Methodenartikel

Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

12.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55095

⸱

5 januari 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

In dit artikel

Samenvatting

Huidige behandelingen van inflammatoire darmziekten (IBD) zijn gericht op het verlichten van de ziektesymptomen, maar kan ernstige bijwerkingen veroorzaken. Zo worden alternatieve strategieën onderzocht in dierlijke modellen colitis. Hier leggen we uit hoe de gunstige effecten van voedingssupplementen op de klinische IBD borden worden geanalyseerd in een dergelijk colitis model.

Samenvatting

Inflammatoire darmziekten (IBD), zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa zijn chronische recidiverende aandoeningen van de darmen. Ze veroorzaken ernstige problemen, zoals buikkrampen, bloederige diarree en gewichtsverlies, in getroffen personen. Helaas is er nog geen genezing, en behandelingen gericht alleen om de symptomen te verlichten. Huidige behandelingen omvatten anti-inflammatoire en immunosuppressieve geneesmiddelen die ernstige bijwerkingen kunnen veroorzaken. Dit staat in voor de zoektocht naar alternatieve behandeling opties, zoals voedingssupplementen, die geen bijwerkingen veroorzaken. Voordat de toepassing ervan in klinische studies, moeten dergelijke verbindingen grondig worden getest op effectiviteit en veiligheid in diermodellen. Een betrouwbare experimentele model is de dextransulfaatnatrium (DSS) model colitis bij muizen, die veel van de klinische symptomen van colitis ulcerosa bij mensen reproduceert. We hebben onlangs toegepast dit model om de gunstige effecten van een voedingssupplement met testenvitamine C en E, L-arginine, en ω3-meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA). We analyseerden verschillende parameters ziekte en vonden dat dit supplement kon oedeemvorming, weefselschade, leukocytinfiltratie, oxidatieve stress, en de productie van pro-inflammatoire cytokines te verbeteren, wat leidt tot een algemene verbetering van de ziekteactiviteit index. In dit artikel hebben we in detail de correcte toepassing van voedingssupplementen met de DSS colitis model in C57BL / 6 muizen, evenals hoe ziekteparameters zoals histologie, oxidatieve stress en inflammatie worden beoordeeld. Het analyseren van de gunstige effecten van verschillende voedingssupplementen kan dan uiteindelijk opent nieuwe mogelijkheden voor de ontwikkeling van alternatieve behandelingsstrategieën die IBD symptomen te verlichten en / of de fasen van remissie te verlengen zonder dat ernstige bijwerkingen.

Inleiding

Colitis is een ontsteking van de dikke darm die diarree en abdominale pijn kan veroorzaken. Colitis kan acuut zijn, in respons op infectie of stress, of het kan ontwikkelen als een chronische ziekte, zoals bij ulceratieve colitis (UC), die behoort tot de groep van inflammatoire darmziekten (IBD). Hoewel de klinische tekenen van CU zijn goed beschreven, wordt de pathogenese nog steeds slecht begrepen 1. Het is algemeen aanvaard onder de experts dat UC is een multifactoriële aandoening, waarbij genetische mutaties en afwijkende immuunreacties speelt een belangrijke rol 2. Echter, omgevingsfactoren, zoals de stijl van leven en voeding, dragen ook bij aan de ontwikkeling van de ziekte en progressie 3.

Helaas, IBD is niet te genezen, maar er zijn veel behandelingen die gericht zijn klinische symptomen te verlichten. Huidige behandelingen omvatten anti- inflammatoire middelen, zoals sulfasalazine en corticosteroïden; immunosuppressiva, zoals azathioPrine; monoklonale antilichamen die capture pro-inflammatoire cytokinen, zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α) of blok adhesiemoleculen, zoals integrines, overmatige leukocyt rekrutering verminderen; en inhibitoren die kinasen die pro-inflammatoire pathways, zoals Janus kinase (JAK) 4 activeren targeten. Niet alle patiënten reageren op alle behandelingen, dus therapeutische strategieën moeten worden geïndividualiseerd 5. Voorts zijn de meeste van deze therapeutische geneesmiddelen het metabolisme en immuunreacties, wat vaak ernstige bijwerkingen. Daarom zijn alternatieve behandelingen onderzocht.

Alternatieve behandelingen omvatten probiotica en voedingssupplementen, die in diermodellen en klinische studies hebben toegepast met wisselend succes 6,7. We hebben onlangs gevonden dat de toepassing van andere enkelvoudige voedingssupplementen, zoals anti-oxidatieve vitaminen of ω3-poly-onverzadigde vetzuren (PUFAS), inferieur is aan de toepassing van een combinatie van dergelijke supplementen bij het verlichten colitis en cardiovasculaire ziektesymptomen 8,9. Deze studies werden uitgevoerd bij muizen, zodat klinische studies worden uitgevoerd bij mensen om te bepalen of deze bevindingen ook gelden voor de mens is. Voordat klinische studies worden gestart, moet de effectiviteit en veiligheid van nieuwe behandelingsmogelijkheden geëvalueerd worden in diermodellen.

IBD is de dextransulfaatnatrium (DSS) model op grote schaal gebruikt om de mechanismen van de ontwikkeling van de ziekte en de gunstige effecten van drugs en voedingssupplementen 6,10 bestuderen. In de meeste studies werd slechts een acute ziekte gedurende een periode van zeven dagen geïnduceerd; Niettemin, de klinische symptomen waargenomen in deze dieren sterk lijken op die waargenomen bij IBD patiënten (dwz bloederige diarree, gewichtsverlies, epitheliale stoornissen en immuun infiltratie) 10. DSS induceert erosies in de mucosa,waardoor barrière dysfunctie en verhoogde intestinale epitheliale permeabiliteit 11. Het exacte mechanisme blijft onbekend. Echter, een studie suggereert dat DSS interageert met middellange ketenlengte vetzuren tot nano-lipocomplexes die kunnen epitheelcellen voeren en veroorzaken inflammatoire signaalroutes 12 zijn gevormd. In dit artikel beschrijven we in detail hoe colitis wordt geïnduceerd bij muizen en hoe voedingssupplementen via een sonde worden toegepast om een ​​constante dosering van elk dier te garanderen geanalyseerd en hoe de effecten van dergelijke supplementen op verschillende colitis onderzocht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Cinvestav.

1. Bereiding van DSS Drinkwater en de inductie van colitis

  1. Bereid een 3,5% w v dextransulfaat natrium (DSS) oplossing in geautoclaveerd drinkwater /. DSS lost gemakkelijk en het is niet nodig om de uiteindelijke oplossing te filteren.
    LET OP: 7 dagen van de DSS-behandeling induceert ernstige colitis. Als het induceren van milde colitis, 3 - zijn 4 dagen van de behandeling aanbevolen. Zolang de DSS drinkwater helder blijft, is het niet nodig om het water te verversen. Als het echter troebel wordt, moet worden vervangen.
  2. Noteer de basislijn gewicht van mannelijke muizen. Waarborgen dat zij 8-12 weken en binnen een bereik van 21 - 25 g lichaamsgewicht.
    NB: De juiste DSS concentratie moet in elk laboratorium worden geoptimaliseerd. De resultaten kunnen sterk variëren, afhankelijk van de huisvesting. Concentraties tussen 2,5-5% worden gewoonlijk weergegeven sterke c inducerenolitis in C57BL / 6J-muizen WT 10. DSS van verschillende bedrijven en de verschillende percelen moeten worden getest, zoals resultaten kunnen ook variëren met verschillende bronnen van DSS.
  3. Zorg voor water ad libitum en te vervangen door verse 3,5% DSS water indien nodig.

2. De toepassing van voedingssupplementen via een maagsonde

  1. Bereid een "feedable" oplossing van de gewenste voedingssupplementen in een geschikt oplosmiddel. Voor dit onderzoek gebruikten we een mengsel dat 200 mg / kg L-arginine, 83 mg / kg vitamine C, 46 mg / kg vitamine E, 77 mg / kg eicosapentaeenzuur (EPA) en 115 mg / kg docosahexaeenzuur (DHA ) in een 1: 1 oplossing van water en saffloerolie.
  2. Vul een 1 ml spuit verbonden met een sondenaald (15 G x 50 mm) met het voedingssupplement mengsel. Neem de buitenkant van de sondenaald naar elke verbinding buiten de naald te verwijderen en de juiste dosering toepassing te garanderen.
  3. Restrain de muis door grijpen de basis van de staart metanderzijds door een huidplooi stevig vastgrijpen aan de achterkant van de nek met de duim en wijsvinger van de andere hand. Plaats de staart tussen de ringvinger en de basis van de duim van dezelfde hand die de hals bezit.
  4. Met behoud van de muis in een rechtopstaande positie, steek de naald in de linker kant van de mond van het dier en volg het dak van de mond naar de slokdarm te lokaliseren. Als er geen weerstand wordt ondervonden, vooraf de naald in de richting van de maag.
    LET OP: Controleer of het dier goed ademhalen voordat u verder gaat.
  5. Dien het mengsel langzaam, verwijder de buis door langzaam te trekken uit de spuit, en laat de muisknop los. Toepassen voedingssupplementen eenmaal daags sondevoeding tijdens het experiment colitis.

3. Bepaling van de Disease Activity Index

OPMERKING: De ziekteactiviteit index is de combinatie van de scores voor gewichtsverlies, perianale bloeden en ontlasting, die zijn obgehandhaafd dagelijks 13.

  1. Meet het lichaamsgewicht dagelijks en een score van 0 toewijzen 4 volgens het gewichtsverlies percentage (0: 0%, 1: 1-5%, 2: 5-10%, 3: 10 - 20%, en 4> 20 %).
    LET OP: Lichaamsgewicht verlies wordt bepaald door het berekenen van het verschil in percentage tussen de basale gewicht vóór de inductie van DSS-colitis en de werkelijke gewicht.
  2. Om het niveau van perianale bloeden te bepalen, het verzamelen van een frisse krukje monster en gebruik de meegeleverde applicators om een ​​dunne vlek toe te passen op een dia van een guaiacmethode fecal occult bloed test kit. Gebruik een nieuw applicator voor elk monster.
    1. Sluit de klep aan de voorzijde en het raam open aan de achterzijde van de schuif. Breng twee druppels van de ontwikkelaar oplossing voor het terug op het monster locatie.
    2. Lees de resultaten na 30 s. Elk spoor van de blauwe kleur is positief voor occult bloed. Wijs een score van 0 tot 4 (0: geen, 0,5-2,5: positieve guaiacmethode fecal occult bloedtest (afhankelijk van de signaalsterkte) en 3-4: gross bloeden).
      Opmerking: Als er bloed in de ontlasting zichtbaar is, heeft de guaiacmethode fecale occult bloed testen niet te worden uitgevoerd, en een score van 3, 3,5 of 4 is toegewezen, afhankelijk van de hoeveelheid zichtbare bloed.
  3. Bepaal de consistentie van de ontlasting door het observeren van een frisse ontlasting. Wijs een score van 0 tot 4 (0: normaal / vast, 0,5-2,5: pasteus kruk en 3-4: diarree).

4. Het bepalen van intestinale epitheliale permeabiliteit in Vivo van Evans Blue Assay

  1. Verdoven dieren door ze intraperitoneaal injecteren met een mengsel van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (13 mg / kg lichaamsgewicht) verdund in zoutoplossing (0,9% NaCl) en de diepte van de anesthesie bepalen door het bewaken van de kneep terugtrekking reflex.
  2. Plaats de verdoofde dier in liggende positie en uitvoeren van een laparotomie om de ingewanden bloot te leggen.
  3. Zoek de blindedarm en maak een kleine incisie in het proximale segment van de dikke darm eenscendens (idealiter direct naast de blindedarm).
  4. Plaats een voeding naald (G22) en zet deze met een ligatuur met behulp van een gemeenschappelijke zijden draad. Zorgvuldig flush overvloedige PBS door de buis te spoelen alle ontlasting van de dikke darm. Druppelen Evans blauwe oplossing (1,5% w / v in PBS) in de dikke darm tot aan de anus bereikt.
  5. Incubeer de Evans blauw gedurende 15 min. Spoel de kleurstof door het spoelen van de buis met een overvloed aan PBS totdat de perianale wash-out is duidelijk.
  6. Euthanaseren van de dieren door cervicale dislocatie.
  7. Accijnzen de dikke darm en spoel het opnieuw met een overvloed aan PBS. Spoel eenmaal met 1 ml 6 mM N -acetylcysteine in PBS één kleurstof vasthouden aan de dikke slijm elimineren.
  8. Snijd de dikke darm longitudinaal en spoel het nogmaals met PBS en 1 ml 6 mM N -acetylcysteine.
  9. Registreer het gewicht en lengte. De Evans blauwe kleurstof extraheren, plaatst de colon in 2 ml N, N-dimethylformamide gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder zacht agitation. Meet de concentratie kleurstof spectrofotometrisch bij 610 nm.

5. Tissue Collection

  1. Verdoven dieren door ze intraperitoneaal injecteren met een mengsel van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (13 mg / kg lichaamsgewicht) verdund in zoutoplossing (0,9% NaCl) en de diepte van de anesthesie bepalen door het bewaken van de kneep terugtrekking reflex.
  2. Euthanaseren van de dieren door cervicale dislocatie.
  3. Leg de dieren in een liggende positie en uitvoeren van een laparotomie de buikholte bloot.
  4. Met een schaar, ontleden de gehele dikke darm en de lengte opnemen.
  5. Spoel de colon voorzichtig enkele malen met koud PBS om de ontlasting te verwijderen. Registreer het weefselgewicht en voor het volgende experimenten, zoals beschreven in stap 5,6-5,8.
  6. Voor RNA-isolatie en myeloperoxidase (MPO) assays, afgesneden van een geschikte grootte weefselmonster (100 mg is meestal voldoende), plaats deze in een buis, en SNAp invriezen in vloeibare stikstof. Bewaar de weefsels bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
  7. Voor immunofluorescentie kleuring en oxidatieve stress bepaling (zie hieronder), snijd een kleine colon monster (0,5-1 cm) en dompel in kleine aluminium cups gevuld met een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding. Plaats de beker op droog ijs en laat ze langzaam invriezen, om blaasvorming voorkomen. Bevroren weefselmonsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
  8. Voor Zwitserse rollen 14, opent de dikke darm in de lengte en zorgvuldig uitwerpselen te verwijderen met behulp van een tang. Rol het op, met het slijmvlies naar binnen, met behulp van fijne punt pincet of een dunne, ronde houten stok. plaats het voorzichtig in een inbedding cassette en ga verder met stap 6.1.
    OPMERKING: DSS induceert in het colon. Echter, schade verdeling varieert vanaf het proximale tot het distale colon met meeste schade meestal gezien in het distale colon en rectum. Zo adviseren we het analyseren van de histologie, hetzij in de distale colof Zwitserse rollen van de gehele dikke darm.

6. Analyse van Colon Histologie door hematoxyline-eosine kleuring

  1. tissue Voorbereiding
    1. Voor de histologische analyse ofwel dompel de Swiss roll of kleine stukken weefsel uit bepaalde colon gebieden van controle en behandelde muizen in 5 ml 10% formaldehyde gedurende 48 uur bij kamertemperatuur (RT) de juiste fixatie.
      Opmerking: Alle verdere stappen in stap 6 worden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd, tenzij anders aangegeven.
    2. Was ze met kraanwater gedurende 18 uur.
    3. Dehydrateren ze met 15 ml 70% ethanol gedurende 1 uur, 96% in 1 uur, en absolute ethanol gedurende 1 uur. Herhaal elke stap met verse alcohol alvorens over te gaan naar de volgende concentratie.
    4. Blijven de dehydratatie in een mengsel van 7,5 ml absolute ethanol en 7,5 ml absolute xyleen gedurende 1 uur. Eenmaal herhalen alvorens de monsters 15 ml absolute xyleen gedurende 1 uur. Herhaal deze stap een keer met verse xyleen.
  2. Inbedding Colon weefselmonsters in Paraffine
    1. Dompel de monsters in 50 ml vloeibare paraffine gedurende 17 uur. Herhaal deze stap een keer, maar voor slechts 3 uur.
    2. Dompel de monsters in blokjes (plastic, vierkante vorm, afmetingen: 22 x 22 x 22 mm) in 810 ml vloeibare paraffine.
    3. Laat de paraffine het colon weefselmonsters te stollen gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
  3. Snijden Tissue Cross-secties met behulp van een microtoom
    1. Snijd colon monsters met behulp van een microtoom volgens de instructies van de fabrikant, bij een dikte van 5 urn.
    2. Verzamel de bezuinigingen in een waterbad (1 L) met 0,3% gelatine. Dit voorkomt het vouwen van weefsel doorsneden. Recover het weefsel secties en monteer ze op glasplaatjes.
  4. Hematoxyline en eosine kleuring Tissue Doorsneden
    1. Deparaffinize de monsters gedurende 18 uur bij 60 ° C in een incubator. Hiervoor gebruikt u een glas sLiDE-rack met een handvat.
    2. Na deparaffineren, dompel de glaasjes in 70 ml absolute xyleen gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap een keer met verse xyleen.
    3. Breng de monsters in 70 ml absolute alcohol gedurende 1 min. Herhaal deze stap een keer met verse alcohol.
    4. Incubeer de colon weefselmonsters in 70 ml ethanol 96% gedurende 1 min. Herhaal deze stap een keer met verse alcohol.
    5. Was de monsters in leidingwater tweemaal voor 2 s.
    6. Incubeer de weefsels in Harris hematoxyline gedurende 7 min.
    7. Was de monsters in leidingwater tweemaal voor 2 s.
    8. Incubeer de monsters in zure alcohol (70 ml ethanol 70% en 700 ul van 1 M zoutzuur) gedurende 7 s.
    9. Was de monsters in leidingwater tweemaal voor 2 s.
    10. Incubeer de weefselmonsters in 70 ml lithiumcarbonaat (1 g lithiumcarbonaat in 100 ml gedestilleerd water) gedurende 7 s.
    11. Was de monsters in leidingwater tweemaal voor 2 s.
    12. Incubeer de monsters in 70 ml ethanol 80% Gedurende 1 min.
    13. Breng de monsters in 70 ml Eosine-Y gedurende 15 s.
    14. Incubeer ze in 70 ml 96% ethanol gedurende 1 minuut. Herhaal deze stap een keer met verse alcohol.
    15. Incubeer de weefselmonsters in 70 ml absolute ethanol (ethylalcohol absoluut watervrij) gedurende 1 min. Herhaal deze stap een keer met verse alcohol.
    16. Incubeer de monsters in 70 ml van een mengsel van 35 ml absolute alcohol en 35 ml absolute xyleen gedurende 1 min.
    17. Breng de monsters in 70 ml absolute xyleen gedurende 1 min. Herhaal deze stap gedurende 5 minuten in 70 ml verse xyleen absolute.
    18. Voeg 80 ul van kunsthars om de dikke darm weefselmonsters, bedek ze met dekglaasjes, en laat ze drogen gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Tenslotte analyseren van de monsters met behulp bright-field microscopy 8.

7. Analyseren Junction Composition door Immunofluorescentie

  1. Bereid het weefsel zoals beschreven in stap 5.7 en snij 8 urn dikke doorsnedenmet behulp van een cryostaat.
  2. Fix en doorlaatbaar colon doorsneden met 96% ethanol bij -20 ° C gedurende 20 min.
    Opmerking: Alle volgende incubaties dient bij kamertemperatuur uitgevoerd, tenzij anders vermeld, in een vochtige zwart blokje aan drogen en fluorochroom fading voorkomen.
  3. Lucht drogen monsters, en spoel ze 3 keer voor 5 minuten elk met 1x PBS
  4. Incubeer de monsters met blokkeeroplossing (PBS met 0,01% Tween en 2% BSA) gedurende 2 uur.
  5. Verwijder de blokkerende oplossing en was hem met PBS-0,01% Tween gedurende 10 min.
  6. Gedurende deze tijd, de primaire antilichamen verdund tot de gewenste concentraties in PBS-0,01% Tween.
  7. Verwijder de wasoplossing, gelden de antilichaamoplossing uit de vorige stap, en incubeer overnacht bij 4 ° C in een bevochtigde vak.
  8. Verwijder de antilichaamoplossing en was 3 maal met PBS-0,01% Tween gedurende 5 min per keer en met gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten, met zeer zacht schudden.
  9. Tijdens het wassen, centrifuge fluorochromeconjugated, species-specifieke secundaire antilichamen bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  10. Verdun de secundaire antilichamen zonder precipitaten zoals aangegeven door de aanbieder in PBS-0,01% Tween, toepassen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  11. Herhaal stap 7.8 en verwijder de wasoplossing zo volledig mogelijk.
  12. Pipet 4 ul van anti-fading middel gedurende elk monster op de dia.
  13. Bedek de monsters met een dekglaasje.
  14. Lucht drogen gedurende 1 uur.
  15. Seal glijbaan met nagellak. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot verdere analyse.
  16. Analyseren op een confocale laser microscoop 8.

8. Bepaling van oxidatieve stress door oxidatie van Ethidium

  1. Na 7 dagen DSS colitis, bereid weefsel zoals beschreven in stap 5.7 en snijd dikke secties in een cryostaat met een dikte van 5 urn. Mount dwarsdoorsneden op objectglaasjes behandeld met poly-L-lysine-oplossing en incubeer de monsters with 5 uM dihydroethidium (DHE) in water bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
  2. Was de monsters met PBS (pH 7,6) drie keer gedurende elk 15 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur. Lucht droog de samples op een druppel montage medium om de fluorescentie te beschermen. Let op de fluorescentie van geoxideerde ethidium op een laser-scanning confocale microscoop (40X vergroting, 568 nm golflengte).

9. Analyse van de rekrutering van leukocyten door MPO Assay

  1. Na 7 dagen DSS colitis, verzamelen darmweefsel en homogeniseer de monsters (200-400 mg) met 1 ml hexadecyltrimethylammoniumbromide (HTAB) buffer (0,5% HTAB in 50 mM fosfaatbuffer, pH 6,0) onder toepassing van een homogenisator op ijs.
  2. Spoel de buitenzijde van de homogenisator tweemaal met 1 ml buffer HTAB alle weefsels in het lysaat onder ultrasone trillingen en vijf keer bij 40% amplitude gedurende 10 s elk. Vries-dooi in vloeibare stikstof drie keer.
  3. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 minuten en verzamel de supernatant.Bereid 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) -oplossing (ABTS) door mengen ABTS, 5 ml natriumcitraat (1 M in water), 0,1 ml waterstofperoxide en 45 ml bi -gedistilleerd water.
  4. Meng 0,1 ml van elk supernatant met 0,1 ml ABTS oplossing in een 96-well platbodem platen. Na 10 min, meet de absorptie bij 460 nm met een spectrofotometer.

10. Het evalueren van de expressie van pro-inflammatoire cytokines door PCR

  1. tissue homogenisering
    1. Homogeniseer 50 tot 100 mg colon weefselmonsters in 1 ml van een zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform mengsel met een vermogen homogenisator.
    2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
  2. fasescheiding
    1. Voeg 0,2 ml chloroform en schud krachtig gedurende 30 s.
    2. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    3. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C.
    4. Breng de Upper waterige fase in een nieuwe buis (~ 500 pi).
  3. RNA Neerslag en Resuspension
    1. Voeg 0,5 ml isopropylalcohol en incubeer de monsters bij 4 ° C gedurende 60 minuten.
    2. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
    3. De bovenstaande vloeistof volledig.
    4. Voeg 1 ml ethanol 75% en vortex.
    5. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
    6. Verwijder het supernatant.
    7. Laat de resterende ethanol aan de lucht drogen gedurende 3-5 min.
      NB: Het is belangrijk om niet te laten de RNA pellet volledig opdrogen, omdat deze sterk zijn oplosbaarheid zal afnemen.
    8. Re-ontbinding van de pellet in 0,3 ml diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water. Onmiddellijk transcriberen de RNA-monsters in cDNA (meer stabiel, zie stap 10.5) of op te slaan bij -80 ° C.
  4. RNA kwantificering
    1. Verdun 1 pi van RNA met 99 pl met DEPC behandeld water.
    2. Lees The OD bij 260 nm en 280 nm met een UV / VIS spectrofotometer monsterconcentratie en zuiverheid te bepalen.
  5. cDNA Synthesis
    1. Meng RNA monsters (1-5 ug) met 1 pl Oligo (dT) 12-18 (0,5 ug / ul) en DEPC-behandeld water (totaal volume 12 ui) in RNase-vrij steriele buizen.
    2. Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
    3. Voeg 2 ui 10X PCR buffer, 1 pl 50 mM MgCl2, 1 pl 10 mM dNTP mix en 2 pl 0,1 M dithiothreitol (DTT).
    4. Incubeer bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
    5. Voeg 1 pl reverse transcriptase en incubeer bij 42 ° C gedurende 5 minuten.
    6. Incubeer bij 70 ° C gedurende 15 minuten.
    7. Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten. cDNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik.
  6. PCR
    1. Meng 2,5 ui 10X PCR buffer, 1,5 pl 25 mM MgCl2, 0,5 pl van 10 mM dNTP mix, 0,25 μL Taq DNA polymerase, 0,25 pl van elke primer (10 uM) en cDNA (100 ng) en steriel water tot een totaal volume van 25 ul.
    2. Run de monsters op een 96-well thermische cycler. Om amplificatie van genoom-DNA te voorkomen, voorwaartse en achterwaartse primers moeten worden gevestigd in verschillende exons: IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT en IL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT; IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA en IL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC; KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT en KC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA; en actine-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT en actine-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: 95 ° C gedurende 5 min gevolgd door 30 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s, 58 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s, en een laatste verlenging van 10 min bij 72 ° C .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dieet supplementen kan beschermen tegen DSS Colitis

Anti-inflammatoire en anti-oxidatieve voedingssupplementen, zoals vitamine C, vitamine E, stikstofoxide (NO) -source L-arginine en ω3-meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA-ω3), zijn gebruikt met wisselend succes dieren modellen tekenen van ontstekingsziekten 3,6,15 verlichten. Ondervoeding, oxidatieve stress, en de productie van pro-inflammatoire cytokines kunnen acu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met het oog op voedingssupplementen in klinische studies te gebruiken, moeten de voordelen en de veiligheid van dergelijke supplementen zorgvuldig worden geëvalueerd in vivo in dierstudies. Bij colitis, hebben meerdere geschikte diermodellen de klinische symptomen van IBD lijken vastgesteld, waaronder chemische modellen met DSS, TNBS of azijnzuur; knock-out (KO) modellen zoals IL10-KO; en immuun-cell-mediated colitis gebruik van adoptieve T-cel overdracht 19-21. De DSS model van colitis is een snelle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Mexicaanse Raad voor Wetenschap en Technologie (Conacyt, 207.268 en 233.395 aan Michael Schnoor). KFCO is een ontvanger van een Conacyt stipendium (396.260) om een ​​MSc-diploma te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.3% van gelatine Bioxon158
10% formaldehydeJ.T. Baker2106-03
96-well plate met platte bodemCorning3368
Absolute ethanol J.T. Baker9000-03
Absoluut xyleenJ.T. Baker9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
RundserumalbumineSigma-Aldrich9048-46-8
ColoScreenHelena Laboratories5072
Corabion (Vriendelijk verstrekt door Merck, Naucalpan, Mexico)Merck
Dextraansulfaat natriumzoutAffymetrix9011-18-1(M.W. 40.000-50.000)
DihydroethidiumLife TechnologyD11347
Eosine-Y J.T. BakerL087-03
Evans blauwSigma-Aldrich314-13-6
VoedingsnaaldCadence Science Inc.9921
Glazen schuiflade met handgreepElectron Microscopy70312-16
Glazend glasCorning2947
Harris hematoxylinen Sigma-AldrichH3136
Hexadecyltrimethyammonium (HTAB)Sigma AldrichH6269
Histosette (inbeddingscassette)SimportM498.2
Zoutzuur 1 MJ.T. Baker9535-62
WaterstofperoxideSigma AldrichH3410
KetaminePiSA AgropecuariaQ-7833-028
Vloeibare paraffine Paraplast39501-006
Lithiumcarbonaat Sigma-Aldrich2362
N,N-dimethylformamideJ.T. Baker68-12-2
N-acetylcysteïneSigma-AldrichA9165
Kunststof kubussenElectron Microscopy70181
Poly-L-lysine oplossingSigma-Aldrich25988-63-0
Prism 5 statistische softwareGraphPad SoftwarePrism 5
Zoutoplossing 0,9% NaClCS PiSAQ-7833-009
NatriumcitraatSigma-AldrichW302600
Kunsthars Poly Mont7987
Taq DNA polymeraseInvitrogen11615-010
Tissue-tek. O.C.T CompoundSakura Finetek4583
Tuberculine spuitBD Plastipak305945
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium met DAPIVector LaboratoriesH-1200
XylazinPiSA AgropecuariaQ-7833-099

Referenties

  1. Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 13-27 (2016).
  2. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
  3. Neuman, M. G., Nanau, R. M. Inflammatory bowel disease: role of diet, microbiota, life style. Transl Res. 160, 29-44 (2011).
  4. Lowenberg, M., D'Haens, G. Next-Generation Therapeutics for IBD. Current Gastroenterol Rep. 17, 21(2015).
  5. Bernstein, C. N. Does everyone with inflammatory bowel disease need to be treated with combination therapy. Curr Opin Gastroenterol. , (2016).
  6. Nanau, R. M., Neuman, M. G. Nutritional and probiotic supplementation in colitis models. Dig Dis Sci. 57, 2786-2810 (2012).
  7. Yamamoto, T. Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol. 29, 216-221 (2013).
  8. Vargas Robles, H., et al. Experimental Colitis Is Attenuated by Cardioprotective Diet Supplementation That Reduces Oxidative Stress, Inflammation, and Mucosal Damage. Ox Med Cell Longev. , 8473242(2016).
  9. Vargas-Robles, H., Rios, A., Arellano-Mendoza, M., Escalante, B. A., Schnoor, M. Antioxidative diet supplementation reverses high-fat diet-induced increases of cardiovascular risk factors in mice. Ox Med Cell Longev. 2015, 467471(2015).
  10. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  11. Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr. Protoc. Immunol. 104, Unit 15 25(2014).
  12. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, 32084(2009).
  13. Mennigen, R., et al. Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 1140-1149 (2009).
  14. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
  15. Shen, W., Gaskins, H. R., McIntosh, M. K. Influence of dietary fat on intestinal microbes, inflammation, barrier function and metabolic outcomes. J Nutr Biochem. , (2013).
  16. Bruewer, M., et al. Interferon-gamma induces internalization of epithelial tight junction proteins via a macropinocytosis-like process. FASEB J. 19, 923-933 (2005).
  17. Fournier, B. M., Parkos, C. A. The role of neutrophils during intestinal inflammation. Muc Immunol. 5, 354-366 (2012).
  18. Yan, Y., et al. Temporal and spatial analysis of clinical and molecular parameters in dextran sodium sulfate induced colitis. PLoS One. 4, 6073(2009).
  19. Maxwell, J. R., Viney, J. L. Overview of mouse models of inflammatory bowel disease and their use in drug discovery. Curr Prot Pharmacol, S.J. Enna. , Chapter 5, Unit 5.57 (2009).
  20. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 135-146 (2009).
  21. Randhawa, P. K., Singh, K., Singh, N., Jaggi, A. S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Kor J Physiol Pharmacol. 18, 279-288 (2014).
  22. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). JoVE. , (2010).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Prot. 2, 541-546 (2007).
  24. Naydenov, N. G., et al. Nonmuscle Myosin IIA Regulates Intestinal Epithelial Barrier in vivo and Plays a Protective Role During Experimental Colitis. Sci Rep. 6, 24161(2016).
  25. Sumagin, R., Robin, A. Z., Nusrat, A., Parkos, C. A. Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 to regulate the epithelial barrier and neutrophil recruitment. Muc Immunol. 7, 905-915 (2014).
  26. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
  27. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 360(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DSS colitismodeltoediening van voedingssupplementenintestinale epitheliale permeabiliteitanalyse van oxidatieve stresshistologische beoordelingEvans Blue extractieconfocale microscopiehematoxyline eosin kleuringziekteactiviteitsindexmeting van colonlengte

Gerelateerde artikelen