De leptomeningen explantaatkweek protocol uit menselijke postmortem hersenen is een technisch robuust en eenvoudige manier om fibronectine-positieve meningeale fibroblasten ontlenen binnen 6-8 weken en cryopreserve, circa 20-30 miljoen cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Afleiding van leptomeningen Explantatie culturen van postmortaal Human Brain Donors
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoewel grote vooruitgang is gemaakt in de klinische karakterisering van de ziekte van Parkinson, een aantal studies rapporteren dat de diagnose van de ziekte van Parkinson niet pathologisch bevestigd tot 25% van de ziekte klinisch gediagnosticeerde Parkinson. Daarom weefsel vanuit klinisch gediagnosticeerde patiënten met de ziekte van Parkinson kunnen een hoog percentage verkeerde diagnose hebben; vandaar in vitro studies uit dergelijke weefsels parkinsondementie onderzoeken als preklinisch model nutteloos kan worden.
Door het verzamelen postmortem menselijk leptomeningen met een bevestigde neuropathologische diagnose van de ziekte van Parkinson en gekenmerkt door nigrostriatale celverlies en intracellulaire eiwit inclusies Lewy lichaampjes, kan men er zeker van zijn dat klinisch waargenomen parkinsonisme niet wordt veroorzaakt door een onderliggende ziekteproces (bijvoorbeeld tumoren, arteriosclerose).
Dit protocol presents de dissectie en de voorbereiding van postmortale menselijke leptomeningen voor het afleiden van een meningeale fibroblast cultuur. Deze procedure is robuust en heeft een hoog slagingspercentage. De uitdaging van de kweek steriliteit als het brein opdrachten algemeen niet onder steriele omstandigheden wordt uitgevoerd. Daarom is het belangrijk om de kweekmedia aangevuld met een cocktail van penicilline, streptomycine en amfotericine B.
De afleiding van meningeale fibroblasten autopsie bevestigde gevallen van de ziekte van Parkinson als basis voor een in vitro model van de ziekte van Parkinson. Meningeale fibroblasten verschijnen 3-9 dagen na de bereiding van de monsters en ongeveer 20-30 miljoen cellen kunnen worden gecryopreserveerd in 6-8 weken. De hersenvlies fibroblast cultuur is homogeen en de cellen brengen fibronectine, een veel gebruikte marker om hersenvliezen te identificeren.
Inleiding
Meninges bestaan uit drie vliezen die de hersenen te beschermen: dura mater, arachnoid en pia mater. Meer recent is erkend dat hersenvliezen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van de hersenen en de hersenen homeostase 1 spelen. Hersenvliezen afstammend van mesenchymale en neurale kam afgeleide cellen en interessant, is aangetoond dat stamcellen die in meninges kan leiden tot neuronen in vitro en in vivo na transplantatie 2, 3, 4 geven. Meninges culturen zijn ook met succes gebruikt als voedsterlagen mocht bezitten stromale ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De registratie hersenen donatie bevat documentatie door de registrant van hun intentie om te doneren. De autopsie toestemming voor tissue ophalen wordt geleverd door de nabestaanden als wettelijk is toegestaan. Onderzoeken met behulp van verzamelde autopsie exemplaren worden beoordeeld door de Institutional Review Board (IRB) om de naleving van Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) regelgeving.
OPMERKING: leptomeningen monsters worden verzameld door de hersenen dissector of neuropathologist tijdens hersenen dissectie en opgeslagen in 50 ml conische buisjes met 25-30 ml meninges groeimedia. Het monster wordt bewaard b....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer de verwerking leptomeningen protocol succesvol is geweest, is uitgroei meningeale fibroblasten eerst waargenomen 3-9 dagen na sectie, hoewel dit kan afhankelijk van de duur van post-mortem interval voor de hersenen. Figuur 1 toont hersenvlies fibroblast culturen van vier verschillende donoren. Figuur 1A toont een leptomeningen stuk naar beneden door een glazen afdekplaat slip (donkere diagonale lijn) en fibroblast uitgroei rond het weefsel vier d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een eenvoudig en robuust protocol om een meningeale fibroblast cultuur afkomstig zijn van menselijke postmortem leptomeningen verzameld in combinatie met een brein donatie. Er zijn maar weinig beschrijvingen van protocollen bij celculturen afkomstig van postmortale menselijk materiaal. Twee studies beschrijven huid afgeleide fibroblast cultures 7, 8, 9, een studie beschrijft dura monsters
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De ontwikkeling van dit protocol werd gefinancierd door particuliere donaties gericht aan het Parkinson's Institute Brain Donation Program.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Corning Petri schotels | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plaat | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm dekglasjes | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, steriele mesjes, nr. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Geboogde precisietang met punt | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serologische pipetten | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipetten | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatine | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combineer mediacomponenten en filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks met filterdoppen, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Kweekmedium | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvaat (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (gele oplossing/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Fibronectinekleuring | |||
| 8-wel kamer slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normaal geitenserum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectine antilichaam [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 verdunning in blokkeringsoplossing |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 verdunning in blokkeringsoplossing |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 verdunning in blokkeringsoplossing |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 verdunning in blokkeringsoplossing |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1.000 verdunning in blokkeringsoplossing |
| Alexa Fluor 488 anti-konijn | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 verdunning in blokkeringsoplossing; (groen kanaal; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-muis | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 verdunning in blokkeringsoplossing; (rood kanaal; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 kleurstof | Thermo Fisher | H3570 | verdun tot een eindconcentratie van 1,0 μg/mL; (blauw kanaal; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Leveranciers zijn suggesties, vergelijkbare producten van alternatieve leveranciers kunnen ook worden gebruikt. |
Referenties
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
