Methodenartikel

De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision

16.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55016

⸱

23 december 2016

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om een resolutie van bijna base-paar te bereiken van eiwit-DNA-interacties. Dit wordt verkregen door exonuclease-behandeling van DNA-fragmenten die selectief zijn verrijkt door chromatine-immunoprecipitatie (ChIP-exo) gevolgd door high-throughput sequencing.

Samenvatting

Chromatine immunoprecipitatie (chip) is een onmisbaar instrument op het gebied van de epigenetica en genregulatie dat specifieke eiwit-DNA-interacties isolaten. ChIP gekoppeld met high throughput sequencing (ChIP-seq) wordt vaak gebruikt om de genomische locatie van eiwitten die interageren met chromatine bepalen. Echter, ChIP-seq belemmerd door een relatief lage resolutie in kaart brengen van enkele honderden basenparen en hoge achtergrond signaal. De chip-exo-methode is een verfijnde versie van de chip-seq die substantieel verbetert zowel de resolutie en lawaai. Het belangrijkste verschil van de ChIP-exo methode is het opnemen van lambda exonuclease vertering in de bibliotheek bereiding workflow effectief footprint links en rechts 5 'DNA grenzen van het eiwit-DNA verknoping plaats. De chip-exo bibliotheken worden vervolgens onderworpen aan high throughput sequentiebepaling. De resulterende gegevens kunnen worden benut om unieke en ultra-hoge resolutie inzicht te verschaffen in de functionele organisatie of het genoom. Hier beschrijven we de ChIP-exo methode die wij hebben geoptimaliseerd en gestroomlijnd voor zoogdierlijke systemen en de volgende generatie sequencing-door-synthese platform.

Inleiding

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtige methode om mechanismen van genregulatie bestuderen door het selectief verrijken van DNA-fragmenten die interageren met een bepaald eiwit in levende cellen. Detectiemethoden-ChIP verrijkte DNA-fragmenten ontwikkeld als technologie verbetert, van detectie van een enkele locus (standaard ChIP-qPCR) hybridisatie aan oligonucleotide microarrays (ChIP-chip) bij hoge doorvoer sequentiebepaling (ChIP-seq) 1. Hoewel ChIP-seq wijdverbreide toepassing, chromatine heterogeniteit en niet-specifieke DNA-interacties heeft gezien hebben kwaliteit van de gegevens leidt tot valse positieven en onnauwkeurig mapping belemmerd. Om deze beperkingen te omzeilen, Dr. Frank Pugh ontwikkelde de chip-exo-methode 2. De meest opvallende eigenschap van ChIP-exo is verbanden met een 5 'naar 3' exonuclease, effectief footprinting transcriptiefactor bindende plaatsen. Hierdoor de ChIP-exo methode produceert een grotere resolutie, groter dynamisch bereik van detection, en een lager achtergrondgeluid.

Hoewel ChIP-exo is meer technisch uitdagende te beheersen dan ChIP-seq, wordt het op grote schaal aangenomen studies gericht zijn op unieke ultra high-resolution inzichten te krijgen met behulp van diverse biologische systemen 3-8. Inderdaad, ChIP-exo met succes toegepast op bacteriën, gist, muis, rat en humane cellen. Als bewijs van het principe werd ChIP-exo oorspronkelijk gebruikt om de precieze bindingsmotief identificeren een handvol gist transcriptiefactoren 2. De techniek werd ook gebruikt in gist om de organisatie van de transcriptie pre-initiatie complex te bestuderen, en subnucleosomal structuur van verschillende histonen 9,10 ontcijferen. Meer recent, leveraged we ChIP-exo naar aangrenzende TFIIB en Pol II bindend gebeurtenissen in de menselijke initiatiefnemers op te lossen, en toonde aan dat op grote schaal uiteenlopende transcriptie komt voort uit verschillende initiatie complexen 11.

De workflow hier gepresenteerde is geoptimaliseerd en streamlined voor zoogdierlijke ChIP-exo (figuur 1). Eerst worden levend primaire of weefselkweek cellen behandeld met formaldehyde te bewaren in vivo eiwit-DNA-interacties via een covalente verknoping. De cellen worden gelyseerd en chromatine afgeschoven naar ~ 100-500 basenparen grootte fragmenten. ChIP vervolgens selectief verrijkt voor DNA-fragmenten verknoopt aan het eiwit van belang. Op dit punt worden ChIP-seq bibliotheken typisch bereid die inherent de detectieresolutie de gemiddelde fragmentgrootte van enkele honderden basenparen beperkt. Echter, ChIP-exo overwint deze beperking door bijsnijden links en rechts 5 'DNA grenzen van het eiwit-DNA verknoping plaats met lambda exonuclease. Sequencing bibliotheken worden vervolgens geconstrueerd uit DNA exonuclease digestie zoals hieronder beschreven. De resulterende geneste 5 'grenzen vormen een in vivo footprint van de eiwit-DNA-interactie (Figuur 1, stap 14), en worden gedetecteerd door sequenering. although de chip-exo methode is meer betrokken dan ChIP-seq, overgangen tussen de meeste stappen vereist eenvoudige kraal wassen, welk monster verlies en experimentele variabiliteit minimaliseert. Belangrijk is, aangezien ChIP-exo is een verfijnde versie van ChIP-seq, een monster dat is succesvol met chip-seq moet ook succesvol met chip-exo zijn.

De in vivo footprinting van eiwit-DNA interacties met chip-exo resultaten in een fundamenteel verschillende datastructuur van ChIP-seq. Hoewel gemeenschappelijke ChIP-seq bellers kunnen worden toegepast op ChIP-exo data, om de meest nauwkeurige piek gesprekken te verkrijgen raden wij bioinformatica instrumenten die specifiek ontworpen met de unieke structuur van de chip-exo gegevens in het achterhoofd. Deze omvatten Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla en ExoProfiler 12-15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Double gedestilleerd H 2 O of graad gelijkwaardig moleculaire wordt aanbevolen voor alle buffers en reacties mixen.

Dag 0: Materiaal Voorbereiding en Cell Harvest

1. Buffer Voorbereiding

  1. Bereid Lysis Buffers 1-3 (tabellen 1-3) en voeg 100 ul compleet proteaseremmer voorraad (CPI) om 50 ml van elke buffer vlak voor gebruik. Bereid CPI voorraad door het oplossen van een tablet in 1 ml moleculair-biologische kwaliteit H 2 O.
  2. Bereid ChIP Buffers (tabellen 4-7). Voeg 100 ul CPI voorraad tot 50 ml van het blokkeren en RIPA buffers. Do CPI niet toe te voegen aan Tris en ChIP Elutiebuffers.

2. temperen Adapter Oligonucleotiden

Opmerking: Specifieke oligonucleotide sequenties kunnen worden gevonden in de Aanvullende informatie Section.

  1. Bereid Adapter gloeien mixen (tabellen 8-9). Vortex te mengen en in het kortdraaien buizen inhoud verzamelen. Aliquot 100 ul van elk mengsel in 0,5 ml buizen.
  2. Hybridiseer de oligonucleotiden door het uitvoeren van het programma (Tabel 10) in de thermocycler.
    WINKEL oligonucleotiden bij -80 ° C.

3. In vivo chromatine verknoping met formaldehyde

OPMERKING: Bij een typisch experiment ChIP dient uitgangsmateriaal ongeveer 50 miljoen cellen bevatten.

  1. Voeg verse 37% methanol-vrij formaldehyde voorraadoplossing fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gewassen celkweek tot een uiteindelijke concentratie van 1% (v / v), meng en laat op kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Voeg bijvoorbeeld wij doorgaans 1,4 ml 37% methanol-vrij formaldehyde aan cellen in 50 ml PBS kamertemperatuur. Vermijd ook formaldehyde vernetting media omdat eiwitten in de media enige formaline zal doven.
  2. Quench verknopingsreactie door het toevoegen van 2,5 M glycinee een eindconcentratie van 125 mM. Meng grondig.
  3. Transfer cellen 50 ml buis op ijs. Spin cellen gedurende 5 min bij 1000 xg bij 4 ° C. Giet supernatant.
  4. Voeg 1 ml ijskoude 1x PBS naar cel pellet en resuspendeer door pipetteren. Transfer naar 1,5 ml buis.
  5. Spin cellen gedurende 3 min bij 2000 xg bij 4 ° C. Zuig supernatant.
  6. Onmiddellijk knipperen bevriezen celpellets in 1,5 ml buizen met vloeibare stikstof. Bewaar bij -80 ° C. Verknoopte cellen onbeperkt houdbaar bij -80 ° C.

Dag 1: Cell Lysis sonicatie en ChIP

4. Cel Lysis

OPMERKING: Bij alle cellysis secties, moet de monsters op ijs of bij 4 ° C worden gehouden verknopen omkering minimaliseren.

  1. Kort ontdooien verknoopt celpellet. Grondig resuspendeer elke pellet in 0,5 ml lysisbuffer 1 en gecombineerd met 4,5 ml Lysis Buffer 1 in een 15 ml polystyreen buis.
  2. Rots buizen gedurende 10 minuten bij 4 ° Cvoor op een schommelende platform. Spin gedurende 4 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C. Giet supernatant.
  3. Grondig resuspendeer elke pellet in 0,5 ml Lysis Buffer 2 en voeg 4,5 ml Lysis Buffer 2 keer opnieuw gesuspendeerd.
  4. Rock gedurende 5 minuten bij 4 ° C op een schommelende platform. Centrifugeren gedurende 5 min bij 2000 xg bij 4 ° C. Giet supernatant en voorzichtig tik teveel op keukenpapier.
  5. Grondig resuspendeer elke pellet in 0,5 ml Lysis Buffer 3 en voeg 1 ml Lysis Buffer 3 keer opnieuw gesuspendeerd. Houd nucleaire lysaten op ijs en onmiddellijk naar sonicatie.

5. ultrasoonapparaat van Nuclear Lysaten

LET OP: Tijdens al sonicatie secties, MOET de monsters op ijs worden gehouden om verknopen omkering een minimum te beperken. Het specifieke model van ultrasoonapparaat gebruikt in combinatie met de onderstaande protocol kunnen worden gevonden in de tabel van Materialen. Details over specifieke gebruik en richtlijnen voor andere instrumenten ultrasoonapparaat kan worden gevonden in de Aanvullende informatie Section.

  1. place resonantie adapters in 15 ml polystyreen buisjes met nucleaire extracten (de metalen balk niet de wand van de buis raken).
  2. Ultrasone trillingen nucleaire lysaten in een ijskoud waterbad gedurende 2 x 15 min sessies met 30 sec ON / OFF 30 sec op de middellange macht. Slechts ultrasone trillingen twee 15 ml buisjes tegelijk. Deze instellingen werken op een groot aantal cellijnen en primaire celtypen, maar verdere optimalisatie kan nodig zijn als chromatine afschuiving onvolledig is.
  3. Om sonicatie, de overdracht 2 x 10 pi monsters controleren vanuit lysaat in 1,5 ml buizen.
    1. Om crosslinks te keren, dat de nummer 10 pl aliquot van 10 pi TE-RNase A en 0,2 ul Proteinase K. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 4 pi 6x xyleen DNA kleurstof.
    2. Om crosslinks behouden, combineren de tweede 10 pi aliquot met 2 pl 6x xyleen DNA kleurstof.
    3. Run beide monsters op een 1,5% agarosegel bij 140 V gedurende ongeveer 30 - 45 min tot het broomfenol kleurstof in de ladder is ¾ van de weg naar beneden de gel.
  4. Indien sonicatie succesvol was (de meeste DNA-fragmenten gekliefd tot 100-500 bp), gesoniceerd lysaten overdracht naar 2 ml buisjes die 150 ui 10% Triton X-100. Vortex te mengen.
  5. Om onoplosbare chromatine en brokstukken te pelleteren, rotatie gesoniceerd nucleaire lysaat gedurende 10 minuten bij 20.000 xg bij 4 ° C.
  6. Transfer supernatans naar een nieuwe 2 ml buis. Ga onmiddellijk chip of winkel monsters bij -80 ° C voor onbepaalde tijd. Gesoniceerd fragmenten niet worden ingevroren en meer dan eens ontdooid.

6. Koppeling Antibody naar Beads

LET OP: Nooit vortex of bevriezen / ontdooien magnetische korrels, aangezien zij zullen verbrijzelen en het verhogen van de achtergrond signaal.

  1. Na grondig mengen voorraad, monster Y ul kraal slurry in 1,5 ml buis, waarbij Y = 1,1 x 2,5 pi x (aantal ChIP monsters). Bindingsvermogen van 2,5 ul kraal suspensie tot 13 ug IgG. Was samengevoegd kralen 3x met 1 ml blokkerenBuffer.
  2. Voor meer consistente aliquotting kralen na het wassen, resuspendeer kralen in 10x originele slurry volume (25 pl / chip) met Blocking Buffer. Aliquot 25 ul per chip monster in 1,5 ml buizen.
  3. Voeg 5-10 ug antilichaam tegen overeenkomstige portie resuspendeer kralen. Breng uiteindelijke volume tot 250 ul met Blocking Buffer. Incubeer de monsters 4 uur (alternatief nachts voor 16 uur) op een draaiend platform bij 4 ° C.
  4. Zuig supernatant. Om niet-gebonden of overtollige antilichaam te verwijderen, wassen kralen eenmaal met 1 ml Blocking Buffer.
  5. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, onmiddellijk aan toevoegen 50 miljoen mobiele equivalenten gesoniceerd extracten (~ 1,6 ml) aan antilichaam: kraal conjugaten. Als gesoniceerd extracten zijn nog niet klaar, resuspendeer kralen in 100 pi Blocking Buffer tot ze klaar zijn. Het is cruciaal om nooit laten de parels drogen.

7. Chromatine Immunoprecipitatie (chip)

  1. Voor elk ChIP monster combineren 1,5 ml ultrasone trillingend extracten met antilichaam: kraal conjugaten in 1,5 ml of 2 ml buizen.
  2. Incubeer buizen op een mini-buis rotator overnacht (ongeveer 16 uur) op de snelheid instelling van 9 bij 4 ° C. Controleer na een paar minuten om ervoor te zorgen monsters worden niet lekt en naar behoren te mengen.

Dag 2: Chip wast en On-hars enzymatische reacties

8. ChIP Washes

OPMERKING: Om kruisbesmetting te minimaliseren, kort draaien buizen tussen elke wasbeurt. Voor de eerste aspiratie, veranderen tips tussen elk monster. Tijdens daaropvolgende wassen, kan hetzelfde punt worden gebruikt zolang het niet de kralen niet raakte. Zie Aanvullende informatie Afdeling voor aanwijzingen over de juiste chip wassen.

  1. Heel in het kort draaien buizen met behulp van een microcentrifuge (~ 3 sec bij 500 xg) om vloeistof te verzamelen in caps en plaats op de magnetische rek voor 1 min. Hoewel nog steeds op de magnetische rek, aspireren extract.
  2. Voeg 0,75 ml RIPA-buffer aan elke buis. Verwijder buizen uit magnetische reken keer herhaaldelijk te mengen. Vervang de buizen op magnetische rek en zuig supernatant. Herhaal 7x.
  3. Voeg 0,75 ml 10 mM Tris HCl (pH 7,5) aan elke buis. Verwijder buizen uit magnetische rek en omkeren een paar keer om te mengen. Vervang de buizen op magnetische rek en zuig supernatant. Herhaal 2x.
  4. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, overgaan tot polijsten.
    Let op: Na elke incubatie reactie in secties 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 en 15.3, spin-buizen kort en plaats tegen magnetische rek voor 1 min en zuig supernatant. 2x wassen met 0,75 ml RIPA buffer en 2 x met 0,75 ml Tris-HCl (pH 7,5).

9. Polijsten Reaction

  1. Vul Polijsten master mix berekeningen (tabel 11). Maak Polijsten mix in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Direct na de laatste chip wasbeurt wordt afgezogen, voeg 50 ul van Polijsten mix aan elk monster hars, terwijl nog steeds op de magnetische rek. Incubeer de monsters gedurende 30 min bij 3 xgbij 30 C in een thermomixer.
  3. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, zoals beschreven in de notitie na paragraaf 8.4, ga dan naar A-tailing.

10. A-tailing Reaction

  1. Vul-A tailing master mix berekeningen (tabel 12). Make A-tailing mix in een 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Onmiddellijk na polijsten deel, voeg 50 ul van A-tailing mengsel aan elk monster hars terwijl op de magnetische rek. Incubeer de monsters gedurende 30 min bij 3 x g bij 37 ° C in een thermomixer.
  3. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, zoals beschreven in de notitie na paragraaf 8.4, ga dan naar P7 Adapter Ligatie.

11. Adapter P7 ligatiereactie

  1. Vul Ligatie master mix berekeningen (tabel 13). Maak ligatiemengsel in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Onmiddellijk na A-tailing sectie, voeg 48 ul P7 Ligation master mix en 2 pl van een andere adapter Index to elk monster hars, terwijl nog steeds op de magnetische rek. Incubeer monsters gedurende 2 uur bij 3 x g bij 25 ° C in een thermomixer.
    Opmerking: Het gebruik van verschillende indexen voor elk monster kunnen meer monsters te sequeneren in een stroomcel.
  3. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, zoals beschreven in de notitie na paragraaf 8.4, ga dan naar Φ-29 Nick Repair.

12. Phi-29 Nick Repair Reaction

  1. Vul Φ-29 master mix berekeningen (tabel 14). Maak Φ 29-mix in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Direct na P7 Ligation sectie, voeg 50 ul Φ-29 mengsel aan elk monster hars terwijl op de magnetische rek. Incubeer monsters gedurende 20 min bij 3 x g bij 30 ° C in een thermomixer.
  3. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, zoals beschreven in de notitie na paragraaf 8.4, ga dan naar Kinase reactie.

13. Kinase Reactie

  1. Vul Kinase master mix berekeningen ( Tabel 15). Maak Kinase mengen in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Direct na Φ 29-sectie, voeg 50 pl kinase mengen om elk monster hars terwijl op de magnetische rek. Incubeer monsters gedurende 20 min bij 3 x g bij 37 ° C in een thermomixer.
  3. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, zoals beschreven in de notitie na paragraaf 8.4, ga dan naar Lambda Exonuclease reactie.

14. Lambda Exonuclease Reaction

  1. Vul Lambda exonuclease master mix berekeningen (tabel 16). Maak Lambda Exonuclease mengen in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Onmiddellijk na Kinase sectie, voeg 50 ul van Lambda exonuclease mengen om elk monster hars, terwijl nog steeds op de magnetische rek. Incubeer de monsters gedurende 30 min bij 3 x g bij 37 ° C in een thermomixer.
  3. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, zoals beschreven in de notitie na paragraaf 8.4, ga dan naar RecJ f reactie.

15. RecJ fnuclease Reaction

  1. Vul RecJ f master mix berekeningen (tabel 17). Maak RecJ f mix in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Onmiddellijk na Lambda exonuclease sectie, voeg 50 ul van RecJ f mix aan elk monster hars, terwijl nog steeds op de magnetische rek. Incubeer de monsters gedurende 30 min bij 3 x g bij 37 ° C in een thermomixer.
  3. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt, zoals beschreven in de notitie na paragraaf 8.4, ga dan naar ChIP Elutie.

16. Elutie en Crosslink Reversal

  1. Bereid Master Mix: aantal monsters x 1,1 x (200 gl chip Elution Buffer + 1 gl 20 mg / ml Proteinase K) in 1,5 ml buis. Voeg 200 ul ChIP elutiebuffer + Proteinase K master mix aan elk monster hars.
  2. Incubeer de monsters overnacht (ongeveer 16 uur) bij 3 x g bij 65 ° C in een thermomixer met een verwarmd deksel om condensatie te voorkomen.

Dag 3: DNA Extraction en adapter Ligatie

17. Elutie en Crosslink Reversal (vervolg)

  1. Na een nacht incubatie bij 65 ° C, kort draaien monsters condensaat te verzamelen. Leg monsters op magnetische rek voor 1 min.
  2. Transfer 200 ul supernatant nieuwe 1,5 ml buis die 200 pl TE-buffer (pH 7,5).

18. Fenol chloroform isoamylalcohol (PCIAA) Extraction

  1. Voeg 400 ul fenol chloroform isoamylalcohol aan elk monster. Vortex mengen gedurende 20 seconden.
  2. Centrifugeer 10 minuten bij 20.000 xg bij kamertemperatuur (RT). Breng voorzichtig 325 ul van de bovenste waterige laag naar een nieuwe buis.
    Let op: Zorg ervoor dat u een van de organische (onderste laag) over te dragen naar de nieuwe buis.
  3. Voeg 1/10 volume 3 M NaOAc (pH 5,5) en 1 pi 20 mg / ml glycogeen aan elk monster. Voor meerdere monsters, bereiden een master mix.
  4. Voeg 3 volumes ijskoude 100% ethanol aan elk monster. draaikolkmengen. Incubeer gedurende 15 minuten bij -80 ° C.
  5. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 20.000 xg bij 4 ° C. decanteren zorgvuldig supernatant, zorg ervoor dat de pellet niet storen.
  6. Zachtjes voeg 500 ul vers gemaakt ijskoud 70% ethanol, en zorg ervoor dat de pellet niet storen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 20.000 xg bij 4 ° C. Voorzichtig decanteren supernatant.
  7. Droog de pellet gedurende ongeveer 20 minuten (of totdat droog) in een snelheid vacuüm bij 45 ° C.
    LET OP: Dit is een pauze punt in het protocol. Droge pellets DNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C.
  8. Resuspendeer pellets in 10 ul DDH 2 O. Pipet herhaaldelijk over het gebied waarin het DNA gepelleteerd, terwijl de gedroogde pellet niet zichtbaar.
  9. Transfer 10 pi van elk monster om een ​​nieuwe 0,3 ml PCR buis of 8-rack, afhankelijk van het aantal monsters.

19. P7 primerverlengingsreactie

  1. Vul P7 Primer Extension master mix berekeningen (tabel 18). Maak Uitbreiding mengen in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Voeg 10 ul van Extension mix (minus Φ-polymerase 29) aan elk 10 pi monster. Pipet te mengen.
  3. Run monsters in de thermocycler met het programma (tabel 19) te hybridiseren primer aan de matrijs tot 30 ° C "hold" stap.
  4. Voeg 1 ui Φ-29 polymerase tijdens de 30 ˚C "hold" stap in het programma. Pipet te mengen. Hervat de rest van het programma (tabel 19).

20. A-tailing Reaction

  1. Vul-A tailing master mix berekeningen (tabel 20). Make A-tailing mix in een 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Voeg 10 ul van A-tailing mengsel aan elk monster. Pipet te mengen.
  3. In de thermocycler, incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 ° C, en vervolgens warmte geïnactiveerd gedurende 20 minuten bij 75 ° C.

21. Adapter P5 ligatiereactie

  1. Fill uit P5 adapter Ligatie master mix berekeningen (tabel 21). Maak ligatiemengsel in 1,5 ml buis op ijs. Pipet te mengen.
  2. Voeg 20 ul van P5 ligatiemengsel aan elk monster. Pipet te mengen.
  3. In de thermocycler incuberen monsters gedurende 2 uur bij 25 ° C.

22. Bead Clean-up

Let op: Zie Materialen sectie voor fabrikant details over kraal opruimen.

  1. Transfer elk 50 ul monster naar een nieuwe 1,5 ml buis.
  2. Resuspendeer opruimen kralen op een mini-buis rotator bij snelheidsinstelling van 15 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Laat je niet kralen bezinken voordat pipetteren.
  3. Voeg 60 ul ruimen kralen monsters (1,2: 1 opruimen kralen monster verhouding is kritisch voor DNA dat korter is dan 200 basenparen te verwijderen). Pipet te mengen gedurende 20 seconden.
  4. Resuspendeer opruimen kralen op een mini-buis rotator bij snelheidsinstelling van 15 gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Kort draaien buizen.
  5. Plaats buisjes op de magnetische rek voor 1 min.Pipet uit en gooi het supernatant.
    LET OP: Gebruik GEEN vacuümaspiratie in dit deel, omdat het zal zuigen de clean-up kralen.
  6. Voeg 400 ul vers bereide RT 70% ethanol aan elk monster terwijl ze op magnetische rek. Niet mengen. Zuig supernatant. Herhaal 2x.
  7. Droog de sanering kralen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De kleur van de kralen donker worden tot lichtbruin en zeer kleine scheurtjes zichtbaar in de harspellet wanneer korrels droog.
  8. DNA elueren, voeg 40 ul 10 mM Tris (pH 7,5). Pipetteer grondig mengen gedurende 20 seconden.
  9. Plaats de monsters op de magnetische rek voor 1 min. Langzaam pipet en breng 36 pl eluaat direct naar 0,3 ml PCR buizen.
  10. Direct doorgaan naar PCR-reactie of op te slaan eluaten bij -20 ° C.

Dag 4: PCR en Gel Analyse

23. PCR

  1. Vul PCR master mix berekeningen (tabel 22). Maak PCR mix. Pipet heel voorzichtig te mengen om te voorkomenbubbels.
  2. Voeg 14 ul van de PCR-mix aan elk 36 pi DNA-monster. Pipet te mengen. Houd de monsters op ijs pas klaar in Thermocycler te zetten.
  3. Voor de positieve controle PCR, onder een eerder bereide bibliotheek. Voor de negatieve PCR-controle, inclusief water. Run monsters in de thermocycler programma met PCR (Tabel 23).

24. Gel Voorbereiding, DNA Excision, en visualisatie

  1. Grondig te reinigen en spoel een passende omvang geldoos met gedemineraliseerd water. Bereid een 1,5% agarosegel (bevattende 0,5 mg / ml ethidiumbromide) met dikke, brede putjes die 60 pl kam kan bevatten.
    LET OP: ethidiumbromide (EtBr) is kankerverwekkend en moet met zorg worden behandeld.
  2. Spin down PCR monsterbuizen kort om condensatie te verzamelen.
  3. Voeg 1/5 volume van 6x xyleen DNA kleurstof gecombineerd monster. Niet gebruiken broomfenolblauw in DNA kleurstof aangezien migreert op dezelfde locatie als het monster DNA.
  4. Laad gehele monster into elk putje, bij voorkeur met lege putten in tussen de monsters.
    Noot: Bibliotheken met dezelfde indexen moet niet worden uitgevoerd in dezelfde gel.
  5. Load 7 pl 100 bp ladder aan weerszijden van monsters. Run gel bij 140 V gedurende ongeveer 30-45 min tot broomfenol kleurstof in ladder is ¾ weg naar beneden de gel.
  6. Beeld en visualiseren gel op een transilluminator op een lage UV-instelling. Uitsnijden secties van agarose bevattende DNA-fragmenten 200-500 bp. Wees zeer voorzichtig om te voorkomen dat het uitsnijden van adapter dimeer band die draait op 125 bp.
  7. Plaats elk uitgesneden gelplak in een 15 ml buis. Record nettogewicht van elke gel slice. Schrijf dit gewicht rechtstreeks op de buis.
  8. Afbeelding, opslaan en annoteren uitgesneden gel om te bevestigen juiste maat bereik geselecteerd.

25. Gel Purification

  1. Zuiver DNA uit uitgesneden gel slice volgens de instructies van de fabrikant, met de volgende wijzigingen.
  2. Los de gel slice door schommelenbij RT op schommelen platform. Het zal ongeveer 20 minuten duren om op te lossen.
  3. Om zeer gezuiverd DNA te verkrijgen, was kolommen met 0,5 ml buffer QG nadat opgelost gel met kolom gepasseerd.
  4. Na Buffer PE wassen, laat kolommen zitten bij kamertemperatuur gedurende 2-5 min. Spin gedurende 1 min bij 13.000 x g bij kamertemperatuur.
  5. Om ruimte voor PCR reactie master mix, elueren monsters met 40 ul EB buffer toe in een nieuwe 1,5 ml buis.

26. DNA kwantificering

  1. Bereid monsters volgens instructies van de fabrikant (Tabel 24). Maatregel monsters in bepaalde instrument met optische buizen.
  2. Zodra ChIP-exo bibliotheken worden gekwantificeerd, in te dienen voor sequencing op een platform dat sequencing-door-synthese chemie 16 die compatibel zijn met DNA-adapters in dit protocol is gebruikt.
    OPMERKING: Typisch 2 pl monster voldoende kwantificeren, maar kan noodzakelijk zijn als monsterconcentratie lager. DNA levert typischely bereik tussen 50 en 200 ng.
  3. Na kwantificeren, monsters bewaar bij -20 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De volgende cijfers illustreren representatieve resultaten van de chip-exo-protocol hier gepresenteerd. In tegenstelling tot traditionele ChIP-seq methodieken enkele enzymatische stappen, ChIP-exo vereist elf sequentieel, afhankelijk enzymatische reacties (figuur 1). Zo moet zorg bij elke stap worden gezorgd dat elke reactiecomponent wordt toegevoegd aan zijn respectieve reactiemengsel master mix. We raden aan het genereren van een formulaic spreadsheet op basis van de r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren een functioneel genomische protocol om de precieze bindende locatie voor chromatine interactie eiwitten in een onbevooroordeelde, genoom-brede wijze op in de buurt van basenparen resolutie te bepalen. De meest kritische stap om in de buurt van basenparen in kaart brengen van de resolutie te bereiken is de exonuclease behandeling van de ChIP verrijkte DNA terwijl de immunoprecipitaat op de magnetische hars blijft. Ogenschijnlijk, kon eiwitcomplexen potentieel te blokkeren in vivo footprintin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken het Venters Lab en leden van de Afdeling Moleculaire Fysiologie en Biofysica voor nuttige discussies. Speciale dank aan Frank Pugh voor zijn begeleiding, mentoring en vele inzichtelijke discussies over de nuances van ChIP-exo terwijl ik een post-doctoraal fellow was in zijn laboratorium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
37% formaldehyde, methanol vrij, 10 x 10 ml ampullenThermoFisher Scientific28908Sectie 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI)Roche Life Science11873580001Secties 4, 8
Bioruptor sonicatorDiagenodeUCD200Sectie 5
15 ml polystyreenbuizenBD Falcon352095Sectie 5
MagSepharose Protein G Xtra beadsGE Healthcare28-9670-66Sectie 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetisch RekInvitrogen12321DSecties 6-17, 22
Mini-Tube RotatorFisher Scientific05-450-127Secties 7, 22
T4 DNA PolymeraseNew England BioLabsM0203Sectie 9
DNA Polymerase I, KlenowNew England BioLabsM0210Sectie 9
10x NEBuffer 2 (10x Reactie Buffer 2)New England BioLabsB7002Secties 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer CEppendorf5382Secties 9-16
ATPRoche Life Science010419979001Secties 9, 11, 13
dNTPsNew England BioLabsN0447Secties 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide KinaseNew England BioLabsM0201Secties 9, 13
dATPNew England BioLabsN0440Secties 10, 20
Klenow 3'-5' Exo MinusNew England BioLabsM0212Secties 10, 20
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202Secties 11, 21
Φ-29 DNA PolymeraseNew England BioLabsM0269Secties 12, 19
10x Φ-29 BufferNew England BioLabsB0269Secties 12, 19
Lambda ExonucleaseNew England BioLabsM0262Sectie 14
10x Lambda BufferNew England BioLabsB0262Sectie 14
RecJf ExonucleaseNew England BioLabsM0264Sectie 15
Proteinase KRoche Life Science03115828001Sectie 16
GlycogenRoche Life Science010901393001Sectie 18
10x T4 Ligase BufferNew England BioLabsB0202Sectie 21
AMPure XP (opruiming) beadsBeckman CoulterA63881Sectie 22
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNew England BioLabsM0493Sectie 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)New England BioLabsB9027Sectie 23
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Sectie 25
Qubit FluorometerInvitrogenQ33216Sectie 26
Optical Clear Qubit tubesInvitrogenQ32856Sectie 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kitInvitrogenQ32851Sectie 26

Referenties

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035(2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339(2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lambda exonuclease digestiechromatine immunoprecipitatiehigh throughput sequencingsonicatieconditiesincubatie in magnetisch rekRecJf nuclease reactieBioanalyzer beoordelingtranscriptionele startplaatsen

Gerelateerde artikelen