Murine full-dikte van de huid transplantatie is een gevestigde model om afstoting te studeren in een alloimmuun setting. Hier bieden we een tutorial van elke stap die betrokken zijn bij het uitvoeren van een BALB / c -> C57BL / 6 full-dikte van de huid transplantatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Murine volledige dikte van de huid Transplantation
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Murine volledige dikte huidtransplantatie is een gevestigde in vivo model om allo respons en transplantaatafstoting bestuderen. Ondanks de beperkte toepassing voor mensen, is huidtransplantatie bij muizen grote schaal toegepast voor transplantatie onderzoek. De procedure is eenvoudig te leren en uit te voeren, en het vereist geen delicate microchirurgische technieken, noch uitgebreide training. Bovendien transplantaatafstoting in dit model wordt op een zeer reproduceerbare immunologische reactie en wordt gemakkelijk gevolgd door directe inspectie en palpatie. Bovendien kunnen secundaire huidtransplantatie met donor gematched of skin derden grafts uitgevoerd complexere transplantatie modellen als alternatief en eenvoudige methode om donor-specifieke tolerantie te bepalen. De complicaties zijn laag en zijn over het algemeen beperkt tot anesthesie overdosering of ademhalingsproblemen na de ingreep. Transplantaatfalen, daarentegen, komt vaak voor als gevolg van slechte voorbereiding van de grachterschip, onjuiste positionering in het transplantaat bed, of onjuiste plaatsing van de bandage. In dit artikel presenteren we een protocol voor volledige dikte huidtransplantatie bij muizen en beschrijf de belangrijke stappen die nodig zijn voor een succesvolle procedure.
Inleiding
Orgaantransplantatie is de behandeling van keuze voor patiënten met eindstadium orgaanfalen en resultaten zijn opmerkelijk verbeterd met vooruitgang in chirurgische procedures en immunosuppressie protocollen. Echter langdurige immunosuppressie gepaard met significante bijwerkingen, en de ontwikkeling van nieuwe strategieën verdraagzaamheid blijft het doel van de moderne transplantatieonderzoek.
Talrijke diermodellen zijn ontwikkeld voor basisonderzoek bij transplantatie, de mechanismen van transplantaatafstoting bestuderen en te testen immunosuppressie benaderingen voor het voorkomen van transplantaat afstoting en voor de bevordering van tolerantie op lange termijn 1-3. Muismodellen hebben de steunpilaar van immunologisch onderzoek geworden als gevolg van de exclusieve en ruime beschikbaarheid van diagnostische en therapeutische antilichamen en goed gedefinieerde inteelt en transgene stammen. Huidtransplantatie is een eenvoudige procedure die niet vereist speciale vaardigheden en kan microchirurgischegemakkelijk postoperatief gevolgd. Bij elkaar genomen, heeft de muis huidtransplantatie een uitzonderlijk hulpmiddel om vele aspecten die betrokken zijn bij de alloimmuun reactie, met inbegrip van antigeen-afgifte, mobiele handel, en weefsel tijdens afstoting van 4,5 te bestuderen.
Hier tonen we de stap-voor-stap procedure voor full-thickness huidtransplantatie met het muismodel en we de belangrijke stappen die nodig zijn voor een succesvolle implantatie van de getransplanteerde huid beschrijven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van het National Institute of Health (NIH) en werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Dierverzorging en gebruik Comite (JHUACUC). De specifieke procedures werden uitgevoerd in het kader van de goedgekeurde ACUC protocollen MO13M292 en MO13M370.
1. donorhuid Harvest
- Verdoven van de donor muis met isofluraan (inductie vaporizer op 4%, het onderhoud op 1-2% door middel van de muis kegel). Gebruik de teen knijpen terugtrekking reflex om de diepte van de anesthesie te controleren.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scheren de achterkant van het dier en gedesinfecteerd met 10% povidonjood (bijvoorbeeld Betadine).
- Met steriele scharen, handschoenen en aseptisch oogst donor rugvel van de heup tot de nek, met stompe dissectie ter hoogte van de areolar bindweefsel.
- Euthanaseren het dier door cervicale dislocatie na het oogsten van dehuid transplantatie.
- Onder een microscoop, scheiden het bindweefsel, vetweefsel en panniculus carnosus het rugvel met behulp van fijne schaar tenotomie. De panniculus carnosus is een dunne, transparante spieren die verantwoordelijk zijn voor de huid trillen bewegingen.
- Met behulp van steriele instrumenten techniek, uitgesneden 15 mm x 15 mm transplantaten van de rug huid voor een 10-mm x 10 mm tot 15 mm x 15 mm graft bed.
- Bewaar de grafts gazen gedrenkt met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaal op ijs.
LET OP: 8-10 enten kan worden verkregen van één donor muis.
2. Ontvanger Skin Transplant
- Verdoven van de ontvanger muis met isofluraan (inductie vaporizer op 4%, het onderhoud op 1-2% door middel van de muis kegel). Gebruik de teen knijpen terugtrekking reflex om de diepte van de anesthesie te controleren.
- Dien 0,02 mg / kg lichaamsgewicht van buprenorfine voor postoperatieve pijnbestrijding.
- Scheer de zijkant van de rug van het dier wanneer het transplantaat will zijn geplaatst en desinfecteren met 10% povidonjood.
- Met een schaar, snijd een 10-mm x 10 mm tot 15 mm x 15 mm vierkant van de huid. Het defect maat zal iets groter (10%) dan de conduit. Snijd zo oppervlakkig mogelijk te maken. Zorg ervoor dat de panniculus carnosus en vaten te bewaren. De panniculus carnosus kan onderscheiden van de onderliggende fascia door zijn mobiliteit en de bloedvaten die oppervlakkig om het uit te voeren zijn.
- Plaats het transplantaat op het transplantaat bed, het vermijden van plooien langs de randen.
- Plaats 8 hechtingen op de hoeken en het midden van elke rand. Voor elke hechtdraad, passeren de naald door het transplantaat en vervolgens door de panniculus carnosus van het transplantaat onder de omliggende ontvanger huid bed.
- Verwijder de verdoving masker en laat het dier gedeeltelijk te herstellen van de anesthesie alvorens de pleister.
- Wikkel de ontvanger muis in een pleister met gevouwen gaasje op het transplantaat. Maak het verband door twee verbanden, snijdende kleeflaag van een en twee absorberende kussens elkaar te zetten.
- Controleer de muis nauw gedurende herstel te verzekeren dat het verband niet beperkt thorax excursie en ademhaling. Verwijder de bandage als de ademhalingsfrequentie afneemt of het dier begint te hijgen of adem oppervlakkig.
3. postoperatieve zorg
- Dien enrofloxacine 5 mg / kg na de operatie voor infectie profylaxe.
- Plaats de getransplanteerde muis in een schone kooi over een microwavable verwarming pad totdat deze volledig herstelt van anesthesie.
- Let op de muis gedurende 1 uur na de operatie voorafgaand aan de terugkeer naar de behuizing faciliteit.
- Zeven dagen na de operatie, verdoven muizen als in stap 2,1. Verwijder de bandage slechts snijden door de ventrale zijde van het verband.
- Observeren en te betasten het transplantaat op de volgende dag op tekenen van korstvorming, contractie, of hardheid. Indien aanwezig, het transplantaat mogelijk niet correct vasculariza bereikttie en moet worden beschouwd als een technische storing.
- dagelijks controleren op tekenen van afstoting. Overweeg enten afgewezen wanneer ≥90% van het transplantaat weefsel wordt necrotische.
- Euthanaseren de afgekeurde dieren en oogsten ze voor analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De plaatsing van de pleister op de ontvanger muis is een belangrijke stap van de procedure. Het huidtransplantaat wordt op de ontvangende stam, tussen de schouder, heup en wervelkolom (figuur 1). Het verband bestaat met gevouwen gaas en de combinatie van twee plastic pleisters. De ontvanger muis ligt met het transplantaat naar beneden over het gaas in het midden van het verband. Via twee gebogen micro pincet, wordt het ondereinde van de eerste bandage getrokken, en dan d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Sinds de introductie van Medawar, eerst in menselijke studies en bij konijnen en muizen is huidtransplantatie een waardevol model voor de studie van allogene immune responsen 6,7 geweest. In dit manuscript presenteren we een model van grootschalige, niet-gevasculariseerd, full-thickness huidtransplantatie met de bovenste en onderste rugvel. Diverse alternatieve werkwijzen, inclusief het gebruik van de staart huid of oorhuid van de muis als graft bronweefsel, zijn tot op heden 8,9. Deze modellen pre...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidie R01AI077610.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Verkrijgbaar bij de apotheek | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA-nummer vereist; verkrijgbaar bij de ziekenhuisapotheek | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
Referenties
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. , (2008).
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724(2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495(2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
