Method Article

Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit manuscript beschrijven we eerst de vervaardiging protocol van een microfluïdische chip met goud dots en fibronectine gecoate gebieden op hetzelfde glassubstraat, dat het genereren van tandem bellen en individuele cellen buurt patroon met goed gedefinieerde locaties en vormen nauwkeurig regelt. Vervolgens tonen de vorming van luchtbellen tandem door twee lasers verlichten van een paar gouden stippen met enkele microseconde vertraging. We visualiseren de bubble-bubble interactie en de vorming van jet door high-speed imaging en karakteriseren van de resulterende stroom veld met behulp van particle image velocimetry (PIV). Tenslotte geven we een aantal toepassingen van deze techniek voor enkele cel analyse, inclusief celmembraan poratie met macromolecuul opname gelokaliseerde deformatie membraan bepaald door de verplaatsingen van de bijgevoegde integrine-bindende kralen en intracellulair calcium reactie van ratiometrische beeldvorming. Onze resultaten tonen aan dat een snelle en gerichte jetting stroming progeproduceerd door de tandem bubble interactie, die een sterk gelokaliseerde schuifspanning kunnen opleggen aan het oppervlak van een cel gekweekt in de nabijheid. Bovendien kunnen er verschillende bioeffects worden geïnduceerd door het veranderen van de sterkte van de stroming jetting door instelling van de afstandsmeting van de cel tandem bubbels.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een groeiend besef dat de cellulaire heterogeniteit, die voortvloeien uit de stochastische expressie van genen, eiwitten en metabolieten, bestaat binnen een grote cel populatie en dient als een fundamenteel principe in de biologie mogelijk te maken voor mobiele aanpassing en evolutie 1. Daarom is het vaak onnauwkeurig en onbetrouwbaar populatie gebaseerde bulk metingen gebruiken om de functie van individuele cellen en hun interacties te begrijpen. Ontwikkeling van nieuwe technologieën eencellige analyse is daarom van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek en kan worden gebruikt, bijvoorbeeld om beter de sleutel signaalwegen en process....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microfabricage

LET OP: Alle microfabrication procedures worden uitgevoerd in een cleanroom. Een chromen masker is ontworpen voor de microfabrication, zie figuur 2.

figure-protocol-1
Figuur 2: Schematische voorstelling van het kanaal ontwerp in de microfluïdische chip en de afmetingen van de werkeenheden. a) Masker ontwerp van de uitgelijnde PDMS microkanalen (groen) en de patronen op het glassubstraat (blauw en rood). b) vergrote afbeeldin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De microfluïdische platform in dit werk beschreven kan worden gebruikt voor bubble bubble-interacties te onderzoeken en een verscheidenheid aan cavitatie geïnduceerde bioeffects analyseren bij de enkele-celniveau. Hier presenteren we een aantal voorbeelden van verschillende experimentele studies en bioassays die kunnen worden uitgevoerd in ons experimenteel systeem te demonstreren. We zullen eerst illustreren de voorbijgaande interacties van tandem bubbels met de straalvorming, de visual.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eencellige analyse, in combinatie met live-cell imaging, is sterk verbeterd ons begrip van de dynamische en vaak variabele processen in afzonderlijke vakken, zoals fenotype ontwikkeling en immuunrespons 23. In tegenstelling tot de conventionele celkweek in schotels of flacons, microfluïdische systemen maken nauwkeurige regeling van de micro-omgeving naar de enkelvoudige-celniveau, in real time. Bijgevolg, de vooruitgang in microfluïdische technologie en technieken zijn grotendeels de doorvoer en reproduceerba.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We would like to acknowledge the use of the clean room facility SMIF at Duke University. We also want to thank Hao Qiang for his assistance in measuring the jet velocity. The authors thank Todd Rumbaugh of Hadland Imaging for providing the Shimadzu HPV-X camera used in this study.The work was funded in part by NIH through grants 5R03EB017886-02 and 4R37DK052985-20.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Materials
75 mm x 38 mm Plain Microscope SlidesCorning2947-75X38
AcetoneSigma Aldrich, Co.320110ACS reagent, ≥99.5%
Isopropyl alcoholSigma Aldrich, Co.W292907≥99.7%, FCC, FG
Sulfuric acidSigma Aldrich, Co.320501ACS reagent, 95.0-98.0%
Hydrogen peroxideSigma Aldrich, Co.21676330 wt.% in H2O
Primer P-20MicrochemMCC Primer 80/20
NFR photoresistJSRNFR016D2
PhotomaskPhotoplotstoreN/A4x4 Direct write mask
MF-319 DeveloperShipley (Rohm and Haas)Microposit MF-319
1165 Photoresist RemoverDow Chemical, Co.DEM-100180731-methyl-2-pyrrolidinone based
S1813 photoresistShipley (Rohm and Haas)S1813
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Paraffin filmHACH251764
SU-2025 photoresistMicrochemSU-2025
PDMSDow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Microbore TubingSaint-Gobain PPL Corp.S-54-HL
Metal pinsNew England Small TubeNE-1300-01Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long
HeLa cellsDuke Cell Culture Facility(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) bufferThermoFisher Scientific14190144
DMEM culture mediumThermoFisher Scientific11995065
Fibronectin Bovine Protein, PlasmaThermoFisher Scientific33010018
0.25% Trypsin-EDTA (1x)ThermoFisher Scientific25200056
Propidium IodideThermoFisher ScientificP21493
Carboxylate Microspheres 1.00 μmPolysciences, Inc08226-15
Carboxylate Microspheres 2.00 μmPolysciences, Inc18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)ThermoFisher Scientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)24510
Peptite-2000Advanced BioMatrix5020-5MG
FITC Annexin VThermoFisher ScientificA13199
Fura-2, AMThermoFisher ScientificF1221
DMSOSigma Aldrich, Co.D2650
F-127invitrogenP68660.2 µm filtered (10% Solution in Water)
Reduced serum media ThermoFisher Scientific11058021
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Plasma asherEmitechK-1050XO2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials
Mask alignerSUSS MicroTec Karl Suss MA6/BA6
E-beam evaporatorCHA IndustriesCHA Industries Solution E-Beam
RIETrion Technology Trion Technology Phantom II(oxide/ nitride/ polymer) etching
StereoscopeAmScopeAmerican Scope SM-4TZ-FRLStereo Microscope
Syringe pumpChemyx IncNanoJet
Cell culture incubatorNuAireAutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator
Biological Safety CabinetsNuAireNU-425-400
Water bathVWR1122s
CentrifugeIECCentra CL2
MicroscopeZeissAxio Observer Z1
Nd:YAG laser  (laser 1)New Wave ResearchTempest
Nd:YAG laser  (laser 2)New Wave ResearchOrion
Delay generatorBerkeley Nucleonics BNC 565-8c
Flash lampDyna-LiteML1000 fiber-coupled flashtube
high speed cameraDRS Hadland Imacon 200
high speed  cameraShimadzuHPV-X
high speed cameraVision ResearchPhantom V7.3
PIV softwareLaVisionDaVis 7.2
cameraZeissAxioCam MRc 5
softwareZeissAxioVision
PTI systemHoribaS/N: 1705 RAM-X
EasyRatio softwareHoribaEasy Ratio Pro 2version 2.3.125.86
63× objectiveZeissLD Plan Neofluar

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic SystemSurface PatterningCavitation BubbleTandem BubblesSingle Cell AnalysisHigh Speed ImagingParticle Image VelocimetryCell Membrane PorationIntracellular Calcium ResponseGold Dot Patterning

Related Articles