Methodenartikel

Beeldvorming van de neutrofielen phagosome en cytoplasma Met behulp van een Ratiometrische pH Indicator

12.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55107

⸱

5 april 2017

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular Medicine, Division of Medicine, University College London, 2Cell and Developmental Biology, University College London

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om de pH en phagosomal gebied en het cytoplasmatische pH van mens en muis neutrofielen via de ratiometrische indicator seminaphthorhodafluor (SNARF) -1 of S-1 te meten. Dit wordt bereikt met behulp van levende cellen confocale fluorescentie microscopie en beeldanalyse.

Samenvatting

Neutrofielen zijn cruciaal voor aangeboren afweer hosten en dus een belangrijk gebied van het medisch onderzoek vormen. De phagosome, het intracellulaire compartiment waar het doden en spijsvertering van overspoeld deeltjes plaatsvinden, is de belangrijkste arena voor neutrofielen ziekteverwekker doden dat strakke regulering nodig. Phagosomal pH is een aspect dat nauwkeurig wordt geregeld op zijn beurt reguleren antimicrobiële proteaseactiviteit. Veel fluorescerende pH-gevoelige kleurstoffen zijn gebruikt om de phagosomal omgeving te visualiseren. S-1 heeft verscheidene voordelen boven andere pH-gevoelige kleurstoffen, zoals de dubbele emissiespectra, de weerstand tegen foto-bleking en de hoge pKa. Met behulp van deze methode, hebben we aangetoond dat de neutrofielen phagosome is ongewoon alkalisch in vergelijking met andere fagocyten. Door verschillende biochemische vervoegingen van de kleurstof, kan de phagosome worden afgebakend uit het cytoplasma, zodat veranderingen in de grootte en vorm van de phagosome kan worden beoordeeld. Dit maakt fof verdere controle van ionenbeweging.

Inleiding

De neutrofielen is het meest voorkomende aangeboren immuunsysteem cel in het lichaam. Zijn hoofdfunctie bestaat uit patrouilleren de bloedbaan en overspoelt en digestie van het vreemde deeltjes die het kan tegenkomen in een proces dat fagocytose 1, 2. De deeltjes worden afgebroken in een intracellulair compartiment genaamd phagosome. De activering van neutrofielen NADPH oxidase, de isovorm Nox2, initieert een cascade van biochemische reacties die culmineert in de dood van de ziekteverwekker. Nox2 eiwitsubeenheden gaan tot een elektronentransportketen complex in de phagosomal membraan 3 te vormen. Eenmaal geactiveerd, transporteert elektronen van NADPH door het membraan van moleculaire zuurstof in de phagosome, produceren superoxide anionen en andere reactieve zuurstofsoorten. Dit staat bekend als de respiratory burst, en men denkt van essentieel belang voor een efficiënte microbiële doden en spijsvertering 2 te zijn . Dit zou echter exclusieve beweging van negatieve lading over het membraan snel inactiveren Nox2 als deze niet werden gecompenseerd door positieve lading bewegen in en / of negatieve lading verhuizen van de phagosome. Het is bekend dat de meeste ladingscompensatie in neutrofielen door het proton kanaal HVCN1 4, 5 wordt gedragen. Dit kanaal maakt het passieve beweeglijkheid van protonen beneden de elektrochemische gradiënt van het cytosol naar de phagosome. Protonconcentratie wordt gereflecteerd door de pH, zodat voor een gegeven oxidase activiteit meting van de pH in de fagosoom kan informatie over de relatieve deelname van protonzuren en niet-protonische trajecten leiding compensatie.

De menselijke neutrofiel phagosome een alkalische pH van bij benadering 8,5 gedurende 20-30 minuten na fagocytose 5. Dit impliceert het bestaan ​​van aanvullende niet-protonen ionkanalen in NOX2-geïnduceerde lading compensatie, als de fusie en het vrijkomen van de inhoud van de zure korrels en enige compensatie door HVCN1 zou een zuur milieu te handhaven, in tegenstelling tot die waargenomen. De beweging van ionen deze negatieve lading kan ook via osmose veranderingen in phagosome maat uitoefenen compenseren. Deze aanwezig in neutrofielen bij hoge fysiologische concentraties kunnen ionen: kaliumionen bleken te verplaatsen naar de phagosome 6 en chloride ionen beweging andere kandidaat belang neutrofielfunctie 7.

De regulering van de pH in de phagosome is van vitaal belang voor antimicrobiële protease-activiteit 5. Myeloperoxidase (MPO) lijkt optimale activiteit hebben bij pH 6, terwijl voor cathepsine G en elastase, de optimale niveaus zijn pH 7-9 en pH 8-10, respectievelijk 5. Daarom kan er een voorbijgaande verandering in phagosomal pH activiteit niches voor verschillende enzymen om plezierctie. Inzicht in hoe pH is betrokken bij neutrofielen microbiële doden, kunnen nuttige informatie voor het ontwerpen van nieuwe-neutrofielen verhogen van microbiële agenten.

De neutrofielen phagosome is een zeer reactieve omgeving. Dit maakt het moeilijk om de pH nauwkeurig te beoordelen, omdat de kleurstoffen gemakkelijk kan worden geoxideerd, wat leidt tot technische artefacten. Historisch gezien is fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) de kleurstof gekozen intracellulaire pH 8, 9 meten. Er zijn echter een aantal nadelen voor het gebruik ervan bij het meten van neutrofielen phagosomal pH. Met een pKa van 6,4 10, wat betekent dat het slechts nauwkeurig kan worden toegepast om pH waarden te beoordelen 5-7,5 8, zoals verzadigt bij pH <8 11. Omdat de neutrofielen phagosomal pH veel meer alkalisch 5 kan worden, kan FITC het volledige scala van mogelijke pH wijzigingen niet vast te leggen. Een verdere significant probleem met FITC in de context van neutrofielen is dat men denkt te photobleached door MPO 12. De MPO inhibitor, natriumazide, kan worden gebruikt te beperken fotobleken 13, maar het is aangetoond dat natriumazide rechtstreeks verlaagt de pH phagosomal per MPO-onafhankelijk en is dus ongeschikt voor gebruik in dergelijke assays 5.

Vergeleken met andere intracellulaire kleurstoffen, S-1 een relatief hoge pKa van 7,5 10. Onder zure omstandigheden, het molecuul geprotoneerd en vormt een emissiesignaal tussen 560 en 600 nm bij excitatie bij 488 nm of daarboven. Wanneer het molecuul gedeprotoneerd in meer alkalische omstandigheden, de emissiegolflengte is dan 600 nm. Een verhouding van de fluorescentie-intensiteiten bij deze twee golflengten geeft de emissie verschuiven, die meer betrouwbaar is dan één fluorescentiemetingen, omdat het ongevoelig fluorofoor concentratie en celstructuur. S-1 kan worden geconjugeerd aan antigeen materiaal, bijvoorbeeld zymosan 14, hoewel hitte gedode (HK) Candida albicans heeft de voorkeur, aangezien de grotere oppervlakte geeft een consistentere fluorescentie aflezing.

We hebben ook een modificatie van deze werkwijze temporele veranderingen in pH studie (figuur 3) 5. Deze methode voor het meten van cytosolische pH kan gemakkelijk worden toegepast op andere celtypen, zoals elders beschreven 15, 16, en cellen met meer alkalisch phagosomes 14.

Protocol

Ethiek statement: Alle dier werk werd uitgevoerd met de licentie en de goedkeuring van het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken. Human deelname aan dit onderzoek werd goedgekeurd door de Joint UCL / UCLH commissies over de ethiek van Human Research. Alle deelnemers ontvangen informed consent.

1. Bereiding van C. albicans

  1. Kweek een Candida disc (zie Materials List) op een YPD agar plaat volgens de instructies van de fabrikant. Kies een kolonie toevoegen aan 15 ml YPD-bouillon. Incuberen in een schuddende incubator bij 30 ° C en 200 rpm totdat de kweek troebel (gewoonlijk ongeveer 2 dagen, of tot een concentratie van ongeveer meer dan 1 x 10 9 / ml).
  2. Spin down Candida medium en resuspendeer in 50 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 10 min. Herhaal deze stap twee keer.
  3. Plaats de buis met 50 ml PBS / Candida medium in een waterbad voorverwarmd tot 60 ° C zodat de gehele buis submerged gedurende 1 uur.
    1. Om te bevestigen dat de Candida hitte gedode, strook een monster op een YPD-agarplaat en incubeer overnacht bij 30 ° C. Pas de warmte gedode (HK) Candida concentratie 9/5 x 10 8 / ml, afhankelijk van de Candida groei, en opslaan in 1 ml porties in een -20 ° C vriezer.
      LET OP: Alle celtellingen in dit protocol werden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde cel tegen te gaan.

2. S-1 Koppeling om warmte-gedode (HK) Candida

  1. Bereid een hoeveelheid van carboxy-S-1 succinimidylester (50 ug) door verdunning in 100 pl hoogwaardige dimethylsulfoxide (DMSO). Vortex goed te mengen.
  2. Bereid 1 ml 1 x 10 8 HK Candida in 0,1 M natriumbicarbonaat (pH 8,3) in een 15 ml buis.
  3. Voeg 100 ul van carboxy-S-1 een druppel tegelijk aan het HK Candida tijdens het mengen op een vortex bij ongeveer 2000 rpm (gemiddeld tot hoge snelheid). Wikkel aluminium foil rond de buis en plaats het op een wals bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  4. Was de HK Candida- S-1 (HKC-S-1) drie keer door centrifugering bij 2250 x g gedurende 10 minuten elk. Voor de eerste twee wassen, resuspendeer de pellet in 15 ml 0,1 M natriumbicarbonaat (pH 8,3). Na de derde wasbeurt, resuspendeer in 1 mL gebalanceerde zoutoplossing (BSS) buffer (zie tabel 1).
  5. Breng de HKC-S-1 suspensie in buizen in 100 gl aliquots en bewaar ze bij -20 ° C.
    OPMERKING: Gebruik buizen met lage oppervlakte bindmateriaal, indien mogelijk, HKC-S-1 deeltjes zich aan de wand van normale centrifugebuizen.
  6. Opsoniseren HKC-S-1
    1. Voor humane neutrofielen, voeg 100 ul humaan IgG serum 100 pl ontdooide HKC-S-1.
    2. Voor muizen neutrofielen, voeg 50 ul van normaal muizenserum en 50 pl van muizen Candida immuunserum (gegenereerd uit C57B6 muizen geïnjecteerd met HK Candida) 5-100 glvan HKC-S-1.
    3. Mengen op een warmte-schudder bij 37 ° C en 1100 rpm gedurende 60-90 min, en vervolgens op 4 ° C roller 2 uur.
    4. Was driemaal BSS buffer door centrifugatie bij 17.200 xg gedurende 1 minuut elk. Hersuspenderen in 100 pl buffer BSS.

3. Isolatie van neutrofielen

  1. Menselijke perifeer bloed neutrofielen, neem 15 ml bloed door venapunctie van een gezonde donor en plaats deze in een 20 ml spuit met 90 gl 1000 IU / ml natriumheparine oplossing (60 pl heparine / 10 ml bloed).
  2. Gebruik een pipet, injecteer 1,5 ml 10% dextranoplossing in de injectiespuit. Keren voorzichtig 3x en laten staan ​​op de bank.
  3. 30-60 min wachten, totdat het bloed ruwweg in tweeën, met een bovenste buffy coat laag die strokleurige en een onderste laag die erytrocyten.
  4. Duw de bovenste laag door een naald of verwijderen met een pipetpunt. Zet het ina 15 ml buis. Vermijd het nemen van de rode laag. Met behulp van een 5 ml pipet 3-4 mL dichtheidsgradiëntmedium (zie Materialen List) naar de bodem van de buis onder de bufferlaag twee afzonderlijke lagen te verkrijgen. Centrifugeer bij 913 xg gedurende 10 min.
    OPMERKING: Bij gebruik van muis neutrofielen (zie referentie 17 voor muizen neutrofiel isolatie) Gebruik de celsuspensie die is gespoeld uit het beenmerg plaats.
  5. Schenk de bovendrijvende, met achterlating van een rode pellet. Voorzichtig vortex aan de pellet te verstoren. Voeg 7 ml gedestilleerd, geautoclaveerd H2O aan de pellet en keer gedurende 20 s aan de pellet te resuspenderen. Voeg 7 ml 2x zoutoplossing en meerdere malen zwenken om te mengen, het lyseren van de resterende rode bloedcellen.
  6. Centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in BSS buffer tot ongeveer 4 x 10 6 / ml.
    OPMERKING: Voor optimale microscopie van de cellen, houdt de celsuspensie concentratie van 1,5-6 x 10 6 / ml.

4. Bereiding dia

  1. Pre-behandeling van een 8-put plaat microscopie (zie Materialen List) met 200 pl poly-L-lysine (0,01% oplossing) in elk putje gedurende 40-60 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Verwijder de poly-L-lysine (kan worden gebruikt) en spoel de putjes tweemaal met 200 ui gedestilleerd H2O
  3. Voeg 200 ul celsuspensie bereid in stap 3.6 aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 min.
  4. Bereid een hoeveelheid van 5- (en-6) -carboxy S-1 acetoxymethyl (S-1-AM) ester (50 pg) door toevoeging van 100 pl hoogwaardige DMSO tot één buis. Vortex om te mengen. Wanneer niet in gebruik, bewaar bij -20 ° C.
  5. In een buisje, voeg 1,7 ml BSS buffer en 20 pi van S-1-AM. Vortex om te mengen.
  6. Was de putjes tweemaal met 200 pl buffer BSS en vervang de buffer met S-1-AM-oplossing. Zorg ervoor dat de monolaag van cellen gehecht aan de bodem van de put niet verstoord door voorzichtig pipetterende muren van de putten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 25 minuten.
  7. Was de putjes tweemaal met 200 ui buffer BSS. Een remmer testen vormen een "master mix" van het geschikte geneesmiddel in BSS buffer. Was de putjes tweemaal in de remmeroplossing.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u dezelfde hoeveelheid geneesmiddel voertuig (bv, DMSO of ethanol) te gebruiken in de controle en werd gebruikt voor de inhibitor. Wanneer het testen van het effect van zinkchloride, gebruikt BSS buffer ontbreekt KH 2PO 4 (de HEPES kan de oplossing alleen buffer), zink precipiteert met fosfaat.
  8. Ultrasone trillingen de geopsoniseerde HKC-S-1 (punt 6.2) gedurende ongeveer 3 seconden bij 5 amplitude urn. Voeg 10 ul aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 15-20 minuten fagocytose mogelijk, waardoor de cellen klaar om af te beelden voor foto van fagocytose.

5. confocale microscopie

  1. Met behulp van een confocale microscoop Stel de lasergolflengte zodade cellen worden geëxciteerd bij 555 nm en de emissie wordt gedetecteerd door twee kanalen, of detectoren: 560-600 nm en meer dan 600 nm.
    OPMERKING: Specifieke microscoop parameters verschilt per microscoop en moeten worden geoptimaliseerd door de onderzoeker.
  2. Bekijk de cellen met behulp van een 63x lens met olie. Gebruik afbeelding een tegel-scan op voortdurende instelling om de middelste kolom te bekijken. Gebruik van de fluorescentie-intensiteit en de versterking van detectorkanalen, de scherpstelling en de intensiteit van de laser en de versterking van de twee kanalen te optimaliseren het beeld.
  3. Splits de afbeelding met behulp van de instellingen voor beide kanalen te bekijken; Controleer dat er geen verzadiging van fluorescentie-intensiteit in het cytoplasma of vacuolen. Verzadiging verschijnt als rode stippen. Verminder de laser intensiteit, zodat er een minimaal aantal rode stippen, maar de cellen en phagosomes zijn helder genoeg om duidelijk te zien.
  4. Wanneer u tevreden bent, klik op "Start experiment." Een afbeelding 9-tile scan wordt gegenereerd. Sla de afbeelding als een complex dossier bij aanbevolende software die een samengesteld beeld van de twee kanalen (niet jpeg of tiff) bevat.

6. Kalibratie Experimenten

  1. Teken de pH standaardcurve met Candida alleen.
    1. Bereid de buffers van pH 3,0-13,0, zoals in tabel 1.
    2. Neem een ​​monster (100 pl) van HKC-S-1. Draai het gedurende 1 min bij 17.200 x g. Resuspendeer in 500 ul van de toegewezen buffer.
    3. Uitgaande van de laagste pH, voeg de suspensie een voorbehandelde goed (uit stap 4.2). Plaats het preparaat op de confocale microscoop op een verwarmde podium tot 37 ° C.
    4. Noteer de fluorescentie elke min gedurende 10 min. Herhalen voor elke buffer.
  2. Saponine standaardcurve.
    1. Isoleer 1 x 10 7 menselijke neutrofielen 5 en resuspendeer ze in 1 ml van de laagste pH buffer.
    2. Volg de werkwijze beschreven in punt 4 voor het meten phagosomal pH in neutrofielen.
    3. Na incubatie met de Candida suspensie gedurende 20 minuten, voeg 0,3% saponine (15 ui 10% 's voorraadoplossing één voorbehandelde goed (uit stap 4.2)) van de schaal, en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Neem een ​​afbeelding elke minuut gedurende 10 minuten. Herhalen voor elke buffer.
  3. Cytosol-pH standaardcurven met de hoge K + / nigericine techniek 5, 18, 19.
    1. Vormen de in Tabel 1, van pH 4,0-13,0 buffers.
    2. Volg stappen 4.1-4.7, waardoor alleen neutrofielen in het voorbehandelde wells - elk putje naar een ander buffer bevatten. Voeg de schuif naar 37 ° C verwarmd trap en de fluorescentie elke min gedurende 10 min nemen.
    3. Opmerking: Het kan enige tijd duren voordat de cytosolische pH te stabiliseren met de externe oplossing, maar na dit punt, de S-1 ratiowaarde wordtconstante. Het meten van de extracellulaire HKC-S-1 bij elk experiment kan dienen als controle om na te gaan inhibitors toegevoegde niet interfereren met de S-1 geëmitteerde fluorescentie of beïnvloeden pH van de buffer.

7. Beeldanalyse

LET OP: Hier, instructies voor beeldanalyse (kwantificering van fluorescentie) met behulp van de gratis software ImageJ is voorzien. Het gebruik van ImageJ wordt aanbevolen.

  1. Download en installeer ImageJ versie> 1.46r volgens de instructies van de ontwikkelaar (https://imagej.nih.gov/ij/). Installeer de aanvullende codebestand verbonden met dit protocol genaamd “Phagosomal meting.”
  2. Afbeelding openen J en laadt u het imagebestand gekozen voor analyse op de werkbalk. Om de twee kanalen te combineren, gebruik Afbeelding> Kleur> Maak Composite.
  3. Klik met de rechtermuisknop op een bestand waarin om de resultaten op te slaan kiezen.
  4. Klik op de line tool op de werkbalk en dubbelklik op om de breedte te verhogen tot & #34; 2 ".
  5. Een lijn over de breedte van een phagosome en vervolgens rechter muisknop op "meten pH". De gemiddelde intensiteit van de twee kanalen wordt verkregen, en hun verhouding wordt automatisch berekend door de code bestand in ImageJ.
  6. Na het afronden van de metingen, klik met de rechtermuisknop en kies "save file."
  7. Om de phagosome gebied te meten, gebruikt u het vierde icoon aan de werkbalk om de vrije hand te tekenen rond het gebied. Klik met de rechtermuisknop en kies "maatregel gebied."
    LET OP: De resultaten worden opgeslagen en een logbestand wordt gegenereerd in de geselecteerde map. De resultaten kunnen worden verwerkt met behulp van spreadsheet, R, of een equivalente software. De relatie tussen de fluorescentieverhouding pH ongeveer sigmoïdale en verhoudingswaarden gegenereerd door de ImageJ analyse kan worden omgezet tot een pH met behulp van een gegeneraliseerde logistische of sigmoidfunctie of met lineair of kubische spline-interpolatie.
  8. Voor het meten van cytoplasma, trek een lijn over het cytoplasma en klik met de rechtermuisknop op “maatregel pH”.

Resultaten

Figuur 1 toont momentopnamen van neutrofielen van verschillende oorsprong in verschillende omgevingen phagosomal tonen. Kwantitatieve analyse te vergemakkelijken, is het belangrijk om de putjes zaad met een geschikt aantal cellen: teveel zal de cellen laag over elkaar, waardoor het moeilijk bijgaande phagosomes correcte weergave; te weinig zal natuurlijk, bieden minder resultaten, vooral omdat niet elke neutrofielen zal fagocytose. Figuur 2 is een beeld dat is oververzadigd; Dit kan worden bepaald door het splitsen van het beeld tussen de twee kanalen (met behulp van de microscoop software aanbevolen in de Materials List of gelijkwaardig) - rode stippen tonen waar maximale fluorescentie wordt gedetecteerd. Dit kan worden tegengegaan door vermindering van de intensiteit van de laser. Calibratiecurves behulp van de verschillende buffersystemen zijn getoond in figuur 3, aangepast van Levine et al. 5 </ Sup>. De foutbalken blijkt dat er enige variatie in fluorescentie tussen metingen. Figuur 4 geeft een voorbeeld van hoe de gegevens phagosomal pH en omgeving kunnen worden gepresenteerd. Deze aanpak maakt het mogelijk iedere afzonderlijke meting moet worden weergegeven met een-over leggen boxplot. Echter, de gegevens worden weergegeven in een histogram staafdiagram.

figure-results-1
Figuur 1: Geschikte snapshot beelden van neutrofielen uit mensen en muizen. Uiterst rechts is een kwalitatief visueel sleutel bij benadering de kleur van de S-1-gekleurd phagosomes overeenkomt met de pH. De gele kleur geeft meer zuurgraad, terwijl rood geeft meer alkaliteit. (A) toont Hvcn1 - / - muizen beenmerg neutrofielen 20 minuten na fagocytose. De phagosomes lijken erg rood, alkalisch, en gezwollen. De rode pijl in de rechterbenedenhoek deel van debeeldpunten een intracellulaire Candida, terwijl de pijl in linksboven verwijst naar een extracellulaire deeltje. (B) toont wildtype muis beenmerg neutrofielen Candida heeft ingenomen; ze zijn veel minder alkalische dan Hvcn1 - / - cellen. (C) toont humaan perifeer bloed neutrofielen op hetzelfde moment na fagocytose. Ze lijken iets meer alkalisch dan de muis wild-type cellen, maar de phagosomes zijn nog steeds niet zo groot en rood als de Hcvn1 - / - cellen. (D) toont aan menselijke neutrofielen die Candida hebben fagocytose in aanwezigheid van 5 uM difenyleen jodonium (DPI). Alle phagosomes zeer zuur, met een pH van 6 of minder; het middel remt de NADPH oxidase, zodat er geen compenserend ionenbeweging. De protonen afgegeven uit de zure granules die fuseren met de phagosome veroorzaken zure pH 20, en verhoogde rekrutering van de V-ATPase aan The phagosomal membraan bij behandeling met DPI 9. Het cytoplasma blijkt ook alkaline vergeleken met de cellen van de andere voorwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Over-verzadiging van Hvcn1 - / - muis beenmerg neutrofielen. Het is vanuit de analyse beelden waarin de fluorescentie gegevens oververzadigd te sluiten. Zoals beschreven in paragraaf 5.3, wordt het samengestelde beeld in twee afbeeldingen (linksboven, rode pijl) met beide kanalen afzonderlijk gepresenteerd. In deze software wordt gecontroleerd bereik indicator (linksonder rode pijl), dan alle pixels die oververzadigd zijn helder rood. Er oververzadiging in beide kanalen (1 en 2). Een magnificatie van sommige cellen en extracellulaire Candida weergegeven rechtsonder met pijlen naar getroffen gebieden. Analyse van deze punten leidt tot een vals ratiometrische meting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Standaard ijkkrommen voor de omzetting van S-1 fluorescentie verhouding tot pH metingen. De standaardcurves voor Candida alleen in de verschillende buffers (aangeduid als "Tris") en wanneer de cellen worden gepermeabiliseerd met saponine ( "saponine") zijn vergelijkbaar, waaruit blijkt dat de S-1 binnen en lezen buiten de cel (phagosome en extracellulaire medium) vergelijkbaar. De fout balken geven de gemiddelde ± SD. De S-1 ratio / pH-curve wordt verkort wanneer onderzocht in het cytoplasma ( "cytoplasma"), die in aanmerking de beeldanalyse worden genomen. Dit cijfer is aangepast Levine et al. 5. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Kwantificering van phagosomal pH en omgeving. Deze figuur geeft een voorbeeld van gegevenspresentatie. De grafieken werden gegenereerd door het gebruik programmeersoftware R. A: toont phagosomal verhouding en overeenkomstige pH voor A (Hvcn1 - / - muizen beenmerg neutrofielen), B: wildtype muis beenmerg neutrofielen, C: humane perifeer bloed neutrofielen en D: menselijke neutrofielen met 5 uM DPI n = 3/300. Afzonderlijke metingen worden weergegeven als kleine vierkantjes, met daaroverheen een boxplot met medien een interkwartielbereik. Een rode balk vertegenwoordigt het gemiddelde. Zoals blijkt uit de afbeeldingen in figuur 1, Hvcn1 - / - cellen zeer alkalische phagosomes in vergelijking met wildtype muizen en humane neutrofielen. Ze hebben ook een grotere phagosomal gebied (Figuur 4B, n = 3/300). Humaan neutrofiel phagosomes zijn iets basisch en groter dan wildtype muizen neutrofielen, terwijl humane neutrofielen geïncubeerd met DPI zeer zure en kleine phagosomes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Gebalanceerde zoutoplossing (BSS) -buffer
NaCl 156 mm
KCl 3 mM
MgSO4 2 mM
KH 2PO 4 1,25 mM
CaCl2 2 mM
Glucose 10 mM
Hepes 10 mM
pH 7,4 met NaOH of HCl
YPD-bouillon
YPD-bouillon 50 g
Gedistilleerd water 1 L
Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min
Voor YPD agar: vóór het autoclaveren toe 15 g / L agar
10% dextranoplossing
Dextran klinische kwaliteit 50 g
NaCl 4,5 g
Gedistilleerd water 500 ml
Naar fles en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min
2x Zoutoplossing
NaCl 18 g
Gedistilleerd water 1 L
Naar fles en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min
10% Saponine voorraad
BSS buffer 50 mL
saponine 5g
Warmte BSS buffer tot 37 ° C, voeg saponine en meng.
Voeg 0,1% natriumazide als conserveermiddel, opslag mengsel bij 4 ° C.
Calibration buffers
Candida standaardcurve
Maak eerst up 0,15 M voorraad van elk buffer
Make-up 0,15 M NaCl-oplossing
15 ml eindvolume: 5 ml 0,15 M gewenste bufferoplossing + 10 ml 0,15 M NaCl-oplossing
pH 3 100 mM NaCI 50 mM glycine
pH 4 100 mM NaCI 50 mM acetaat
pH 5 100 mM NaCI 50 mM acetaat
pH 6 100 mM NaCI 50 mM acetaat
pH 7 100 mM NaCI 50 mM Tris
pH 8 100 mM NaCI 50 mM Tris
pH 9 100 mM NaCI 50 mM Tris
pH 10 100 mM NaCI 50 mM glycine
pH 11 100 mM NaCI 50 mM fosfaat
pH 12 100 mM NaCI 50 mM fosfaat
pH 13 100 mM NaCI 50 mM fosfaat
Cytosolische standaardcurve
Gebruik eerder gemaakte 0,15 M voorraadoplossing bufferoplossingen
Make-up 0,15 M KCl-oplossing
15 ml eindvolume: 5 ml 0,15 M gewenste buffer + 10 ml 0,15 M KCl-oplossing
10 mM voorraadoplossingen van nigericine in ethanol, voeg 15 ul aan elk eindvolume oplossing
pH 3 100 mM KCl 50 mM glycine 10 uM nigericine
pH 4 100 mM KCl 50 mM acetaat 10 uM nigericine
pH 5 100 mM KCl 50 mM acetaat 10 uM nigericine
pH 6 100 mM KCl 50 mM acetaat 10 uM nigericine
pH 7 100 mM KCl 50 mM Tris 10 uM nigericine
pH 8 100 mM KCl 50 mM Tris 10 uM nigericine
pH 9 100 mM KCl 50 mM Tris 10 uM nigericine
pH 10 100 mM KCl 50 mM glycine 10 uM nigericine
pH 11 100 mM KCl 50 mM fosfaat 10 uM nigericine
pH 12 100 mM KCl 50 mM fosfaat 10 uM nigericine
pH 13 100 mM KCl 50 mM fosfaat 10 uM nigericine
Alle pH ijkoplossingen met ofwel NaOH of HCl

Tabel 1: Samenstelling van buffers. In deze tabel worden de geschikte samenstellingen van de verschillende buffers toegepast bij het protocol.

Aanvullende code bestand. Dit bestand bevat een aantal macro's, geschreven door AP Levine, die nodig zijn voor het onderzoek zijn. De auteurs zou blij om te proberen om alle vragen in verband met het gebruik van deze code aan te pakken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Zodra de geschikte reagentia, microscoop instellingen en kalibratie experimenten worden opgezet, deze methode is relatief eenvoudig uit te voeren. De kritische stappen omvat: het labelen van de Candida S-1 zodat er geen overbelasting van de kleurstof, kalibreren en analyseren van het beeld.

S-1 is een reagens geschikt voor meer basische pH omstandigheden, hetgeen vooral van belang voor neutrofielen 21 maar beperkt het gebruik ervan in bepaalde celtypen. Meer zure omgevingen zoals macrofaag fagosomen, SNARF-4 of S-4, geschikter vanwege de lagere pKa 22. Bovendien, voor nauwkeurigere metingen cytoplasma, is het beter om S-4 gebruikt, aangezien de standaardcurve voor S-1 blijkt dat de fluorescentie verhoudingen gaan plateau onder pH 6 (figuur 3). Andere kleurstoffen, zoals 2' , 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluoresceïne (BCECF) of pHrodo Red kan ook geschikt zijn een context dat naar verwachting zuur te zijn. Maar het cytoplasma kleuring steeds nodig zijn om correcte identificatie van de phagosomes met Candida.

Een belangrijk kenmerk van een phagosomal pH-indicator is dat het niet onomkeerbaar is veranderd door de reactieve phagosomal milieu. S-1 lijkt bestand tegen de neutrofielen milieu zijn. Dit wordt aangetoond door Levine et al. 5 (zie aanvullende Video 4 van referentie 5), die de fagocytose en daarop volgende afgifte van een S-1 gemerkte Candida deeltjes door een Hvcn1 tonen - / - neutrofielen. Wanneer gefagocyteerd, het deeltje verandert van geel / oranje naar rood (neutrale tot alkalische pH), maar wanneer het deeltje wordt vrijgegeven door de neutrofielen, keert hij terug naar zijn oorspronkelijke kleur.

Het is belangrijk om een ​​aantal beperkingen van het gebruik van S-1 vermeld. Dat deze kleurstof twee emissiespectra waardoor ratiometrische measurement is een voordeel, maar specialistische apparatuur nodig is om beelden te verwerven; de microscoop gebruikt voor de experimenten moeten kunnen twee beelden gelijktijdig of met een onbeduidend vertraging opneemt. De auteurs gaan ervan uit dat de onderzoeker een poging dit protocol heeft ervaring met behulp van confocale microscopie, of toegang heeft tot een getrainde professional. We kunnen niet een lijst van alle specifieke microscoop parameters zoals ze verschilt per microscoop en moeten worden geoptimaliseerd door de onderzoeker. De acetoxymethylester geconjugeerd aan S-1 waarmee de kleurstof diffundeert in het cytoplasma afgebroken door niet-specifieke esterasen in het cytoplasma naar het fluorescerende molecuul. Esterasen, zoals alkalische fosfatase, aanwezig in humaan serum en foetaal runderserum, die worden gebruikt ter aanvulling celkweekmedia. Bijgevolg moet het medium waarin de cellen worden geladen met S-1-AM (4.5) geen serum. Dit kan moeilijk blijken als het gebruik van cellen die een meer voedselrijke ric vereisenh medium te houden dan de gebalanceerde zoutoplossing gebruikt in dit protocol. Evenzo kunnen andere fluorescerende mediumcomponenten, zoals fenol rood, kunnen interfereren met S-1 gemeten.

De foutbalken in figuur 3 geven aan dat er enige variatie in de verhouding metingen bij elke pH. Een geschikt aantal herhalingen van elk experiment (ten minste n = 3) en evenveel afzonderlijke metingen in elk afzonderlijk experiment nodig zijn tussen vacuolaire variatie overwinnen. Derhalve is het raadzaam om de pH van ten minste 100 phagosomes voor elke omstandigheid en evenveel phagosomal gebieden die lijken enige Candida bevatten meten. De phagosomes te meten voor kwantificering moeten zijn die volledig zijn overspoeld een Candida deeltje (dwz die volledig omringd door cytoplasma). Af te zwakken tegen onbedoelde vertekening bij de selectie van cellen / phagosomes voor kwantificering, moeten alle analyses worden uitgevoerd alsblind voor de experimentele omstandigheden.

Hier beschrijven we de isolatie van neutrofielen door dextran sedimentatie van volbloed gevolgd door centrifugatie van de plasmalaag door een dichtheidsgradiënt. Wij gebruiken deze techniek het snel en efficiënt produceert een zuiver (> 95%) populatie neutrofielen, hoewel er andere methoden, zoals volbloed centrifugatie door andere dichtheidsgradiënt formules of negatieve selectie van neutrofielen via gespecialiseerde kits met antilichamen of magnetische kralen. Echter, de laatste onbetaalbaar voor de meeste groepen die neutrofielen routinematig isoleren. Daarnaast gebruiken we het antistollingsmiddel heparine in de bloedafnamebuis, terwijl andere onderzoekers meer gewend aan het gebruik van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) of zuur citraat natrium (ACD) kan zijn. Omdat er veel verschillende methoden om uit te kiezen, is het aan de persoonlijke voorkeur van de onderzoeker.

Voortswanneer het isoleren en manipuleren van neutrofielen ze moeten worden behandeld met enige zorg aan bovenmatige activering te voorkomen. Voorzorgsmaatregelen zijn onder meer: ​​alleen met behulp van plastic waren, geen glas; filter-steriliseren alle buffers één verontreinigend endotoxine te verwijderen; bij het draaien van neutrofielen zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd om overmatige trillingen te vermijden; zo beperkt mogelijke tijd neutrofielen blijven in een pellet na centrifugatie; niet neutrofielen in de oplossing van meer dan 5 x 10 6 / mL te handhaven; en het uitvoeren van de proef zo ​​spoedig mogelijk na isolatie.

Deze werkwijze kan worden aangepast aan veranderingen in de pH en phagosomal gedurende een bepaalde tijdsperiode te meten met behulp van een verwarmde decor tot 37 ° C op de microscoop en het nemen van momentopnamen eens 30-60 s vanuit dezelfde positie, zoals beschreven voor de ijkingsstappen. Het kan theoretisch ook worden aangepast voor hogere doorvoer experimenten, zoals in 96-putjesplaten en voor flowcytometrie-experimenten, waarbij S-1 kanworden gebruikt als pH-indicator 23. Echter, in deze instellingen, de nadruk op individuele celactiviteit wordt vervangen door een meer globale effect op de cel bevolking.

Deze methode is gericht op een relatief eenvoudige experimentele opstelling waarop individuele onderzoekers kunnen aanpassen aan hun gebied van belang aan te passen te bieden. Onderzoekers willen neutrofielen phagosomal pH en omgeving verkennen en tegelijkertijd meten van verplaatsing van andere ionen, bijvoorbeeld intracellulaire calciumconcentratie. Er zijn verschillende fluorescente Ca2 + indicatoren beschikbaar voor confocale microscopie, zoals Indo-1, die ook dual emissiespectra bij 400 tot 475 nm 24. Deze emissiegolflengten niet overlappen met S-1 emissiespectra, maar de excitatiegolflengte is bovenaan ultraviolet (UV) uiteinde van het spectrum, die schadelijk voor cellen en een UV laser niet gebruikelijk bij alle microscopen. Een uitgebreid overzicht van de verschillende indicatorenmeten intracellulair calcium flux onder Takahashi et al. 25 en Hillson et al. 26.

Tot slot zijn er andere methoden beschikbaar om phagosomal pH meten met verschillende fluorescente kleurstoffen Nunes et al. hebben aangetoond 13 en andere groepen 27, 28. Andere onderzoekers hebben ook S-1 te meten cytosol pH 29 of pH phagosomal 14. Echter, dit protocol is uniek gelijktijdig de pH van zowel cytosol en phagosome, die de mogelijkheid om veranderingen in phagosomal dwarsdoorsnedeoppervlak observeren en om onderscheid te maken tussen wildtype en Hvcn1 levert - / - muis neutrofielen en humane neutrofielen met en zonder werken NADPH oxidase.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd vriendelijk gefinancierd door de Wellcome Trust, de biotechnologie en Biological Sciences Research Council, en de Irwin Joffe Memorial Fellowship.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFUSigma-AldrichRQC14003-10EAPlaats direct op een uitgesmeerde agarplaat volgens de instructies van de fabrikant
YPD bouillonSigma-AldrichY1375Volg de instructies van de fabrikant, er bestaan verschillende aanbieders
Dextraan klinisch kwaliteit MW = 200.000-300.000MP Biomedicals2101514Gebruik handschoenen 
Heparine natriumoplossing voor infusie (conserveringsvrij), 1.000 IE/mL Fannin, Wockhardt UK LtdFP1077We hebben gekocht van UCH-ziekenhuisapotheek
SNARF-1 Carbonzuur, Acetaat, Succinimide-ester - speciale verpakkingThermo Scientific/InvitrogenSS22801Gebruik handschoenen
5-(en-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, AcetaatThermo Scientific/InvitrogenC1272Gebruik handschoenen
Vivaglobin menselijk IgG  160 mg/mL oplossingCSL Behringontvangen als geschenkEr bestaan verschillende aanbieders
Normaal muis serumAbcamab7486Er bestaan verschillende aanbieders
Lymphoprep (dichtheidsgradiëntmedium)Alere Ltd1114547Bewaar sterieel en uit de buurt van direct zonlicht, kan worden vervangen door Ficoll-Paque
NigericineSigma-AldrichN7143Toxisch, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende aanbieders
SaponineSigma-Aldrich47036Toxisch, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende aanbieders
Dimethyl sulfaat (DMSO)Sigma-AldrichD8418Toxisch, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende aanbieders
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethansulfonzuur (HEPES)Sigma-AldrichH3375Er bestaan verschillende aanbieders
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)Sigma-AldrichT1503 Er bestaan verschillende aanbieders
Kaliumchloride (KCl)Sigma-AldrichP9333Er bestaan verschillende aanbieders
Natriumchloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Er bestaan verschillende aanbieders
Magnesiumchloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266Er bestaan verschillende aanbieders
Magnesiumsulfaat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506Er bestaan verschillende aanbieders
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Er bestaan verschillende aanbieders
Calciumchloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Er bestaan verschillende aanbieders
GlucoseSigma-AldrichD9434Er bestaan verschillende aanbieders
Absoluut ethanol Sigma-Aldrich2860Er bestaan verschillende aanbieders
Diphenyleen jodonium (DPI)Sigma-AldrichD2926Er bestaan verschillende aanbieders
ZinkchlorideSigma-Aldrich208086Er bestaan verschillende aanbieders, verdun niet in fosfaatgebaseerde buffers omdat het zal neerslaan
Poly L lycineSigmaP4707Er bestaan verschillende aanbieders
Laserscanning confocale microscoop (Zeiss LSM 700)Carl ZeissDe microscoop moet in staat zijn om bij 555 nm te exciteren en emissie in twee kanalen tegelijkertijd te meten (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreatThistle ScientificIB-80826Andere geschikte beeldvormingsschotels kunnen worden vervangen
Soniprep 150MSEElke geschikte sonicator is voldoende
TC20 Geautomatiseerde celtellerBioRadEr bestaan verschillende aanbieders
1,5 mL Protein LoBind TubesSigma-AldrichZ666505-100EASpeciaal gebruikt omdat Candida zich kan hechten aan normale eppendorfs

Referenties

  1. Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).
  2. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  3. Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).
  4. Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).
  5. Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10 (4), 0125906(2015).
  6. Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).
  7. Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).
  8. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  9. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  10. Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
  11. Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).
  12. Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).
  13. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402(2015).
  14. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  15. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622(2016).
  16. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).
  17. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).
  18. Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).
  19. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  20. Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
  21. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  22. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
  23. Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).
  24. Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24 (6), 551-556 (1993).
  25. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79 (4), (1999).
  26. Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
  27. Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).
  28. Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).
  29. Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Confocale microscopieS 1 kleurstoffagosomale pHcytoplasmatische pHisolatie van neutrofielenopsonisatie van Candidafluorescentie imagingionenflux
Beeldvorming van de neutrofielen phagosome en cytoplasma Met behulp van een Ratiometrische pH Indicator
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.