Methodenartikel

Lichtwaaier fluorescentiemicroscopie van plantenwortels Kweken op het oppervlak van een gel

DOI:

10.3791/55044

⸱

18 januari 2017

 ,  , 
1Developmental and Cell Biology of Plants, Institute of Science and Technology Austria, 2Bioimaging Facility, Institute of Science and Technology Austria

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol toont een methode voor de bereiding van plantenmonsters voor lichtbladmicroscopie. De opstelling wordt gekenmerkt door het verticaal monteren van de plant op het oppervlak van een gel en het laten groeien in gecontroleerde lichte omstandigheden. Dit maakt langdurige observatie van de ontwikkeling van plantenorganen mogelijk in gestandaardiseerde omstandigheden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste vragen bij het begrijpen van plantenontwikkeling is hoe enkele cellen zich gedragen in een groter weefselverband. Daarom vereist het de observatie van het hele orgaan met een hoge ruimtelijke- en tijdsresolutie gedurende langere periodes, wat fototoxische effecten kan veroorzaken. Dit protocol toont een methode voor de voorbereiding van plantenmonsters voor lichtbladmicroscopie, die wordt gekenmerkt door het verticaal op de oppervlakte van een gel monteren van de plant. De plant wordt op zo'n manier gemonteerd dat de wortels ondergedompeld zijn in een vloeibaar medium terwijl de bladeren in de lucht blijven. Om fotosynthetische activiteit van de plant te garanderen, verlicht een op maat gemaakt verlichtingssysteem de bladeren. Om de wortels in duisternis te houden, wordt het wateroppervlak bedekt met vellen zwarte plasticfolie. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van plantenorganontwikkeling mogelijk onder gestandaardiseerde omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste vragen in het begrijpen van de ontwikkeling van planten is hoe enkele cellen gedragen tijdens orgel differentiatie en groei. Idealiter cellulaire gebeurtenissen, zoals genexpressie patronen en intracellulair eiwit lokalisatie, kunnen worden gezien in het licht van een grotere context van het weefsel. Deze doelstelling vormt technische uitdagingen en vereist een hele orgel observatie met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie gedurende langere perioden, welke foto-toxiciteit effecten veroorzaken. Aangezien planten zich snel aanpassen aan veranderingen in het milieu, moet de groeiomstandigheden strak worden gecontroleerd. Om langdurige imaging zonder te interfereren met de fysiologische toestand van de installatie zijn drie dingen worden gezorgd, 1) groeiomstandigheden in de monsterkamer, 2) stabiel sample bevestiging gedurende lange tijd, en 3) de beeldvorming met lage lichtintensiteiten om foto-schade en niet-fysiologische omstandigheden te voorkomen.

Fysiologische groeiende conditions in de microscoop monster kamer zijn van cruciaal belang voor de lange termijn experimenten. Er zijn een aantal protocollen voor beeldvorming die groeikamers beschrijven confocale microscopen 1-3. Echter, confocale microscopie introduceert hoge lichtintensiteit aan de plant, die stressreacties kunnen veroorzaken en meestal remt de groei 4. Bovendien zijn de meeste conventionele microscopen staan ​​alleen horizontale positionering van het monster, die niet optimaal is voor planten, aangezien zij proberen zich te heroriënteren en groeien naar de vector van de zwaartekracht. In de afgelopen tien jaar heeft het licht-sheet microscopie ontpopt als een krachtig instrument om de ontwikkeling van de grote exemplaren op cellulair resolutie vast te leggen voor perioden van maximaal enkele dagen 5-9. Light-sheet microscopie maakt het positioneren van het monster verticaal en wordt steeds meer gebruikt bij plantenonderzoek bestuderen wortel ontwikkeling 10-21, onlangs beoordeeld door Berthet en Maizel 22. Veel van de genoemde studies 10,13 - 18,21 geoptimaliseerd en uitgevoerd in het laboratorium van Ernst HK Stelzer waarbij een bijzondere manier monster montage gekenmerkt door toenemende de wortel op het oppervlak van een gel 17. In deze studies werd een op maat gemaakte microscoop gebruikt, waarbij de plant wordt gehouden van de bodem. In tegenstelling tot de meeste algemeen beschikbare licht-sheet microscopen houdt het monster uit de top. Aldus is deze bijzondere bereidingswijze kan niet gemakkelijk worden toegepast. De hier gepresenteerde methode biedt een protocol voor de gevestigde on-opbouw methode geldt voor de OpenSPIM 23, een open access platform voor de toepassing en de verbetering van Selectieve Plane Verlichting Microscopy (SPIM).

De algemene doelstelling van dit protocol is om op lange termijn beeldvorming van Arabidopsis wortels in te schakelen in de OpenSPIM licht-sheet microscoop. Dit wordt bereikt door een plant te kweken rechtop op de surface van een gel met de wortels in een vloeibaar medium terwijl de bladeren in de lucht blijven. Om fotosynthetische activiteit van de plant te verzekeren, een op maat gemaakte verlichting verlicht de bladeren maar niet de wortels (figuur 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Arabidopsis kweken Voorafgaand aan Imaging

  1. Bereid ½ MS-medium (halve sterkte Murashige en Skoog medium) door het toevoegen van 2,15 g MS-medium, 10 g sucrose, 0,97 g MES (2- (N -morpholino) ethaansulfonzuur) en 1 L DDH 2 O (tweemaal gedestilleerd water ) in een 1 L fles. Breng de pH op 5,8 met behulp van KOH.
  2. Voeg 15 g / l gellangom naar ½ MS-medium en deze autoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 ° C.
  3. Giet 30 ml van het hete medium in vierkante petrischalen (245 x 245 x 25 mm) met een gellaag te maken met een dikte van ongeveer 2 mm. Laat de gerechten afkoelen tot kamertemperatuur zodat het medium gestold is.
  4. Zet gesteriliseerd Arabidopsis zaden in een 1,5 mL reactiebuis met 1 ml steriel H2O Pak de zaden met een glazen pipet of een 1000 pi pipetpunt en zaaien ze op het oppervlak van de gel. Plaats de zaden afzonderlijk ongeveer 10 mm. Seal de plaat met tape.
  5. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 4° C (stratificatie).
  6. Cultiveren van de plaat in een groei incubator, bijvoorbeeld bij 22 ° C in een 16/8 h dag / nacht-cyclus met 120-140 umol / m² / s hoeveelheid licht voor 6 dagen. Tot 10 dagen oude planten kunnen worden gebruikt.

2. Plant Sample Bereidingswijze

Opmerking: Het monster houder kan zowel 3D geprint of met de hand gemaakt in een machine workshop met de afmetingen weergegeven in figuur 2C. Het 3D-model bestand wordt in het aanvullende materiaal (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Zie de link voor het bestellen van de 3D-print in het materiaal lijst.

  1. Voeg 5 g laagsmeltende agarose in een fles 50 ml bevattende 50 ml ½ MS-medium en deze autoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 ° C.
  2. Aliquot de 1% laag smeltpunt agarose oplossing in 1,5 ml reactiebuizen. Bewaren bij 4 ° C (kan worden gedurende ten minste twee maanden).
  3. Smelt een hoeveelheid van 1 %% laag smeltpunt agarose bij 80 ° C en laat het afkoelen tot33 ° C.
  4. Maak de monsterhouder in een echo-eenheid. Steriliseer het monster houder met 70% ethanol en wassen met steriel water.
  5. Snijd de gel rond de plant met behulp van een scalpel.
  6. Til het blok met een vlakke spatel en schuif het voorzichtig op de monsterhouder met behulp van een tweede spatel.
  7. Lijm de gel op de monsterhouder met 1% agarose (bij 33 ° C) met een 100 ul pipet.
  8. Lijm de plant op de gel met 1% agarose met behulp van een 10 pi pipet. Gebruik een stereomicroscoop om te controleren of de bladeren niet zijn bedekt met gel. Laat de gel niet direct positioneren op het gebied van belang.
  9. Om de plant tegen uitdrogen te voorkomen, werken ononderbroken. Schuif de monsterhouder in een 1000 pi pipet tip waar mogelijk. Gebruik de pipet tip als een pet en schuif hem voorzichtig over het ene uiteinde van het monster houder waar de fabriek is gevestigd.
  10. Zet de monsterhouder in een pipet tip box en voor te bereiden meer planten indien nodig. Planten kunnen direc zijnTLY afgebeeld of terug te zetten in de groei incubator.

3. Stel de microscoop

LET OP: De LED-verlichtingssysteem is een custom-built lamp. De technische details die nodig zijn om de LED-ring te bouwen is te vinden in figuur 3 en het materiaal lijst. Zie het aanvullend materiaal bestand (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) van de board design.

  1. Schroef of lijm (bijvoorbeeld dubbelzijdig plakband) de LED ring aan de onderzijde van de OpenSPIM x / y / z / θ-stage arm.
  2. Sluit de LED-ring met een regelbare voeding (0-30 V, max 2 A).
  3. Regel de spanning op de gewenste lichtintensiteit (voor Arabidopsis, 120-140 umol / m2 / s, Figuur 3D).
  4. Steriliseer de monsterkamer met 70% ethanol en wassen met steriel water.
  5. Reinig het objectief met benzine en lensreinigingsdoekjes. Steriliseer de objectieflens met 70% ethanol.
  6. Sluit de perfusiop buizen naar de monsterkamer in een enkele opstelling. Zet een 1 liter fles met verse ½ MS-medium en nog een lege fles naast de peristaltische perfusie pomp. Sluit de fles met medium met de onderste inlaat van de monsterkamer via een perfusie buis. Sluit de bovenste uitlaat van de monsterkamer met de lege fles naar de gebruikte medium met een andere perfusie buis prullenbak.
  7. De snelheid van stroming 1 ml / min.
    Opmerking: Om de monsterkamer niet overloop, is het belangrijk om een ​​hogere uitstroom dan instroom hebben. Ofwel verhoging van de pompsnelheid of een buis met een grotere inwendige diameter van de uitstroom.
  8. Snijd een zwarte plastic folie in 3 mm pleintjes, wassen met 70% ethanol en laat ze drogen voordat u ze in de monsterkamer op het wateroppervlak.
  9. Verwijder de pipet tip uit het monster houder en steek de monsterhouder in de monsterkamer. Als de nieuw vervaardigde monster houder past niet in het stadium arm, gebruik maken van een fijn zandpapier om het dunner maken of gebruik maken van een O-ring (∅ 6 mm) in het geval het is te dun.
  10. Om de deksels te maken, snijd de zwarte aluminium folie in twee 50 x 25 mm stuks. Wordt 5 mm in het midden van een zijde van elk stuk gesneden. Vouw een driehoek inkeping (figuur 1D) te creëren. Sluit de monsterkamer met de twee deksels door er de deksels bovenop de monsterkamer de driehoek inkepingen tegenover de monsterhouder. Zorg ervoor dat de bladeren van de planten zijn niet in de schaduw van de deksels en licht te ontvangen uit het verlichtingssysteem.
  11. Vind het interessegebied met de x / y / z en rotatie stadium een ​​opkomende zijwortelinitiatie positie in het gezichtsveld.
  12. Vóór opname Laat het systeem equilibreren gedurende ten minste 15 min.
  13. Setup het beeld overname.
    1. Stel een stapel van 217 beelden met 3 micrometer z-afstand (650 micrometer) en stel de time lapse met 15 min beeldvorming interval voor een periode van in totaal 17 uur.
      LET OP: Een uitgebreide documentatie overde bediening van de OpenSPIM software is te vinden op (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
  14. Begin met opnemen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze monstervoorbereiding methode kan de teelt van de planten binnen de microscoop monsterkamer inachtneming van het wortelsysteem van een heldere plaat microscoop (Figuur 1). De plant groeit op het oppervlak van een laag van gel (½ MS-medium dat 1,5% gellangom) gemonteerd op een speciaal ontworpen monsterhouder (figuur 2). Het monster houder is 3D afgedrukt met een transparante hars als materiaal. Een industrieel versie benadrukken de afmetingen wordt weergegeven in figuur 2C. De wortels worden ondergedompeld in vloeistof (½ MS-medium), die continu wordt ververst door een perfusie-systeem. Het blad blijft in de lucht en worden continu verlicht met een lichtintensiteit van 130 umol / m / s uit blauwe en rode LED's die zijn aangebracht in een ring boven het gewas (Figuur 1A, B en figuur 3A-C). De LED-ring is vervaardigd in onze werkplaats en machineWij bieden technische details over hoe de LED-ring in de figuur 3 en het materiaal lijst op te bouwen. De lichtintensiteit kan continu worden aangepast, variërend 30-250 umol / m2 / s (Figuur 3D). Het wortelstelsel is de schaduw van plaatjes van een zwarte kunststof folie die het wateroppervlak (figuur 1). Elke strooilicht van de verlichting die wordt verzameld door de detectie lens wordt gefilterd door het GFP-filter (figuur 3E).

Met deze opstelling een tijdspanne van een groeiende Arabidopsis zijwortelinitiatie werd voor 17 h en een 20X / 0,5 lens (figuur 4). De laterale wortel heeft zijn oorsprong in de pericyclus cellaag, die zich diep in de primaire wortel. Om de grafische mogelijkheden nog dieper binnenkant van een weefsel tonen voor langere tijdsperioden, een hogere vergroting (40x / 0,75) werd gebruikt om de vorming van een laterale ro vangenot uit de eerste trap primordium tot de opkomst van de primaire wortel binnen een periode van 38 uur (Figuur 5). Een als voorbeeld 2D plak van de dataset wordt getoond in Fig. 5B. Deze opname laat ons toe om de dynamiek van de laterale wortelvorming in 3D (figuur 5A) te volgen met een cellulair resolutie.

figure-results-1
Figuur 1: De teeltomstandigheden in de OpenSPIM monsterkamer. A) Schets van de beeldvorming kamer. De plant opgaande op het oppervlak van een gel, gemonteerd op een maatwerk monsterhouder (zie ook figuur 2). De wortels groeien in een vloeibaar medium, dat voortdurend wordt uitgewisseld door een perfusie systeem. De bladeren groeien in lucht en worden verlicht door de rode en blauwe LED's (zie ook figuur 3). Het wortelstelsel is gearceerd wit h kleine vellen van een zwarte plastic folie die het wateroppervlak. Een deksel in twee stukken zwarte aluminiumfolie reduceert de hoeveelheid licht onder het wateroppervlak en onderhoudt vochtigheid in de monsterkamer. De vergrote paneel aan de rechterkant wijst op de plant groeien op het oppervlak van een blok van gel ondergedompeld in het vloeibare medium. Een druppel agarose het root op de gel. De gestippelde rechthoek geeft het gebied van belang waargenomen door de microscoop. B) Foto van de beeldvorming kamer (zonder deksel). Nummers (1) - (10) in A en B vertegenwoordigen: (1): x / y / z / θ fasen met LED-ring, (2): monsterhouder, (3): deksel (4): Arabidopsis thaliana (5): vel van zwarte kunststof folie, (6): perfusie systeem, (7): detectie objectieflens (8) vloeibaar medium, (9): monsterkamer (10): verlichting objectieflens. C) Het deksel is gemaakt van twee stukken zwarte aluminiumfolie. target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Het monster houder. A) 3D-model. Het 3D-model bestand wordt in het aanvullend materiaal. B) Foto van 3D-prints met behulp van verschillende materialen (1) - (3): transparant acryl plastic, (4) en (5): hars, (6): transparante hars. C) Technische tekening van de monsterhouder, getallen millimeter. D) Foto van de vervaardigde monsterhouder met een fabriek gemonteerd. De gestippelde gebied kan worden waargenomen door de microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

uploaden / 55044 / 55044fig3.jpg "/>
Figuur 3: Plant verlichting setup. A) Schematische schakelschema van de lamp. Paren van LED's kan worden in- / uitgeschakeld individueel voor gerichte verlichting. LED: light-emitting diode, R: weerstand, T: transistor, JP: pinhead. B) Het definitieve ontwerp van de lamp werd getrokken met behulp van een PCB-software (PCB: printed circuit board). Wij zorgen voor het ontwerp bestand bord in het aanvullend materiaal. Het bestuur werd vervolgens geproduceerd en geassembleerd in ons instituut MIBA werkplaats. C) een foto van de LED-ring ingeschakeld. Vier paren van rode en blauwe LED zijn in een ring. D) Het bereik van spanning kan worden ingesteld tussen 3,5 V en 14,0 V. Weerstanden werden gebruikt om de hoeveelheid licht, variërend 30-250 umol / m bereiken 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1220 Ohm ). E) De emissie spectrum van de lamp, GFP en YFP. tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: Time lapse opname van Arabidopsis thaliana laterale wortel. De 5 dagen oude zaailing drukt een membraan merker (pUBQ10 :: YFP-PIP1, 4) en een nucleaire reporter (pGATA23 :: GUS-NLS-GFP) het specifiek merken pericycluscellen die zich ontwikkelen tot een zijwortel. Een stapel van 217 foto's (3 micrometer z-afstand) werd gevangen elke 15 minuten gedurende 17 uur opnemen met behulp van een 20X / 0.5 lens. A) Vier tijdstippen van de 69 worden getoond in een maximale intensiteit projectie. B) Zes van de 217 enkele segmenten van een z-stack van één tijdstip worden weergegeven. Schaal bars in A en B vertegenwoordigen 100 urn.load / 55044 / 55044fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 5: Time lapse opname van Arabidopsis thaliana laterale wortel. De 6 dagen oude zaailingen drukt een membraan merker (pUBQ10 :: YFP-PIP1, 4) en een nucleaire reporter (pGATA23 :: GUS-NLS-GFP) het specifiek merken pericycluscellen die zich ontwikkelen tot een zijwortel. Een stapel van 200 beelden (1,5 urn z-afstand) werd gevangen elke 15 minuten voor 38 uur opnemen met behulp van een 40X / 0.75 lens. A) 3D-rendering van vier tijdstippen, de getallen in het rooster geven urn, B) één plak door het middenvlak van de hoofdwortel. Schaal bar vertegenwoordigt 50 micrometer. alsjeblieftklik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Het 3D-model bestand is aangebracht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende File LED-Ring Board.brd. Het ontwerp bestand bord is voorzien. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sheet licht fluorescentiemicroscopie heeft het grote voordeel lage fototoxiciteit en ultrasnelle acquisitiesnelheid, die kan worden gebruikt om een ​​groot volume vastleggen met een hoge ruimtelijke resolutie terwijl het monster in een fysiologische toestand combineren. De resolutie van een lichte plaat microscoop is te vergelijken met die van een confocale microscoop 9. Echter, lichtverstrooiing en absorptie optreedt langs de excitatie en emissie pad individueel en de algehele beeldkwaliteit aanzienlijk lager in ondoorzichtig weefsel ten opzichte van het oppervlak. Om deze complicatie te omzeilen kan men de mogelijkheid om het monster langs de verticale as roteren en hetzelfde volume vanuit verschillende richtingen te observeren. Maar dit is niet altijd voordelig, bijv zijwortels komen aan één zijde van de wortel en imaging achter resulteert in een lage beeldkwaliteit zonder het verkrijgen van meer informatie. Echter, de rotatie in hoofdzaak gebruikt voor het positioneren sample op de beste manier. De klassieke horizontale opstelling van de objectieven maakt nieuwe manieren sample montage. Planten profiteren van een verticale positie. Hier voorgesteld, de "aan het oppervlak van de gel" montagemethode heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere bevestigingsmethoden, zoals inbedden van de wortel in een gel 24,25. 1) Het wortelsysteem staat in direct contact met het vloeibare medium. De monsterkamer is verbonden met een perfusie systeem dat continu vers medium bepaalt. Het kan ook worden gebruikt om het gehele volume van de monsterkamer snel wisselen verschillende media of middelen toepassen. 2) Voor bereiding van het monster planten groeien als ze worden gebruikt om te groeien in laboratoria. Planten kunnen worden geselecteerd onder een fluorescentiemicroscoop en alleen de gewenste planten moeten worden voorbereid. 3) De plant wordt overgebracht van de petrischaal op de monsterhouder zonder aangeraakt. Waardoor de plant zich verder kan ontwikkelen op dezelfde gel werd groeien op de groei incubator en mechanische spanning wordt geminimaliseerd. 4) Het uitzicht op het monster is vrij en optische aberraties worden geminimaliseerd, omdat de ruimte tussen het monster en de detectie doel uitsluitend is gevuld met medium en geen andere materialen met verschillende brekingsindex.

Om langdurige beeldvorming uitvoeren, de plant belichtingssysteem moet fotosynthetische activiteit van de plant te waarborgen. In de meeste laboratoria planten groeien op een transparante gel, dat wil zeggen de wortels worden blootgesteld aan licht. Dit kan verschillende reacties op hun omgeving veroorzaken en leidt tot veranderingen in hun biochemie en ontwikkeling 26,27. Om de hoeveelheid licht op het wortelsysteem verlagen, zwarte kunststof folie gebruikt om het wateroppervlak en een deksel in zwart aluminiumfolie onder de monsterkamer dekken. Licht kan de plant te bereiken verlaat door de centrale opening in het deksel. In deze opstelling, werd geen toename in de achtergrond licht waargenomen, suggesting dat de hoeveelheid verstrooid licht van de rode en blauwe LED's aanzienlijk werd gereduceerd door het GFP-filter en de schaduw benaderingen. Hierdoor kon het licht ingeschakeld tijdens beeldacquisitie houden zonder dat de camera achtergrondgeluid.

De monsterhouder is ontworpen om 3D-printen. De materiaalkeuze is belangrijk, omdat verschillende kunststoffen die werden getest niet 100% stabiel waren, wat resulteert in een afwijking van het monster. Daarom is het raadzaam om harsen te gebruiken in plaats of bouwen van de monsterhouder door het frezen van een Polyethyleen (PEP) staaf. Bij gebruik van een lichte plaat microscoop opstelling met dubbelzijdig belichtingsstelsel de monsterhouder kan storen van het licht vellen afhankelijk van de rotatiehoek. Mechanische stress tijdens het uithollen van de plant uit de plaat te verminderen, gebruik dan een vlakke hoek van de spatel. De plant kan snel uitdrogen en ervaring luchtstroom voor de allereerste keer. Probeer aan een doorvaarthoogte (snelle bewegingen, airconditioning flow) te voorkomen, work ononderbroken en schuif de monsterhouder in een 1000 pi pipet tip waar mogelijk. Binnen de microscoop, is het cruciaal om niet dompel de hele plant in vloeibare en houdt de bladeren droog.

De techniek is ideaal voor de beeldvorming vroege stadia van laterale wortelvorming. Bij het uitvoeren van de lange termijn beeldvorming van oudere wortel tips moet men in gedachten houden dat Arabidopsis wortels groeien met 100-300 um / h snel uit het gezichtsveld. Een zeer nuttige toekomstige uitvoering kan een geautomatiseerd tracking-algoritme, dat volgende wortel tip groei zou toelaten gedurende langere perioden van tijd. Het vermogen om omgevingsfactoren zoals licht en voedingsstoffen samenstelling van het medium regelen tijdens het acquisitieproces laat onderzoeken hoe planten zich aanpassen aan veranderingen. De wortel is in direct contact met het vloeibare medium, dat kan worden gebruikt om geneesmiddelen van toepassing op chemisch activeren genexpressie, bijvoorbeeld met de dexamethason induceerbare 28 of β-estradiol induceerbaar systeem 29. Echter, het kost tijd om het gehele volume van de monsterkamer wisselen spoelen een geneesmiddel. De installatie kan worden verbeterd door het minimaliseren van het volume van de monsterkamer tot medium uitwisseling versnellen. Toch is deze techniek heeft een groot potentieel. De combinatie van de montage procedure, gestandaardiseerde groeiomstandigheden en de zachte imago acquisitie met behulp van licht-sheet microscopie maakt het mogelijk op lange termijn studies van de ontwikkeling van de plant met een hoge resolutie op een fysiologisch niveau. Dit zal onderzoekers helpen om de fundamentele mechanismen van de ontwikkeling van de plant te verkennen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Matyáš Fendrych voor kritisch lezen / bekijken en Stephan Stadlbauer voor de audio-apparatuur. Dankzij de Miba Machine Shop bij IST Oostenrijk voor hun bijdrage aan de OpenSPIM. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van het programma Mensen (Marie Curie-acties) van het Zevende Kaderprogramma van de Europese Unie (FP7 / 2007-2013) onder REA subsidieovereenkomst n ° [291734] en de European Research Council (ERC-project 2011 -StG-20101109-PSDP).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose, laag smeltpuntVWRAFFY3282125GM
Zwarte aluminiumfolieThorlabsBKF12
Zwarte plasticfolieCarl RothHT83.2
LED blauw (453 nm)OSRAMLD CN5M-1R1S-35-1
LED rood (625 nm)OSRAMLR T66F-ABBB-1-1
LED-bord - PCB-ontwerpsoftwareCadsoft Eagle
MES-monohydraatDuchefaM1503.0100
Micropore chirurgisch tape3M1530-1
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)DuchefaM0221
PhytagelSigma-AldrichP8169
Monsterhouder 3D-printi.materialisehttps://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1
Vierkante petrischalen (245 x 245 x 25 mm)VWR734-2179
SucroseSigma-Aldrich84097-1KG

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grossmann, G., Guo, W. -J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  2. Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
  3. Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22(2015).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  6. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  7. Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  8. Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
  9. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
  10. Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
  11. Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303(2011).
  12. Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  13. Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
  14. Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
  15. Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
  16. Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  17. Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
  18. Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252(2014).
  19. Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
  20. Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
  21. Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
  22. Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
  23. Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  24. de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
  25. Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
  26. Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
  27. Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
  28. Aoyama, T., Chua, N. -H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
  29. Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Light sheetmicroscopiebeeldvorming van plantenwortelsmontage op geloppervlakpreparatie van plantmonsterslangetermijnbeeldvorminganalyse van wortelgroeistudie naar plantontwikkelingop maat gemaakt verlichtingssysteembereiding van gellaag

Gerelateerde artikelen