Methodenartikel

Engineering Moleculaire herkenning met Bio-mimetische Polymers op enkelwandige koolstof nanobuisjes

DOI:

10.3791/55030

⸱

10 januari 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California Berkeley, 2California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), University of California Berkeley

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor het ontwerpen van de coronafase van nabij-infrarood fluorescente enkelwandige koolstofnanobuizen (SWNT's) met behulp van amfifiele polymeren en DNA om sensoren te ontwikkelen voor moleculaire doelen zonder bekende herkenningselementen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Halfgeleidende enkelwandige koolstofnanobuizen (SWNT's) zijn een klasse van optisch actieve nanomaterialen die in het nabije infrarood fluoresceren, samenvallend met het optische venster waar biologische monsters het meest transparant zijn. Hier schetsen we technieken om amfifiele polymeren en polynucleïnezuren te adsorberen op het oppervlak van SWNT's om hun coronafasen te ontwerpen en nieuwe moleculaire sensoren voor kleine moleculen en eiwitten te creëren. Deze functionele SWNT-sensoren zijn zowel biocompatibel als stabiel. Polymeren worden geadsorbeerd op het nanobuisoppervlak, hetzij door directe sonorisatie van SWNT's en polymeer, hetzij door het ophangen van SWNT's met behulp van een oppervlakteactieve stof gevolgd door dialyse met polymeer. De fluorescentie-emissie, stabiliteit en respons van deze sensoren op doel-analyten worden bevestigd met behulp van absorptie- en nabij-infrarood fluorescentiespectroscopie. Verder demonstreren we het oppervlakte-immobilisatie van de sensoren op glazen platen om single-molecuulfluorescentiemicroscopie mogelijk te maken om polymeeradsorptie en analytbindingskinematica te karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkelwandige koolstof nanobuizen (SWNT) zijn atomair dunne lagen koolstofatomen gerold in lange, dunne cilinders die unieke elektronische en optische eigenschappen. 1 Dergelijke eigenschappen zijn een band-gap productie van nabij-infrarood (NIR) fluorescentie-emissie via exciton recombinatie dat zeer gevoelig is voor de lokale omgeving. Het nabij infrarood emissie van SWNT valt in het nabije infrarood venster waarin de indringdiepte van licht maximaal is voor biologisch weefsel. 2,3 Daarnaast SWNTs vertonen een aantal unieke kenmerken atypische in tegenstelling tot organische fluoroforen: SWNT vertonen een grote Stokes verschuiving, niet photobleach en niet knipperen. 4 Onlangs exploitatie van deze kenmerken heeft geleid tot de ontwikkeling van een assortiment van nieuwe moleculaire sensoren met toepassingen in de biologie. 5,6 Ongewijzigde echter SWNTs zijn niet oplosbaar in water, en het verkrijgen van suspensies van de individuele SWNTs kan een uitdaging zijn. 7,8 Bundling en aggregatie van SWNTs in oplossing kunnen hun band-gap fluorescentie, 2 verdoezelen waardoor ze ongeschikt zijn voor sensing-toepassingen.

Dispergeermiddelen individuele koolstof nanobuisjes in een waterige oplossing vereist het wijzigen van hun oppervlak te hydrofobiciteit gedreven aggregatie te voorkomen. 9 Terwijl covalente modificatie SWNT kunnen wateroplosbaar, 10 en geven specifieke binding chemie, defectlocaties in de SWNT rooster verminderen of verminderen hun fluorescentie-emissie. In plaats daarvan kunnen SWNT functionalisering worden bereikt door gebruik surfactanten, lipiden, polymeren en DNA 9,11 - 13 die adsorberen aan de nanobuis oppervlak met hydrofobe en pi-pi interacties stapelen. De resulterende chemische omgeving rond het oppervlak gefunctionaliseerde SWNT's wordt aangeduid als de corona fase. Verstoringen van de corona fase kan een grote impact hebben op excitonen reizen op de nanobuis oppervlak, waardoor modulaties tot SWNT fluorescence emissie. Hierdoor gevoelige relatie tussen de corona fase en SWNT fluorescentie die kan worden benut om nieuwe moleculaire detecterende sensoren door specifieke binding modaliteiten op het grote oppervlak van SWNT. Verstoringen de SWNT corona fase na binding analyt kan leiden tot veranderingen in de lokale omgeving diëlektrische, ladingsoverdracht of invoeren roosterfouten, die allemaal kunnen de fluorescentie-emissie van de SWNT moduleren om te dienen als een signaaltransductie mechanisme. 14 Deze werkwijze wordt gebruikt bij de ontwikkeling van nieuwe fluorescerende sensoren voor de detectie van vele verschillende klassen van moleculen zoals DNA, 15,16 glucose 17 en kleine moleculen zoals ATP, 18 reactieve zuurstofdeeltjes 19 en stikstofoxide. 20,21 Echter, deze methoden beperkt doordat ze vertrouwen op het bestaan van een bekend bindend modaliteit voor het doelanalyt.

Onlangs, een meer algemene appvoorn het ontwerpen fluorescerende sensoren is ontwikkeld met SWNT niet- covalent gefunctionaliseerd met amfifiele heteropolymeren, fosfolipiden en polynucleïnezuren. Deze moleculen adsorberen aan koolstof nanobuis oppervlakken zeer stabiele suspensies van de individuele SWNTs 22 produceren - 25 met unieke corona fasen die specifiek proteïnen 26,27 of kleine moleculen, met inbegrip van de neurotransmitter dopamine kan binden. 28-30 Techniek de corona fase SWNTs en specifiek binden doelanalyten dispergeren wordt genoemd corona fase moleculaire herkenning (CoPhMoRe). 28 Het kleine formaat, lage toxiciteit, hoge stabiliteit en unbleaching nabij infrarood fluorescentie van CoPhMoRe SWNT sensoren maken ze uitstekende kandidaten voor in vivo sensing voor langere tijdsopgeloste metingen. 6 Recent werk heeft hun toepassingen in plantenweefsels getoond voor optische detectie van reactieve stikstof en zuurstof soorten. 31Een bijzonder interessante toepassing voor CoPhMoRe SWNT sensoren bestaat op label vrij detecteren van neurotransmitters zoals dopamine in vivo, waar andere technieken, zoals elektrochemische detectie of immunohistochemie, lijdt aan een gebrek aan ruimtelijke resolutie, temporele resolutie en specificiteit.

Het ontwerpen en het ontdekken CoPhMoRe SWNT sensoren tot dusver beperkt door de grootte en chemische diversiteit van de bibliotheek dispergeermiddel, beperkt de kans op het vinden van een sensor voor een bepaald doel. Tot op heden hebben onderzoekers alleen oppervlakkig beschikbare geconjugeerd, co-block, biologische en biomimetische polymeren die als functioneel actieve dispergeermiddelen voor SWNT sensoren kan dienen. Hier presenteren we verschillende methoden voor zowel het verspreiden SWNTs en karakteriseren van hun fluorescentie voor high throughput screening en voor alleenstaande SWNT sensor analyse. In het bijzonder, we een overzicht van de procedure voor het coaten van SWNTs met polynucleïnezuur oligomers met behulp van directe sonicatie alsmede hoe SWNT met amfifiele polymeren te functionaliseren door middel van oppervlakte-actieve uitwisseling door middel van dialyse. Wij gebruiken (GT) 15 -DNA en polyethyleenglycol gefunctionaliseerd met rhodamine-isothiocyanaat (RITC-PEG-RITC) als voorbeeld. We demonstreren het gebruik van (GT) 15 -DNA SWNT als CoPhMoRe sensor voor de detectie van dopamine. Tenslotte beschrijven we procedures voor het uitvoeren van individuele moleculen sensormetingen, die kan worden gebruikt voor de karakterisering of single molecule detectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Nanomaterialen kunnen extra risico's hebben in vergelijking met hun stortgoed tegenhanger. Gebruik maken van alle passende veiligheidsmaatregelen praktijken, waaronder de technische controles (zuurkast, lawaai behuizing) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, brillen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen).

1. Voorbereiding van de Buffer, Surfactant en Polymer Solutions

  1. Bereiding van 100 mM NaCl-oplossing
    1. Oplossen 584 mg NaCl in 80 ml gedeïoniseerd water. Voeg gedeïoniseerd water om de totale volume op 100 ml te brengen.
  2. Bereiding van 3% natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing
    1. Los 3 g SDS in 80 ml gedeïoniseerd water. Voeg gedeïoniseerd water om de totale volume op 100 ml te brengen.
  3. Bereiding van 2% natriumcholaat (SC) -oplossing
    1. Los 2 g zodeium cholaat hydraat in 80 ml gedeïoniseerd water. Voeg gedeïoniseerd water om de totale volume op 100 ml te brengen.
  4. Bereiding van beeldvormende buffer (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
    1. Oplossen 22,23 g Tris base en 58,44 g NaCl in 500 ml gedeïoniseerd water met een magnetische roerstaaf en plaat.
    2. voeg geconcentreerd HCl voorzichtig totdat een pH van 8,1 is bereikt.
    3. Voeg gedeïoniseerd water tot een uiteindelijk volume van 1 L. bereiken
  5. Synthese van RITC-PEG-polymeer RITC
    1. Ontbinden amine difunctionalized polyethyleenglycol (PEG) (5 kDa of 20 kDa, 0,1 mol / l) en rhodamine-isothiocyanaat (RITC, 0,2 mol / l) in 1 ml van een 1: 1 mengsel van dichloormethaan en dimethylformamide (DMF).
    2. Voeg 0,2 mol / l N, N-diisopropylethylamine (DIEA).
    3. Na 3 uur, precipiteren met 10x volume diethylether gevolgd door vacuüm filtratie.
    4. Opnieuw op te lossen in DMF en herhaal ether neerslag followed door vacuümfiltratie.
      OPMERKING: Andere isothiocyanaat gewijzigde verbindingen (bijvoorbeeld fluoresceïne isothiocyanaat, FITC) kan worden bevestigd aan PEG of andere amine gemodificeerde polymeren met een soortgelijke methode.
  6. Bereiding van gepegyleerd DNA (PEG-DNA)
    1. Combineer 100 pl Tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) oplossing (0,5 M, pH 7,0) met 44,9 pl 5'-thiol-gemodificeerde DNA (1 mg / 10 pl in 0,1 M NaCl) en voeg aan 4,855 mL gedemineraliseerd water.
    2. Roer gedurende 1 uur.
    3. Los 500 mg methoxypolyethyleenglycol maleïmide in 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing.
    4. Combineer DNA en PEG-oplossing (10 ml totaal) en roer gedurende 24 uur.

2. Voorbereiding van enkelwandige koolstof nanobuis (SWNTs) Schorsingen

  1. Wash van SWNTs te katalysator en onzuiverheden te verwijderen.
    1. Voeg 200-300 mg van ongewassen SWNTs in een plastic centrifugebuis Containing 45 ml gedemineraliseerd water.
    2. Vortex de oplossing gedurende 2 minuten en ultrasone trillingen met een badsonificeerinrichting gedurende 5 min. Merk op dat ultrasoonapparaat instellingen variëren van instrument naar instrument, dus controleer of de optische dichtheid van de SWNT oplossing toeneemt (dat wil zeggen, wordt zwart) om ervoor te zorgen dat de SWNTs worden verspreid.
    3. Centrifugeer de oplossing gedurende 20 min bij 16.100 xg en verwijder het supernatant.
    4. Voeg ongeveer 45 ml vers gedeïoniseerd water.
    5. Herhaal stappen 2.1.2-2.1.4 tot 8 keer.
    6. Verwijder zoveel mogelijk water voorzichtig gepelletiseerd SWNTs niet te verstoren en laat SWNT pellet aan de lucht drogen.
  2. Nucleïnezuur suspensies van SWNTs
    1. Ontbinden nucleïnezuren (NA) in 0,1 M NaCl tot een concentratie van 100 mg / ml.
    2. Verwijder statische elektriciteit van wegwerp spatel, microcentrifugebuizen en SWNT stock gebruik van een anti-statische gun. In een zuurkast, voeg 20 ul van de oplossing NA 980 ul van 00,1 M NaCl, gevolgd door toevoeging van 1 mg SWNT.
    3. Met een ultrasonicator met 3 mm tip diameter, ultrasone trillingen de oplossing gedurende 10 minuten bij 40% amplitude in een ijsbad.
    4. Centrifugeer de DNA-SWNT oplossing tweemaal gedurende 90 min bij 16.100 x g. Bij gebruik van PEG-DNA, zuiveren het overtollige en niet-omgezette DNA en PEG met behulp van een 100 kDa spin-filter. Voeg genoeg PBS om de spin-filter en draaien op 9300 xg te vullen voor 1,5 min, Herhaal deze wasstap 3 keer.
    5. Verzamelen en te bewaren supernatant, zorg dat u de pellet met CNT bundels en aggregaten niet te verstoren. Gooi de pellet in overeenstemming met de institutionele gevaarlijk afval procedures geschikt zijn voor nanomaterialen.
    6. Meet de oplossing absorptie bij 632 nm met een UV / Vis spectrofotometer globale concentratie van gesuspendeerde SWNT gebruik ε = 0,036 L / cm · mg overeenkomstig de wet van Lambert-Beer en de juiste verdunningsfactor bepalen.
  3. Amfifiele polymeer suspensiesvan SWNTs
    1. Verwijder statische elektriciteit van wegwerp spatel, micro centrifuge buizen, en SWNT voorraad. In een zuurkast, voeg 5 mg SWNTs tot 5 ml 2% SC-oplossing (als alternatief, SDS-oplossing kan worden gebruikt).
    2. Met een ultrasonicator met 6 mm tip diameter, ultrasone trillingen de oplossing gedurende 1 uur bij 40% amplitude in een ijsbad.
    3. Centrifugeer steekproef bij 150.000 xg gedurende 4 uur met behulp van een ultracentrifuge en zorgvuldig te verzamelen supernatant.
    4. Los 1 gew% van amfifiele polymeer (bijvoorbeeld PEG-RITC-RITC) in SC-SWNT oplossing.
    5. Dialyseer de polymeer-SC-SWNT oplossing wordt met een 3,5 kDa dialysemembraan tegen 1 L gedeïoniseerd water of buffer gedurende 5 dagen. Verander het water of buffer na 2 uur en 4 uur Een grotere dialysemembraan kan worden gebruikt, zolang het mogelijk verwijderen van de oppervlakte van keuze, maar het vasthouden van zowel de SWNT en amfifiele polymeer.
    6. Meet de oplossing absorptie bij 632 nm met een UV / Vis spectrofotometer te bepalenglobale concentratie van zwevende SWNTs gebruik van ε = 0,036 L / cm * mg in overeenstemming met de wet van Lambert-Beer en de juiste verdunningsfactor.

3. Voorbereiding van Surface geïmmobiliseerd SWNT Sensoren

  1. Voorbereiding van de BSA-biotine en neutravidine stamoplossingen
    1. Los 10 mg gevriesdroogd BSA-biotine in 1 mL gedeïoniseerd water om een ​​10 mg / ml voorraadoplossing en bewaar bij 4 ° C te maken.
    2. Los 10 mg neutravidine eiwit (NAV, gedeglycosyleerd avidine eiwit) in 2 ml gedeïoniseerd water om een ​​5 mg / ml voorraadoplossing te maken. WINKEL aliquots bij -20 ° C. Aliquots ontdooid kan meerdere dagen worden bewaard bij 4 ° C.
  2. Bereid BSA-biotine beklede microscoopglaasjes
    1. Reinig een microscoop glijbaan en 0,17 mm dekking van glas (of zoals geschikt is voor de microscoop objectief) met gedemineraliseerd water, gevolgd door methanol, aceton en een laatste spoeling van gedeïoniseerd water.
    2. Maak kanalen door het plaatsen van verschillende stukken van dubbelzijdige tape ongeveer 5 mm uit elkaar op het schone microscoopglaasje. Verzegel de kanalen door een lange glazen dekglaasje en drukken op de bovenkant van de dubbelzijdige tape. Zorg ervoor dat deze is gericht op de microscoop dia zodat de randen van het deksel slip en schuif zijn niet doorspoelen.
    3. Voeg 100 ul van BSA-Biotine voorraadoplossing aan 900 pl 1x Tris-buffer tot een eindconcentratie van 1 mg / ml.
    4. Flow 50 pi van de BSA-biotine oplossing in het kanaal pipetteren de oplossing in een einde en transporteren van oplossing aan het andere met een tissue. Incubeer gedurende 5 minuten gevolgd door 3-5 spoelingen met 50 ul van 0,1 M NaCl.
    5. Verdun 40 ui 5 mg / ml voorraad NAV in 960 pl 1x Tris-buffer tot een eindconcentratie van 0,2 mg / ml.
    6. Flow 50 pi van het NAV oplossing in het kanaal pipetteren de oplossing in een einde en transporteren van oplossing aan het andere met een tissue. Incubeer gedurende 2-5 minutengevolgd door 3-5 spoelingen met 50 ul van 0,1 M NaCl.
    7. Verdunde voorraadoplossingen van SWNT gesuspendeerd in beeldvorming buffer tot een concentratie van 1-10 mg / L en stroom 50 pi van de oplossing in het kanaal en incubeer gedurende 5 min.
    8. Voorzichtig weg te spoelen overtollige SWNTs met behulp van 50 ul van imaging buffer.
  3. Voorbereiding van de APTES gesilaniseerde microscoopglaasjes
    OPMERKING: APTES gesilaniseerde objectglaasjes mogelijk een manier om negatief geladen DNA verpakt SWNT immobiliseren aan het oppervlak van een glassubstraat.
    1. Bereid een 10% oplossing van (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) in ethanol.
    2. Met behulp van kanalen gemaakt met behulp van de stappen in 3.2.2, flow in 100 ul 1x Tris buffer.
    3. Spoel het kanaal met APTES-oplossing en incubeer gedurende 5 min. Wassen met 1x Tris buffer.
    4. Verdunde voorraadoplossingen van gesuspendeerde DNA-SWNT imaging buffer tot een concentratie van 1-10 mg / Grond stroom 50 pi van de oplossing in het kanaal en incubaten 5 min.
    5. Voorzichtig weg te spoelen overtollige SWNTs met behulp van 50 ul van imaging buffer.

4. fluorescentiespectroscopie en Microscopie van SWNT Sensors

  1. nabij infrarood fluorescentiemicroscopie
    1. Uitvoeren van beeldvorming oppervlak geïmmobiliseerd SWNT middels laserexcitatie en een omgekeerde microscoop uitgerust met een InGaAs sensorarray voor beeldvorming.
    2. Richt de laserbundel naar de achterkant belichting haven van een omgekeerde microscoop met spiegels op verstelbare kinematische bergen en een paar na Gedragen irissen ingesteld op de hoogte haven binnengaan. Zorg ervoor dat de straal waterpas en recht door de bevestiging van het door beide irissen wanneer geplaatst tussen opeenvolgende spiegels en voordat het in de verlichting poort. Pas indien nodig de bundel hoogte met behulp van een periscoop montage. Verwijder eventuele warmte filters korte pas de verlichting poort die de bundel zou verzwakken.
    3. Plaats een geschikte filter kubus in de microscoopde excitatie licht in de doelstelling weerspiegelen en het verzamelen van de emissie licht. Deze bestaat meestal uit een dichroïsche lange pass filter met een cutoff boven de excitatiegolflengte, (bijvoorbeeld 750 LP) en een emissie lange pass filter (bijvoorbeeld 850 LP) om verstrooid excitatielicht verder te minimaliseren van het raken van de sensor. Bovendien kan de emissie filter selectief worden gekozen voor de uitstoot van SWNT van een bepaalde chiraliteit te zijn.
    4. Voer fijne aanpassingen aan de koplampen door het invoegen van een geschikte uitlijning kubus het vervangen van de doelstelling met twee offset, mat schijven met 1 mm gaatjes. Richt de bundel naar het midden van zowel de onderste en bovenste uitlijning schijven.
    5. Bevestig een 2D InGaAs sensorarray aan de zijkant beeldvorming poort van de microscoop met een geschikte adapter en een 0,5x lens indien nodig de sensor geschikt formaat.
    6. Met behulp van een 100x olie-immersie objectief (1.4 NA), toe te passen fluorescentie-free immersie olie en leg de Immobiseerd SWNT monster op de microscoop podium.
    7. Hef het doel tot de olie contact maakt met de bodem van het dekglas (# 1,5, 170 urn dikte). Maak aanpassingen aan de doelstelling kraag indien nodig voor de beeldvorming omstandigheden, bijvoorbeeld temperatuur, glasdikte, etc.
    8. Langzaam verhogen van de doelstelling van de excitatie bron op en monitoren van de fluorescentie-signaal van de InGaAs camera. Fluorescentie-intensiteit moet geleidelijk toenemen als de focal plane benadert het oppervlak en de geïmmobiliseerde sensoren in beeld komen.
  2. nabij infrarood fluorescentiespectroscopie
    OPMERKING: Fluorescentie spectroscopie kan worden uitgevoerd met dezelfde microscoop setup maar de verzamelde lichtrichtende van de microscoop lichaam en in een spectrometer en InGaAs lineaire array detector.
    1. Met behulp van kinematische mounts en spiegels beoordeeld voor nabij infrarood, richt het lichtpad naar de ingang gleuf van de spectrometer. Richt het licht naar beneden naar een point op de ingangsspleet via een focusserende lens (bijvoorbeeld plano-convex, f = 150 mm). Deze afstemming wordt bereikt door het verzwakken van het laservermogen tot <1 mW en de microscoop objectief te vervangen door een 1 "spiegel en het gebruik van een 50/50 bundeldelende filter kubus. Het excitatielicht zal dan vertrekken de microscoop lichaam via de exit-poort en kan worden gebruikt om de spiegels en de lens aan te passen aan het focusseren op de ingangsspleet.
    2. Na het vervangen van de microscoop doelstelling en lange pass filter, zet een plaat op het podium en de spectra van een in-focus monster met behulp van de spectrometer en InGaAs serie op te nemen.
  3. Meten van de reversibele reactie van (GT) 15 DNA-SWNT's in dopamine
    1. Mount sensor gecoat kanalen op de microscoop podium en brengt in beeld met behulp van een 100X olie objectief en InGaAs camera. Voeg 50 ul van 100 uM dopamine oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan het stromingskanaal en opnemende verandering in fluorescentie-intensiteit.
    2. Spoel de dopamine-oplossing met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing en observeer de verandering in fluorescentie van de individuele SWNT sensoren.
  4. Well-plate screening voor analyt reactie van SWNTs sensoren
    LET OP: Screening van verschillende analyten kunnen worden uitgevoerd met behulp van een doorzichtige plaat goed gecontroleerd met behulp van een gemotoriseerde podium. Een ideale well plaat is transparant voor zichtbaar en IR en heeft zwarte zijwanden om overspraak tussen de putten te minimaliseren.
    1. Pipetteer gelijke volumes gesuspendeerd SWNT sensor (bijvoorbeeld 5 mg / l concentratie) in elk putje, genoeg om de bodem van de put uniform, kenmerkend> 100 ul van een 96-wells plaat en> 30 ul van een 384-plaatafdekking .
    2. Pipet analyten (bijvoorbeeld 2 pl, 100 uM uiteindelijk volume) van het screenen van de bibliotheek in de put platen. Bereid elke analyt in drievoud om rekening te houden voor potentiële well-to-well variatie, Fluctuationen van excitatie-intensiteit, of temperatuur.
    3. Til de doelstelling (bijvoorbeeld 20X Achroplan, 0,45 NA), terwijl het toezicht op de emissie spectra met behulp van de spectrometer en InGaAs array. Optimale positie van het doel zal het brandpuntsvlak ongeveer in het midden van het monstervolume in de put, die overeenkomen met een maximum in gemeten intensiteit zetten.
    4. Voor elk monster goed, neem een ​​1-10 s blootstelling aan een spectrum te verzamelen.
    5. Vergelijk de emissiespectra voor elk putje met een controlegroep die alleen SWNT zonder bijkomende analyt de fluorescentie respons kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SWNTs werden gesuspendeerd in een waterige oplossing met behulp van zowel oppervlakteactieve stoffen en amfifiele polymeren door directe sonificatie en door dialyse te wisselen. Figuur 1 toont SWNTs, geteeld met behulp van de ijzeren carbonyl gekatalyseerde methode (HiPCO), opgehangen met behulp van SC, RITC-PEF20-RITC, en (GT) 15 -DNA. De optische dichtheid van een SWNT's met SDS (of polymeren) sterk verhoogd na sonicatie en vermindert bij verwijdering va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SWNT's worden gemakkelijk gesuspendeerd in waterige oplossing via directe sonicatie met SDS of ssDNA, zoals aangegeven door een toename van de optische dichtheid door de colloïdale dispersie van de resulterende SWNT-hybride polymeer. SDS en ssDNA verspreidt en oplosbaar bundels van SWNTs door adsorberen op de SWNT oppervlak door middel van hydrofobe of pi-pi interacties. Bovendien, andere polymeren, zoals genomisch DNA, amfifiele polymeren geconjugeerde polymeren en lipiden, worden op het oppervlak van SWNT geadsorb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), een Simons Foundation-subsidie, en een Brain and Behavior Research Foundation-subsidie voor jonge onderzoekers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
sodium chlorideFisher ScientificS271-1
sodium dodecyl sulfateSigma AldrichL6026
sodium cholate hydrateSigma AldrichC6445
tris base (Trizma base)Sigma Aldrich93362
hydrochloric acidFisher ScientificA144-212
Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2Nanocs IncPG2-AM-5k
rhodamine B isothiocyanateSigma Aldrich283924
fluorescein isothiocyanateSigma AldrichF7250
dichloromethaneSigma Aldrich676853
dimethylformamideSigma AldrichD4551
N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806
diethyl etherSigma Aldrich673811
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma AldrichC4706 
5’-thiol-modified DNA Integrated DNA Technologies
methoxypolyethylene glycol maleimideSigma Aldrich63187
100 kDa spin filtersMillipore
HiPCO Super purified single walled carbon nanotubesIntegrisHiPco SuperPurified
phosphate buffered salineSigma AldrichP5493
anti static gunMiltyMilty Zerostat 3
centrifugeEppendorf5415 D
ultra sonicatorCole ParmerCV18
dialysis cassettesThermo scientificSlide-A-Lyzer G2 87722
BSA-biotinThermo scientific29130
Neutravidin proteinThermo scientific31000
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)Sigma Aldrich440140
inverted microscopeZeissAxio Observer.Z1
kinematic mirrorsThorLabsKM200-E03
periscopeThorLabsRS99
immersion oilZeissImmersol 518f
100X objectiveZeissPlan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000
20X objectiveZeissN-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 
cover glassHealthrow ScientificHS159879H
dopamine hydrochlorideSigma AldrichH8502 
infrared 2D array cameraPrinceton InstrumentsNIRvana
infrared 1D sensor arrayPrinceton InstrumentsPyLoN IR
nIR spectrographPrinceton InstrumentsSCT-320
planoconvex lensThorLabsLA1384
well plates (glass bottom)Corning4580

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
  2. O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
  3. Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
  4. Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
  5. Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
  6. Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
  7. Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
  8. Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes--the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
  9. Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
  10. Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
  11. Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
  12. Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
  13. Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
  14. Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
  15. Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
  16. Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
  17. Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
  18. Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
  19. Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
  20. Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
  21. Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
  22. Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
  23. Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
  24. Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
  25. Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
  26. Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241(2016).
  27. Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
  28. Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
  29. Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
  30. Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
  31. Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
  32. Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
  33. Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
  34. Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Biomimetische polymerennabij infrarood fluorescentiemoleculaire sensorenpolymeeradsorptieoppervlakte immobilisatiefluorescentiespectroscopiedopamine detectieenkelvoudige molecuulmicroscopieamfifiele polymeersuspensie

Gerelateerde artikelen