Methodenartikel

teelt van Caenorhabditis elegans In drie dimensies in het Laboratorium

DOI:

10.3791/55048

⸱

12 december 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een eenvoudige methode om 3D nematode teeltsystemen genaamd NGT-3D en NGB-3D construeren. Deze kunnen worden gebruikt om nematode fitness en gedragingen bij habitats die meer lijken op natuurlijke Caenorhabditis elegans habitats dan standaard 2D laboratorium C. elegans kweekplaten zijn bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van genetisch modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans heeft in de afgelopen vijf decennia geleid tot baanbrekende ontdekkingen in de biologie. Het meeste wat we weten over C. elegans beperkt zich tot de laboratoriumcultivatiek van de nematoden die mogelijk niet noodzakelijkerwijs de omgevingen weerspiegelen waarin ze normaal gesproken in de natuur voorkomen. De cultivatie van C. elegans in een 3D-habitat die meer lijkt op de 3D-matrix die wormen in de natuur tegenkomen in rotte vruchten en vegetatieve compost, zou nieuwe fenotypen en gedragingen kunnen onthullen die niet waargenomen worden in 2D. Bovendien kunnen experimenten in 3D aantonen hoe fenotypen die we in 2D waarnemen relevant zijn voor de worm in de natuur. Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd waarbij C. elegans normaal groeit en zich voortplant in drie dimensies. De cultivatie van C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) kan ons toelaten om de reproductieve fitheid van C. elegans-stammen of verschillende condities in een 3D-omgeving te meten. We presenteren ook een nieuwe methode, genaamd Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), om C. elegans in 3D te cultiveren voor microscopische analyse. Deze methoden stellen wetenschappers in staat om de biologie van C. elegans te bestuderen in omstandigheden die beter weerspiegelen de omgevingen waarin ze in de natuur voorkomen. Dit kan ons helpen de evolutionaire relevantie te begrijpen van de fysiologie en het gedrag van C. elegans dat we in het laboratorium waarnemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoek naar de nematode Caenorhabditis elegans in het laboratorium heeft in de afgelopen vijf decennia geleid tot baanbrekende ontdekkingen op het gebied van de biologie1. C. elegans was de eerste meercellige organisme waarvan het genoom werd gesequenced in 19982, en het is van onschatbare waarde geweest bij het begrijpen van de bijdragen van individuele genen aan de ontwikkeling, fysiologie en het gedrag van een heel organisme. Wetenschappers zijn nu op zoek naar meer inzicht in hoe deze genen kunnen bijdragen aan de overleving en reproductieve fitness van organismen in hun natuurlijke omgevingen, door vragen te stellen over ecologie en evolutie op genetisch niveau3-5.

C. elegans kan opnieuw een uitstekend systeem bieden om deze vragen te beantwoorden. Er is echter weinig bekend over de biologie van C. elegans in natuurlijke nematode habitats, en er zijn geen huidige methoden om gecontroleerde natuurlijke omstandigheden van C. elegans in het laboratorium te simuleren. In het laboratorium wordt C. elegans gekweekt op het oppervlak van agar platen gezaaid met E. coli bacteriën6. In de natuur, kunnen C. elegans en verwante nematoden echter schaars worden aangetroffen in bodems over de hele wereld, maar ze worden specifiek aangetroffen in rottend fruit en plantaardig materiaal7,8. Deze driedimensionale (3D) complexe omgevingen verschillen aanzienlijk van de eenvoudige 2D omgevingen waaraan wormen in het laboratorium worden blootgesteld.

Om vragen over de biologie van nematoden in een meer natuurlijke 3D omgeving te beginnen te beantwoorden, hebben we een 3D habitat ontworpen voor laboratorium cultivatie van nematoden die we Nematode Growth Tube 3D of NGT-3D noemen voor kort9. Het doel was om een 3D groeisysteem te ontwerpen dat vergelijkbare groei, ontwikkeling en vruchtbaarheid mogelijk maakt met de standaard 2D Nematode Growth Media (NGM) platen10. Dit systeem ondersteunt de groei van bacteriën en nematoden gedurende hun hele levenscyclus in 3D, stelt wormen in staat zich vrij te bewegen en te gedragen in drie dimensies, en is eenvoudig en goedkoop te fabriceren en te gebruiken.

In het huidige onderzoek bieden we een stapsgewijze methode om NGT-3D te fabriceren en wormontwikkeling en vruchtbaarheid te evalueren. Naast het beoordelen van wormfitheid in 3D, probeerden we wormgedrag en fysiologie in 3D cultivatie te beeldhouwen, te videoën en te beoordelen. Daarom presenteren we hier, naast NGT-3D, een alternatieve methode genaamd Nematode Growth Bottle 3D of NGB-3D, voor de microscopische beeldvorming van C. elegans tijdens 3D cultivatie. Dit zal vooral belangrijk zijn voor de studie van bekende gedragingen die in 2D zijn geïdentificeerd, en de identificatie van nieuwe gedragingen uniek voor 3D cultivatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid Oplossingen voor NGT-3D en NGB-3D

  1. Bereid de volgende steriele oplossingen: 1 l 0,1454 M NaCl-oplossing, 1 L van 1 M CaCl2, 1 L van 1 M MgSO4, lysogenie bouillon (LB), 1 L van 1 M KPO 4 buffer (108,3 g KH 2 PO 4 en 35,6 g K 2 HPO 4, en vul H 2 O tot 1 L). Productie van NGM behulp van deze oplossingen kan worden gevonden in een eerder protocol 10.
  2. Oplossingen autoclaaf bij 121 ° C, 15 min.
  3. Bereid 50 ml van een steriele 5 mg / ml oplossing cholesterol. In een 50 ml conische buis, meng 0,25 g cholesterol en 50 ml 99,99% ethanol en meng. Niet in een autoclaaf. Steriliseer de oplossing cholesterol via een 50 ml spuit met een 0,45 urn spuitfilter. Dit zal ook eventuele onopgeloste cholesterol te verwijderen.
  4. (Optioneel) Maak 10 ml van een 150 mM 2'-deoxy-5-fluoruridine (FUdR) voorraad. In een 15 ml conische buis, meng 0,3693 gvan FUdR en 10 ml gedestilleerd water. Goed schudden.

2. Bereid Cultuur van bacteriën voor NGT-3D en NGB-3D

  1. Inoculeer 10 ml LB-bouillon met bacteriën. De standaard bacteriën gebruikt voor C. elegans voeden is E. coli stam OP50.
  2. Cultuur de bacteriële inoculatie bij 37 ° C in een schudincubator nachts.
  3. Ter voorbereiding van een seriële verdunning, aliquot 9 ml van de NaCl oplossing in steriele 15 ml conische buizen. Bijvoorbeeld, monster 9 ml in een totaal van 7 buizen een 10 -7 verdunning van OP50 stam E. coli maken.
  4. Met behulp van een steriele 1000 ui pipet Pipetteer 1 ml van de bacteriële kweek of verdunde bacteriële kweek in de nieuwe steriele buis met 9 ml NaCl-oplossing en vortex het mengsel 10 ml ook. Herhaal dit tot de gewenste bacteriële verdunning wordt bereikt.
    OPMERKING: De gewenste bacteriële verdunning hangt af van het type en de toestand van bacteriën en de exacte experimentele omstandigheden.Bijvoorbeeld, een 10 -6 - 10 -8 verdunning van OP50 stam E. coli werd voldoende is om 1-200 bacteriekolonies per 6,5 ml NGT-3D buis. Wormen betrouwbaar ontwikkeld en gereproduceerd normaal wanneer het aantal kolonies was dan 60, die zich bij een verdunning van 10 -6 - 10 -7. Voor NGB-3D, maken gebruik van een verdunning van 10 -8.

3. Het maken NGT-3D en NGB 3D (200 ml)

  1. Na bereiding van de bacteriecultuur, meng 0,6 g NaCl, 1 g gegranuleerd agar en 0,5 g pepton in een 500 ml kolf. Plaats een magnetische roerstaaf in de kolf.
  2. Voeg 195 ml gedestilleerd water en hebben betrekking op de mond van de kolf in aluminiumfolie.
  3. Autoclaaf 121 ° C gedurende 15 minuten.
  4. Plaats de hete geautoclaveerde kolf op een roer plaat, en roer op een matig tempo gedurende minstens 2 uur. Koel de kolf tot 40 ° C. Zorg ervoor dat u voldoende afkoelen als de voortzetting van hier bij hoge temperaturen kunnen leiden tot vertroebeling van het afgewerkte agar.Evenwel lagere temperaturen resulteren in voortijdige verharding van de agar.
    1. (Optioneel) Om het tempo van het koelproces, zet de kolf in een 40 ° C waterbad 15 minuten voordat het op een roer plaat.
  5. Wanneer de temperatuur van de agar media 40 ° C bereikt, voeg 200 ul 1 M CaCl2 200 gl van 5 mg / ml cholesterol oplossing, 200 ul 1 M MgSO4 en 5 ml 1 M KPO 4 buffer oplossing blijft roeren tot eindconcentraties van 1 mM CaCl2, 5 ug / ml cholesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM KPO 4.
    1. (Optioneel) voor NGT-3D levensduur assay voeg 80 ul van 150 mM FUdR tot een eindconcentratie van 120 pM 12.
  6. Voeg 6 ml van de 10 ml verdunde bacteriecultuur uit stap 2.4 in de kolf direct.
    1. (Optioneel) voor NGT-3D, verwijderen 6 ml agar media vóór stap 3.6 en houd het warm apart. Dit medium wordt gebruikt voor het bacterievrijbovenste laag.
  7. Met behulp van steriele procedures, afzien van de media in een steriele cultuur kamer. Zorg ervoor dat het deksel van de kamer sluit stevig vast.
    1. (Optioneel) voorkoming van bacteriële kolonies vormen op het bovenoppervlak van de agar, maken een laag bacterievrij agar media uit stap 3.6.1 bovenaan voor de media uit stap 3.7 volledig verhardt. Dit zal een bacterie zone boven in de NGT-3D maken.
    2. Voor NGT-3D, giet 6,5 ml medium in de 8 ml doorzichtige plastic testbuisjes een bacterie agarlaag maken, en zorgvuldig afzien 200 pl van het bacterievrije media bovenop het deels geharde 3D media een dun maken bacterie- vrij laag bovenop.
    3. Voor NGB-3D, giet 65 ml van media in de 25 cm 2 doorzichtige plastic celcultuur fles. Dit bedrag moet het lichaam van de 25 cm 2 celkweek fles te vullen.
  8. Reactie kamers verticaal bij kamertemperatuur gedurende één week om bacteriële kolonies groeieneen aanzienlijke grootte diameter van ten minste 1 mm.
    1. (Optioneel) voor de levensduur test in NGT-3D, cover kamers met aluminiumfolie aan het licht degradatie van FUdR voorkomen.

4. Meet de geschiktheid van Worm Bevolking op NGT-3D (Relative Brood Maat Assay)

  1. Kies een L4 stadium worm met behulp van een platina draad oppikken en overbrengen op een bacterie-vrij NGM plaat. Sta worm vrij bewegen gedurende enkele minuten om bacteriën gehecht aan zijn lichaam.
  2. Herhaal stap 4.1 en zorg ervoor dat de worm is vrij van bacteriën. In het algemeen, twee herhalingen van 4,1 voldoende.
  3. Plaats de schone worm voorzichtig op het oppervlak van de 3D media met een platina draad pick. De worm moet uiteindelijk voer de agar in de 3D-agar matrix.
  4. Sluit het deksel los waardoor wat lucht te krijgen in de buis, maar het voorkomen van het drogen van de agar media.
  5. Incubeer gedurende 96 uur bij 20 ° C.
  6. Na 4 dagen, sluit de deksels goed vast en plaats deNGT-3D kweekkamer in een 88 ° C waterbad om de agar te smelten. De hitte doodt wormen, maar hun lichamen blijven intact.
    OPMERKING: met 8 ml buizen voor NGT-3D, 20 - 30 min incubatie meestal voldoende.
  7. Met behulp van een glazen pipet de gesmolten media op een 9 cm plastic petrischaal. Plastic pipetten zijn niet mogelijk, zoals wormen vaak kan vasthouden aan hen.
  8. Met behulp van een transmissie stereo stereomicroscoop Tel het aantal wormen in de L3, L4 en volwassen stadia. Heeft wormen die zijn L2 fase en jonger niet mee, omdat de F1 en F2 generaties hier kan worden verward. Dus deze test is een relatief broedselgrootte test in plaats van een totale broedselgrootte assay.

5. Beeld en Record Worm gedrag op NGB-3D

  1. Kies een L4 stadium worm met behulp van een platina draad oppikken en verwijder alle bacteriën vast aan de oppervlakte door de overdracht aan een bacterie-vrij NGM plaat en waardoor zij zich vrij te bewegen voor een paar minuten.
  2. Herhaal stap 5.1 om ervoor te zorgen dat de worm is vrij van bacteriën.
  3. Plaats de schone worm voorzichtig op het midden van de agar oppervlak van de NGB 3D nabij de hals van de fles met een platina draad pick. De worm moet uiteindelijk voer de agar in de 3D-agar matrix.
  4. Sluit het deksel los waardoor wat lucht te krijgen in de buis, terwijl het voorkomen van het drogen van de agar media.
  5. Afbeelding of de worm onder een transmissie stereo dissectie microscoop te leggen. Pas de focus als de worm door de 3D-matrix beweegt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De constructie van NGT-3D is een eenvoudige en protocol dat resulteert in een agar-gevulde reageerbuis met kleine bacteriële kolonies verspreid over de agar (Figuur 1A). Wormen kunnen zich vrij bewegen door de agar matrix, vinden en de consumptie van de bacteriële kolonies. Om te bevestigen of C. elegans kunnen voortplanten en groeien normaal in NGT-3D, vergeleken we de vruchtbaarheid en larvale ontwikkeling in 3D met standaard 2D NGM platen. In de relatieve bro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het laboratorium teelt van C. elegans het gebruik van de klassieke nematode groei media platen was van cruciaal belang voor de honderden belangrijke ontdekkingen die het onderzoek in C. elegans heeft verstrekt. Hier presenteren we nieuwe methoden om C. elegans kweken in een omgeving die een betere afspiegeling hun natuurlijke driedimensionale habitats. Hoewel andere methoden zijn gebruikt om C. elegans observeren 3D 13, is het eerste protocol dat kweken van wormen maakt in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een New Investigator Grant [2014R1A1A1005553] van de National Research Foundation Korea (NRF) naar JIL; en een Yonsei University Future Leader Challenge Grant [2015-22-0133] om JIL

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LB bouillon, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
NatriumchlorideDAEJUNG7548-440058.44 MW
Agar, gegranuleerdDifco214530
PeptonBacto211677
Calciumchloride, dihydraatBio BasicCD00502*H2O; 147.02 MW
CholesterolBio BasicCD0122386.67 MW
EthylalcoholB&JRP090-199.99%; 46.07 MW
Magnesiumsulfaat, watervrijBio BasicMN1988120.37 MW
Kaliumfosfaat, monobasisch, watervrijBio BasicPB0445136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridineTokyo Chemical IndustryD2235246.19 MW
Kaliumfosfaat, dibasisch, watervrijBio BasicPB0447174.18 MW
Multi-Purpose TestbuizenStockwell ScientificST.85708 ml
Testbuisver sluitingenStockwell ScientificST.8575
Cell Culture FlaskSPL Lifescience7012525 cm2
Research Stereo MicroscopeNikonSMZ18
High-Definition Color Camera HeadNikonDS-Fi2
PC-Based Control UnitNikonDS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging SoftwareNikonMQS32000

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056(2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484(2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

C elegans kweek3D groei van nematodenNGT 3D methodeNGB 3D methodenematodengroeibuisnematodengroeiflessteriele cholesteroloplossingprotocol voor seri le verdunninggroei van bacteri le koloniesrelatieve nestgrootte

Gerelateerde artikelen