle studenten bedanken die hebben bijgedragen aan het verbeteren van deze techniek, met name onze collega Kevin Thievent. We willen ook de leden van het Thomas Lab bedanken voor het beschikbaar stellen van hun laboratorium. We willen Janet Teeple bedanken voor haar hulp bij het fokken van muggen. We willen ook Loyal Hall in het laboratorium van Prof. Tom Baker bedanken voor zijn hulp bij de voorbereiding van de micro capillaire glasbuisjes.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatief geladen Sephadex CM C-25 kralen | Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland | C25120 SIGMA | heeft er een paar nodig om te beginnen |
| Methylgroen | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | heeft er een paar nodig om te beginnen |
| Software ImageJ | opensource | Versie 1.47f7 of hoger |
Referenties
- Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52(2006).
- Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
- Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
- Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
- Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
- Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
- Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
- Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
- Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865(2014).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
- Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
- Moret, Y., Schmid-Hempel, P. Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).
- Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
- Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
- Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
- Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
- Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
- Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210(2016).
- Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
- Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
- Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
- Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
- Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
- Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
- Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
- Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377(2004).
- Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
- Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
- Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
- Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
- Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
- Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
- Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
- Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
- Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
- Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
- Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
- Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
- Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711(2013).
- Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
- Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
