Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

Summary

Een microfluïdische chip werd vervaardigd om paren gouden stippen te produceren voor tandem bubbeltjesgeneratie en fibronectine-gecoate eilandjes voor nabijgelegen single-cel patterning. Het resulterende stromingsveld werd gekenmerkt door deeltjesbeeldsnelheidsmeting en werd gebruikt om verschillende bioeffecten te bestuderen, waaronder celmembraan poratie, membraanvervorming en intracellulaire calciumrespons.

Abstract

In dit manuscript beschrijven we eerst de vervaardiging protocol van een microfluïdische chip met goud dots en fibronectine gecoate gebieden op hetzelfde glassubstraat, dat het genereren van tandem bellen en individuele cellen buurt patroon met goed gedefinieerde locaties en vormen nauwkeurig regelt. Vervolgens tonen de vorming van luchtbellen tandem door twee lasers verlichten van een paar gouden stippen met enkele microseconde vertraging. We visualiseren de bubble-bubble interactie en de vorming van jet door high-speed imaging en karakteriseren van de resulterende stroom veld met behulp van particle image velocimetry (PIV). Tenslotte geven we een aantal toepassingen van deze techniek voor enkele cel analyse, inclusief celmembraan poratie met macromolecuul opname gelokaliseerde deformatie membraan bepaald door de verplaatsingen van de bijgevoegde integrine-bindende kralen en intracellulair calcium reactie van ratiometrische beeldvorming. Onze resultaten tonen aan dat een snelle en gerichte jetting stroming progeproduceerd door de tandem bubble interactie, die een sterk gelokaliseerde schuifspanning kunnen opleggen aan het oppervlak van een cel gekweekt in de nabijheid. Bovendien kunnen er verschillende bioeffects worden geïnduceerd door het veranderen van de sterkte van de stroming jetting door instelling van de afstandsmeting van de cel tandem bubbels.

Introduction

Er is een groeiend besef dat de cellulaire heterogeniteit, die voortvloeien uit de stochastische expressie van genen, eiwitten en metabolieten, bestaat binnen een grote cel populatie en dient als een fundamenteel principe in de biologie mogelijk te maken voor mobiele aanpassing en evolutie ^1. Daarom is het vaak onnauwkeurig en onbetrouwbaar populatie gebaseerde bulk metingen gebruiken om de functie van individuele cellen en hun interacties te begrijpen. Ontwikkeling van nieuwe technologieën eencellige analyse is daarom van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek en kan worden gebruikt, bijvoorbeeld om beter de sleutel signaalwegen en processen stamcel biologie en kankertherapie ^2-4. De laatste jaren heeft de opkomst van microfluïdische platforms aanzienlijk vergemakkelijkt single-cell analyse, waarbij de positionering, behandeling en observatie van de reactie van individuele cellen uitgevoerd met nieuwe analysestrategieën ^5.

Cavitatie speelt een belangrijke rol in een brede waaier van biomedische toepassingen, met inbegrip van de behandeling van kankers door high-intensity focused ultrasound (HIFU) ^6, de non-invasieve versnippering van nierstenen door schokgolf lithotripsy (SWL) ^7, geneesmiddel of gentherapie door sonoporatie ^8, en de onlangs gerapporteerde vernietiging van cellen of weefsels door hydrodynamische cavitatie zeepbel ^9,10. Desondanks hebben de dynamische processen van cavitatiebel (s) interactie met biologisch weefsel en cellen niet goed begrepen. Dit komt door de willekeur cavitatie initiatie en beldynamica door ultrageluid, schokgolven en plaatselijke hydraulische druk; bovendien is er een gebrek aan technieken waarmee de inherent complexe en snelle reacties van biologische cellen te lossen, vooral bij de enkele-celniveau.

Vanwege deze problemen, is het niet verwonderlijk dat heel weinig studies hebben been gemeld aan bubble-cel interacties onder goed gecontroleerde experimentele omstandigheden te onderzoeken. Bijvoorbeeld membraan perforeren van afzonderlijke cellen in suspensie gevangen ¹¹ en de impulsieve grote deformatie van rode bloedcellen humane ¹² aangetoond met behulp van laser opgewekte interne bellen in microkanalen. Deze laatste techniek is echter, kan slechts zeer geringe vervorming in eukaryotische cellen door de aanwezigheid van de kern ^13. Bovendien is het moeilijk om downstream bioeffects controleren bij de behandeling van cellen in suspensie. In andere studies is ultrasone excitatie van een celgebonden microbelletjes (of ultrageluid contrastmiddel) voor het membraan poratie en / of intracellulair calcium reacties in één hechtende cellen gerapporteerd ^8. Membraan perforeren van één hechtende cellen kunnen ook worden geproduceerd door laser gegenereerde tandem bellen in een dunne vloeistoflaag die lichtabsorberende trypan blauwe oplossing ¹⁴ ofdoor een oscillerende gasbel gegenereerd door microseconde laserpulsen bestralen door middel van een optisch absorberende substraat in 'counter ^15. In vergelijking, de optisch absorberende substraat heeft een voordeel ten opzichte van de laser-absorberende trypan blauwe oplossing omdat deze is giftig voor cellen. Wat nog belangrijker is, laser-gegenereerde bubbels zijn beter controleerbaar in termen van de zeepbel van de grootte en locatie dan akoestisch opgewonden bubbels. Niettemin, in al deze eerdere studies, de cel vorm, oriëntatie en adhesie omstandigheden werden niet gecontroleerd, die in hoofdzaak de cel respons en bioeffects geproduceerd door mechanische spanningen ¹⁶ kan beïnvloeden.

Deze nadelen in eerdere studies overwinnen, hebben we onlangs ontwikkelde een experimenteel systeem voor vorming van belletjes, cel patronen, bel-bel-cel interacties en real-time bioassays van celrespons in een microfluïdische chip geconstrueerd door een unieke combinatie van microfabricage techniques. Drie belangrijke kenmerken die ons experimenteel systeem te onderscheiden van anderen in het gebied zijn: 1) de patroonvorming van microscopisch kleine gouden stippen op het glassubstraat gelokaliseerde laser absorbeert, vorming van belletjes ¹⁷ mogelijk te maken; 2) de patroonvorming van microscopisch kleine eilanden extracellulaire matrix (ECM) voor celhechting op hetzelfde substraat aan zowel de locatie en de vorm van individuele cellen te controleren; en 3) het samenpersen van de afmeting van de bel-bel-celinteractie domein van 3D naar een quasi-2D speelt in het vlak visualisatie van bubble-bubble interacties te vergemakkelijken, spuiten stroomvelden, celvervorming en bioeffects, alle meegenomen in een gestroomlijnde beeldvorming sequentie (figuur 1d).

Figuur 1: De microfluïdische chip en schema's van verschillende assays. a) een samengestelde microfluïdische chip met kanalen gevuld met blauwe inkt voor visualisatie. b) Een regio binnen de microfluïdische chip met gevormde cellen en gouden stippen (de afstand tussen de twee gouden stippen in de nabijheid is 40 pm). Vele paren werkeenheden kunnen worden aangebracht in een kanaal. c) Close-up beeld van een enkele werkeenheid die bestaat uit een paar gouden stippen en een HeLa cel gehecht aan het cel-patronen regio. d) Schema van de bedieningsinrichting. Een enkele cel hecht aan en zich in het "H" -vormige eiland bedekt met fibronectine. Een paar cavitatiebubbels (tandem bubble) met tegenfase trilling worden geproduceerd door verlichten gepulste laserstralen op de gouden stippen (zie figuur 4a), wat leidt tot de vorming van een snelle en gelokaliseerde jet naar de beoogde cel buurt. De cel kan worden vervormd nomen voor macromoleculaire opname en / of gestimuleerd met calcium respons, afhankelijk van de afstandsmeting _(Sd) van de cel om de tandem bubble.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit platform kan verder gecombineerd worden met fluorescentie- assays en gefunctionaliseerde kralen bevestigd aan het celoppervlak voor cavitatie geïnduceerde bioeffects. Vooral dit platform schept voor betrouwbare en kwantificeerbare assays bij de enkele-celniveau. Tot nu toe hebben we de inrichting voor de analyse van tandem bubble-geïnduceerde celmembraan vervorming cel poratie en intracellulaire opname, levensvatbaarheid, apoptose en intracellulair calcium respons. In de onderstaande voorschriften beschrijven we het proces-chips en de procedure voor het analyseren van verschillende bioeffects bovengenoemde. Bovendien worden de bewerkingen van de chip ook beschreven.

Protocol

1. Microfabricage

LET OP: Alle microfabrication procedures worden uitgevoerd in een cleanroom. Een chromen masker is ontworpen voor de microfabrication, zie figuur 2.

Figuur 2: Schematische voorstelling van het kanaal ontwerp in de microfluïdische chip en de afmetingen van de werkeenheden. a) Masker ontwerp van de uitgelijnde PDMS microkanalen (groen) en de patronen op het glassubstraat (blauw en rood). b) vergrote afbeelding van het masker ontwerp in een representatief deel van de werkende unit arrays. c) Schematische voorstelling van een werkeenheid die een cel patroon (blauw) en een paar gouden stippen (rood). Alle lengteschalen worden getoond op de rechts onderaan. Klik hier om een LAR bekijkenger versie van deze figuur.

1. Gold dot patroonvorming
   Opmerking: Het gebied van elk punt goud is ontworpen om binnen 25-30 urn ^2, zodat deze groot genoeg is om laserenergie absorberen vorming van belletjes, maar klein genoeg om individuele cellen hechten te vermijden. Een schema voor het goud dot fabricage is getoond in figuur 3a.
   1. Glasplaatje schoonmaak (in een chemische kap)
      1. Spoel het glaasje met aceton gevolgd door isopropylalcohol (IPA), en droog hem vervolgens met _een stroom _N2.
      2. Week de dia in piranha-oplossing (H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ = 4: 1) gedurende 10 min.
      3. Haal de dia, spoelen met DI water en droog hem vervolgens met _een stroom _N2.
      4. Bak het glaasje op een verwarmingsplaat bij 120 ° C gedurende 10 minuten.
      5. Behandel de dia in een plasma Asher bij 100 W gedurende 90 s.
   2. Spin-coating (spin-bekledingskap)
      1. Zet op een kookplaat en wacht tot de temperatuur stabiel is bij 95 ° C.
      2. Volg de coating procedure:
         1000 rpm gedurende 5 s met 500 rpm / s ramp;
         dan 3000 rpm gedurende 30 s met een 1000-rpm / s helling.
      3. Bevestig de gereinigde glasplaatje op de spin coater door een vacuüm.
      4. Bedek het glijoppervlak met P-20 en start de coating recept.
      5. Herhaal de coating proces voor het NFR-negatieve fotoresist.
      6. Bak de schuif bij 95 ° C gedurende 60 s en wacht tot hij is afgekoeld tot kamertemperatuur.
   3. fotolithografie
      1. Monteer de chromen masker op het masker aligner en zorg ervoor dat het patroon kant naar beneden in de richting van de dia.
      2. Stel de fotolithografie recept om belichtingsstand hard met 9 s van UV-blootstelling en snel uitlijnen van de glazen substraat met het masker.
      3. Na het uitvoeren van de blootstelling aan UV, bak de dia bij 956; C gedurende 1 minuut, en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
   4. Ontwikkeling
      1. Ontwikkelen van de patroon op de dia in de ontwikkelaar oplossing voor 60 s.
      2. Verwijder de schuif van de ontwikkelaar, spoelen met DI water en droog het met _N2 flow.
      3. Controleer het patroon geometrie onder een microscoop, en meten en de feature size opnemen.
   5. Gold depositie (E-beam verdamping) en lift-off
      1. Bak de glijbaan bij 120 ° C gedurende 5 minuten, en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
      2. Maak de dia met plasma in de reactieve ionen etsen (RIE) machine gedurende 90 s bij 500 Torr en 100 W.
      3. Borg 5 nm van Ti en 15 nm van Au op de dia met behulp van een e-beam verdamper ^17.
      4. Week de dia overnacht in een glazen bekerglas met fotoresist remover oplosmiddel goud rust bovenop de NFR verwijderen weerstaan.
      5. Haal de glijbaan, flush it met aceton, gevolgd door IPA, en droog het met _N2 flow.
      6. Droog de dia een hete plaat bij 115 ° C voordat het zuurstofplasma asher reinigen bij 100 W gedurende 90 s.
2. Moleculair-assemblage patroonvorming door lift-off (MAPL)
   Opmerking: Het gebied van iedere fibronectine gecoate eiland is ingesteld op binnen 700-900 pm ² voldoende HeLa cel verspreiding in een vierkant gebied terwijl het minimaliseren van de kans op meerdere cellen aggregeren op het eiland vergemakkelijken. Een schema voor de bereiding van cel-patroonvorming eilanden is weergegeven in figuur 3b.
   1. spincoating
      1. Herhaal stap 1.1.2, maar gebruik S1813-positieve fotoresist en een temperatuur van 115 ° C.
   2. Aligned fotolithografie
      1. Monteer de chromen masker op het masker aligner en zorg ervoor dat de kant met het patroon wordt naar beneden in de richting van de dia met degouden stippen.
      2. Stel de fotolithografie recept om belichtingsstand hard met 9 s van blootstelling aan UV.
      3. Lijn de bovenkant masker met het bodemobjectglaasje behulp uitrichtkenmerken, gelegen rond de rand van het masker, als ruimtelijke referentie.
      4. Controleer het centrale gedeelte van het masker en controleer of het patroon functies correct zijn uitgelijnd.
      5. Voltooiing van de blootstelling aan UV zonder een post-bakken.
   3. Ontwikkeling
      1. Herhaal stap 1.1.3, maar met 45 jaren van ontwikkeling voor het drogen op een kookplaat en het behoud in N ₂ -opslag.
3. chemische behandeling
   1. Bereid de passiverende oplossing: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 mM HEPES buffer.
   2. Haal de dia uit _N2 opslag en reinig het met behulp van RIE met de parameter-instelling: 500-Torr druk van 100 W vermogen, en 90-s duur.
   3. Pipetteer één druppel passiveren oplossing op een stuk film paraffine.
   4. Sandwich de oplossing met de film en de glijbaan, zorg ervoor dat de kant met het patroon kenmerken is naar beneden in de richting van de film; voorkomen blaasvorming.
   5. Wacht 45 minuten alvorens de schuif uit de film.
   6. Geniet van de dia achtereenvolgens in fotoresist remover, fotolak remover en DI-water (1: 1), en DI-water, en schud het in een ultrasoon bad gedurende 90 s voor elke weken.
   7. Droog de dia op een verwarmingsplaat om het vocht te verwijderen alvorens af te dichten in een exsiccator en opgeslagen in een koelkast.
4. chip assemblage
   1. Herhaal de stappen 1.1.1-1.1.4, maar met SU8-2025-negatieve fotoresist en de parametrering bedoelde genaamd de Microchem protocol ^18, een siliconen mal te bereiden met een fotomasker.
   2. Vervaardig een PDMS microkanaal (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x B x H) en een kleine PDMS plaat (800 urn brede ril) met behulp van zachte lithografie.
   3. Pons de microchannel voor vloeibare toegangspoorten en schoon te maken met tape en vervolgens met IPA.
   4. Schild met patronen van de glassubstraat met de PDMS plaat en toepassen RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) PLL-g-PEG te verwijderen uit het randgebied.
   5. Behandel de microkanaal met een lagere dosis van RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), en lijn naar de patroon glazen substraat (met de kleine PDMS plaat verwijderd); breng de microkanaal en het patroon glassubstraat in conform contact onder een stereoscoop.

Figuur 3: Schema's voor microfabrication en chip montage. a) patroon van goud punten op het glassubstraat. b) Bereiding van het glazen substraat voor cellulaire patroonvorming via MAPL. c) Montage van de microfluïdische kanaal met plasma-bonding. Zie de Materialen List voor de definities of de afkortingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. celhechting
   OPMERKING: HeLa-cellen worden routinematig aangehouden in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% antibioticum / antimitotische oplossing in een celkweek incubator. Een schematisch diagram van de chipeenheid en celhechting is weergegeven in figuur 3c.
   1. Prime de chip met PBS gedurende 30 min bij 1 ul / min en vervolgens giet fibronectine-oplossing (50 ug / ml in PBS, 1 pl / min) gedurende 45 min.
   2. Afwachting, trypsinize celkweek met 0,25% trypsine-EDTA, was ze in kweekmedium centrifuge individuele cellen en reconstitueren de celsuspensie in voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium 5x10 ⁶ cellen / ml.
   3. Vervang de fibronectine-oplossing met PBS en spoel de chip aan 10 ul / min gedurende 5 min.
   4. Injecterende bereide celsuspensie in de chip, stop de stroom, klem de uitlaat, en onderhouden van de chip in een celkweek incubator gedurende 30 minuten.
   5. Laat de uitlaat en spoel de chip met celkweekmedium bij 10 ul / min gedurende 5 min. Verminder de perfusie debiet van het kweekmedium 0,75 pl / min en handhaven van de celkweek voor 2 uur in de incubator.

2. Bubble Generation en Flow Visualisatie

OPMERKING: Een schematische weergave van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 4a tandem vorming van belletjes en het resulterende stroom interactie met een enkele cel nabij gekweekt in een microfluïde kanaal.

1. Genereren van tandem bellen met twee lasers en timingscontrole
   1. Plaats de microfluïdische chip op het podium van een omgekeerde microscoop en lijn de brandpunten van twee gepulste Nd: YAG lasers (λ = 532 nm, 5-ns pulsduur) op een paar gevormde gouden stippen gescheiden by 40 urn.
   2. Gebruik een digitale vertragingsgenerator de twee lasers activeren tijdvertraagd ongeveer 2,5 microseconden twee bellen ingeleid op gouden dots produceren.
   3. Stel de laser uitgangsenergie (~ 10 uJ) met een maximum diameter van de belletjes binnen 50 ± 2 urn.
   4. Synchroniseer een high-speed camera (belichting 200 ns en 2 miljoen frames per seconde (fps)) naar de lasers en vastleggen van de dynamiek van de zeepbel van de uitbreiding, instorten, bubble-bubble interactie, en de vorming jet.
2. Kwantificering van jet snelheid
   1. Noteer de positie van het spuitmondje (J ₁₎ aan het proximale uiteinde van de eerste bel (B ₁₎ en het distale uiteinde van B _1, beginnend bij het genereren van de tweede bubble (B ₂₎ en eindigend met het neerkomen van J ₁ naar het distale uiteinde van B _1; zie het schema in figuur 5a.
   2. Lineair past het tijdsverloop van de positie voor both de proximale (jet tip) en de distale einden. Bereken de helling van de punt is ten opzichte tijdscurve voor het proximale uiteinde naar het jet snelheid te bepalen. Het snijpunt van de twee lijnen geeft de straal touchdown tijd. Meer details zijn te vinden in referentie 19.
3. Visualisatie van de bubble-geïnduceerde stroom veld tandem
   1. Bereid 1 urn polystyreen (PS) kralensuspensie in DI-water (2,6% w / v) en injecteer de kralen in de microfluïdische chip.
   2. Genereer tandem bellen zoals beschreven in stap 2.1.1-2.1.3.
   3. Noteer de tandem bubble dynamiek met behulp van een high-speed video camera op een opnamesnelheid van 5 fps M met een 100-ns belichtingstijd.
   4. Upload de verworven afbeelding sequentie in een commercieel PIV software.
   5. Verdeel elk beeld in kleinere ondervraging ramen van 16 x 16 pixels (px) met een overlap van 75%.
   6. Toepassen meerdere doorlopen iteratie en regionale filters om de fouten in snelheidsveld berekening verminderen, ende resultaten af ​​van een snelheidsvector kaart.

Figuur 4: Schematische weergave van de experimentele opstelling en beeldopname. a) Experimentele opstelling voor tandem bubble generatie. b) De tijd die wordt gebruikt voor verschillende soorten beeldvorming acquisities. FL: fluorescentie microscopie, BF: helder veld, IFT: interframe tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Single-cell Analyse en Bioeffects

OPMERKING: De tandem bel wordt geproduceerd naast de doelcellen en de resulterende bioeffects bestudeerd in een afstandsmeting-afhankelijke wijze. De tijdsvolgorde voor verschillende typen beelden worden afgebeeld in figuur 4b.

1. Membraan perforeren en macromoleculaire opname
   OPMERKING: De opname van extracellulaire macromoleculen in de doelcel wordt gekenmerkt door de geleidelijke diffusie membraan impermeant propidiumjodide (PI) door de poratie plaats op het celmembraan.
   1. Na stap 1,5, vervangt het vaste kweekmedium (dwz DMEM) met PI oplossing (100 ug / ml in DMEM), dat op een perfusie stroomsnelheid van 0,5 ul / min gedurende het experiment.
   2. Programmeer de microscoop control software om automatisch de PI fluorescerende kubus op de draaiende carrousel en synchroniseren van de timing van de CCD-camera met de PI-fluorescentie excitatie om de fluorescentie beelden vast te leggen met een belichtingstijd van 200 ms.
   3. Nadat de twee brandpunten laser wordt afgestemd op een paar gouden stippen naast een doelcel, staat zowel helderveld (BF) en fluorescentie (FL) beelden voordat de tandem bubble behandeling.
   4. Gebruik microscoop besturingssoftware onmiddellijkstart een time-lapse fluorescentie beeld opnemen van de doelcel kort na stap 2.1 de geschiedenis van PI opname vastleggen.
2. membraan vervorming
   1. Bereid 1-um korrels (1% w / v, geactiveerd met wateroplosbaar carbodiimide) en functionaliseren ze met Peptide-2000 (100 ug / ml in PBS).
   2. Na stap 1,5, incubeer de aangehechte cellen met het gefunctionaliseerde korrels met een dichtheid van 1x10 ⁹ kralen / ml bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
   3. Herhaal stap 2.1 tot tandem bellen produceren naast het doel cel en noteer de cel vervorming met een ultra-high-speed camera draait op een opnamesnelheid van 5.000.000 fps.
   4. Identificeren van een triade van 3 kralen die gedurende het experiment blijft de beeldvlak en hun positie als (x _1, y _{1) (2} x, y ₂₎ compileren en ₍₃ x, y ₃₎ in het experiment coördinaten.
   5. Bereken de oppervlakte van de triade voor en afTER de tandem bubble behandeling met behulp van de formule:
      
   6. Bereken de oppervlakte stam als:
      
   7. Op basis van de coördinaten van de hoekpunten voor en na de behandeling tandem bubble Bereken het lokale hoofdrek Plaatselijke stam volgende vastgestelde protocollen ^20,21.
3. Levensvatbaarheid en apoptose
   LET OP: FITC Annexine V etiketten cellen, met inbegrip van apoptotische degenen, via de externalisering van fosfatidylserine (groene fluorescentie). PI labelt de kernen van necrotische cellen (rode fluorescentie). Helderveld beeldvorming wordt gebruikt om celmorfologie te documenteren en te helpen bij de identificatie van cellevensvatbaarheid en apoptose.
   1. Noteer de positie van elke behandelde cel in de microfluïdische kanaal (vergemakkelijkt door de adresetiketten in het kanaal, zie Figuur 2b ), terwijl het herhalen van stap 3.1.
   2. Incubeer de behandelde cellen in het celkweekmedium nog 2 uur voordat perfuseren de chip met FITC- Annexine V oplossing gedurende 15 min. Positieve cellen weer groene fluorescentie.
   3. Herhaal stap 3.3.2 24 uur na de tandem bubble behandeling langdurig bioeffects in de doelcellen te bestuderen.
4. calcium reactie
   1. Meng 3 gl Fura-2:00 voorraadoplossing (1 mg / ml in DMSO) met 3 pl van 10% w / v Pluronic F-127 in 500 ui gereduceerd serum medium tot de uiteindelijke labelingoplossing (6 uM) te bereiden.
   2. Na stap 1.5, vervang de celkweek medium met de etikettering oplossing en incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 40 minuten (1 pl / min perfusie tarief).
   3. Vullen van het kanaal met de verminderde serum medium (0,75 ul / min perfusiesnelheid) voordat de cel experiment.
   4. Start ratiometrische imaging (golflengte: 340/380 nm, 50-ms blootstelling)van de doelcel met het commerciële PTI systeem.
   5. Na 10 s van ratiometrische beeldvorming van de cel rust komt, produceren tandem bellen zoals in stap 2.1; eerste record met een interframe tijd (IFT) van 0,1 s gedurende 1 minuut, dan stijgen de IFT op 1 s voor een andere min, en de verdere stijging tot 5 s na 2 min.
   6. Met de PTI software om de verhouding R = F340 / F380 berekenen in het gebied van belang (ROI), dat evenredig is met de intracellulaire calciumconcentratie.

Results

De microfluïdische platform in dit werk beschreven kan worden gebruikt voor bubble bubble-interacties te onderzoeken en een verscheidenheid aan cavitatie geïnduceerde bioeffects analyseren bij de enkele-celniveau. Hier presenteren we een aantal voorbeelden van verschillende experimentele studies en bioassays die kunnen worden uitgevoerd in ons experimenteel systeem te demonstreren. We zullen eerst illustreren de voorbijgaande interacties van tandem bubbels met de straalvorming, de visual...

Discussion

Eencellige analyse, in combinatie met live-cell imaging, is sterk verbeterd ons begrip van de dynamische en vaak variabele processen in afzonderlijke vakken, zoals fenotype ontwikkeling en immuunrespons ^23. In tegenstelling tot de conventionele celkweek in schotels of flacons, microfluïdische systemen maken nauwkeurige regeling van de micro-omgeving naar de enkelvoudige-celniveau, in real time. Bijgevolg, de vooruitgang in microfluïdische technologie en technieken zijn grotendeels de doorvoer en reproduceerba...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens/Materialen
75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides	Corning	2947-75X38
Aceton	Sigma Aldrich, Co.	320110	ACS reagens, ≥99.5%
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥99.7%, FCC, FG
Zwavelzuur	Sigma Aldrich, Co.	320501	ACS reagens, 95.0-98.0%
Waterstofperoxide	Sigma Aldrich, Co.	216763	30 wt.% in H2O
Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR fotoresist	JSR	NFR016D2
Fotomasker	Photoplotstore	N/A	4x4 Direct write mask
MF-319 Developer	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Fotoresist Remover	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-methyl-2-pyrrolidinon gebaseerd
S1813 fotoresist	Shipley (Rohm and Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Paraffine film	HACH	251764
SU-2025 fotoresist	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Microbore Tubing	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Metalen pinnen	New England Small Tube	NE-1300-01	Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long
HeLa cellen	Duke Cell Culture Facility	(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) buffer	ThermoFisher Scientific	14190144
DMEM kweekmedium	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronectin bovine proteïne, plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Propidiumjodide	ThermoFisher Scientific	P21493
Carboxylaat Microsferen 1.00 μm	Polysciences, Inc	08226-15
Carboxylaat Microsferen 2.00 μm	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Annexin V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 µm gefilterd (10% oplossing in water)
Reduced serum media	ThermoFisher Scientific	11058021
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur
Plasma asher	Emitech	K-1050X	O2 / Ar plasma ashing van fotoresist en andere organische materialen
Mask aligner	SUSS MicroTec	Karl Suss MA6/BA6
E-beam evaporator	CHA Industries	CHA Industries Solution E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(oxide/ nitride/ polymeer) etsen
Stereoscoop	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Stereo Microscoop
Spuitpomp	Chemyx Inc	NanoJet
Celkweekincubator	NuAire	AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator
Biologische Veiligheidskasten	NuAire	NU-425-400
Waterbad	VWR	1122s
Centrifuge	IEC	Centra CL2
Microscoop	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG laser  (laser 1)	New Wave Research	Tempest
Nd:YAG laser  (laser 2)	New Wave Research	Orion
Delay generator	Berkeley Nucleonics	BNC 565-8c
Flash lamp	Dyna-Lite	ML1000 fiber-coupled flashtube
hoge snelheid camera	DRS Hadland	Imacon 200
hoge snelheid  camera	Shimadzu	HPV-X
hoge snelheid camera	Vision Research	Phantom V7.3
PIV software	LaVision	DaVis 7.2
camera	Zeiss	AxioCam MRc 5
software	Zeiss	AxioVision
PTI systeem	Horiba	S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software	Horiba	Easy Ratio Pro 2	versie 2.3.125.86
63× objectief	Zeiss	LD Plan Neofluar