Methodenartikel

Toezicht Astrocyt reactiviteit en proliferatie in Vitro ischemische-achtige omstandigheden

DOI:

10.3791/55108

⸱

21 oktober 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ischemische beroerte is een complexe gebeurtenis waarin de specifieke bijdrage van astrocyten naar de hersenen van de getroffen regio blootgesteld aan zuurstof glucose ontbering (OGD) moeilijk te bestuderen. Dit artikel introduceert een methodologie voor het verkrijgen van geïsoleerde astrocyten en studeren hun reactiviteit en de proliferatie onder voorwaarden van OGD.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ischemische beroerte is een complexe hersenletsel veroorzaakt door een trombus of embolus obstructie van de bloedstroom naar delen van de hersenen. Dit leidt tot verval van zuurstof en glucose, waardoor energie falen en neuronale dood. Na een ischemische beroerte belediging, astrocyten worden reactieve en vermenigvuldigen rond de site schade als het zich ontwikkelt. In dit scenario is het moeilijk om te bestuderen van de specifieke bijdrage van astrocyten naar de regio van de hersenen blootgesteld aan ischemie. Dit artikel introduceert daarom een methodologie om te bestuderen van primaire Astrocyt reactiviteit en proliferatie onder een in vitro model van een ischemie-achtige omgeving, zuurstof glucose ontbering (OGD) genoemd. Astrocyten werden geïsoleerd vanaf dag 1-4-oude neonatale ratten en het aantal niet-specifieke astrocytic cellen werd beoordeeld met behulp van Astrocyt selectieve marker gliale Fibrillary zuur eiwit (GFAP) en nucleaire kleuring. De periode waarin astrocyten zijn onderworpen aan de voorwaarde van OGD kan worden aangepast, evenals het percentage zuurstof, die ze worden blootgesteld aan. Deze flexibiliteit kan wetenschappers te karakteriseren van de duur van de conditie van de ischemische-achtige in verschillende groepen van cellen in vitro. Dit artikel bespreekt de termijnen van OGD die induceren Astrocyt reactiviteit, hypertrofische morfologie en proliferatie zoals gemeten door immunofluorescentie prolifererende Cell Nuclear Antigen (PCNA) gebruiken. Naast de proliferatie, astrocyten ondergaan energie en oxidatieve stress en te reageren op OGD door het vrijgeven van oplosbare factoren in het medium van de cel. Dit medium kan worden verzameld en gebruikt voor het analyseren van de gevolgen van moleculen uitgebracht door astrocyten bij primaire neuronale culturen zonder tussenkomst van de cel-naar-cel. Kortom, kan dit primaire cel cultuur model efficiënt worden gebruikt om te begrijpen van de rol van geïsoleerde astrocyten bij schade.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beroerte wordt gedefinieerd als "een acute neurologische dysfunctie van vasculaire oorsprong met plotselinge of snelle ontwikkeling van symptomen en tekenen, overeenkomt met de betrokkenheid van de speerpunten in de hersenen"1,2. Er zijn twee types van een beroerte: hemorragische en ischemische. Wanneer vasculaire dysfunctie wordt veroorzaakt door een aneurysma of een Arterioveneuze storing, vergezeld van verzwakking met posterieure breuk van een slagader, heet dit hemorragische beroerte3 die in de meeste gevallen tot de dood leidt. Wanneer een trombose of een embolus belemmert de bloedstroom, waardoor een tijdelijke vrijheidsberoving van zuurstof en glucose naar een regio van de hersenen, het heet ischemische beroerte4. Falen om te voeden cellen rond het getroffen gebied of ischemische kern leidt tot een homeostatische en metabole onbalans, energieke dysfunctie, neuronale dood en ontsteking5, die een levenslange handicap voor patiënten6kan veroorzaken.

Ischemische beroerte is een multifactoriële verwonding waarbij verschillende soorten cellen die reageren en het uitoefenen van hun effecten op verschillende tijdstippen. Veel interacties maken een moeilijke omgeving om te bestuderen het gedrag van afzonderlijke cellen. Dus, hoe we het bestuderen van de bijdrage van een bepaalde celtype in zo'n complexe omgeving? Een aanvaarde in vitro model van ischemie bestaat voor het blootstellen van cellen aan deprivatie van zuurstof en glucose (OGD), voor een bepaalde periode, gevolgd door het herstel van cellen naar een normoxic omgeving. Dit systeem simuleert een ischemische beroerte gevolgd door bloed reperfusie. Bij deze methode worden de cellen of weefsels blootgesteld aan een glucose-vrije media in een omgeving gezuiverd van zuurstof, met behulp van een gespecialiseerde hypoxische kamer. De incubatietijd van OGD kan variëren van een paar minuten tot 24u, afhankelijk van de hypothese dat wil worden getest. Studies hebben aangetoond dat afhankelijk van de tijden van OGD en normoxic omgeving, specifieke fenotypen van een beroerte (d.w.z., acute of subchronische) kan worden bereikt. Primaire geïsoleerde astrocyten, blootgesteld aan OGD met de achterste restauratie in normoxic voorwaarden, is een goed bestudeerde cellulaire model na te bootsen beroerte in vitro7. Met behulp van OGD is mogelijk te onthullen van de onafhankelijke moleculaire mechanismen van geïsoleerde cellen onder een beroerte-achtige omgeving.

Naarmate onze kennis van de Astrocyt biologie toeneemt, is gebleken dat ze zijn van cruciaal belang voor het behoud van de synapsen en Neurale plasticiteit, reparatie en ontwikkeling8ondersteunen. Onder normale omstandigheden, astrocyten release en inspelen op de cytokines, gliotransmitters, houden van de metabolismebalans en homeostase binnen synapsen5,9, chemokines en groeifactoren. In acute neuroinflammation, zoals ischemische beroerte, kunnen deze cellen worden reactieve, tonen een langdurige overexpressie van gliale Fibrillary zuur eiwit (GFAP) en hypertrofie vertonen hun morfologie5,10, 11 , 12. zoals de ischemische infarct ontwikkelt, de homeostase geboden door astrocyten wordt beïnvloed, met betrekking tot normale glutamaat opname, energiemetabolisme, uitwisseling van actieve moleculen en anti-oxidant activiteit13.

Opnieuw geactiveerde astrocyten vermenigvuldigen rond het infarct weefsel terwijl leukocyten naar de lesioned gebied14 migreren. Astrocytic proliferatie kan worden gemeten met behulp van markeringen zoals delende cel nucleair antigeen (PCNA), Ki67 en bromodeoxyuridine (BrdU)15. Deze proliferatieve reactie wordt gegenereerd in een tijd-afhankelijke manier en het helpt vormen het gliale litteken, een matrix van onherroepelijk reactieve astrocyten langs de parenchym van de aangetaste locatie na een letsel-9. Een van de oorspronkelijke functies van dit litteken is het beperken van de immuun cel extravasation van dit gebied. Studies hebben echter aangetoond dat het litteken een fysieke belemmering voor axonen uit te breiden wordt, als ze vrijkomen moleculen remming van axonale groei, en maken een fysieke barrière axonen uit te breiden rond de gewonde gebied16voorkomen. Er is echter wetenschappelijk bewijs waaruit blijkt dat na een dwarslaesie, volledig voorkomen gliale littekenvorming kan afbreuk doen aan de regeneratie van axonen17. Dus, de context waarin de specifieke astrocytic reactie wordt gemeten, moet rekening worden gehouden bij het kader van het letsel studeerde.

De voorgestelde methodologie kan worden toegepast om te bestuderen van de geïndividualiseerde functie van astrocyten na zuurstof glucose ontbering en het kan worden aangepast afhankelijk van de vragen die de onderzoeker wil beantwoorden. Bijvoorbeeld, naast de morfologische verandering en de markeertekens uitgedrukt op verschillende tijdstippen van OGD, het supernatant van astrocyten blootgesteld aan OGD kunnen worden verder geanalyseerd om te achterhalen oplosbare factoren uitgebracht door deze cellen, of als een geconditioneerde media gebruikt ter beoordeling van de effect in andere hersencellen. Deze aanpak kan studies over Astrocyt reactiviteit die kunnen leiden tot het ontrafelen van de factoren die ten grondslag liggen en moduleren van hun reactie in een scenario met ischemische beroerte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

postnatale ratten (Sprague-Dawley) 1-4 dagen oud worden gebruikt voor het isoleren van de cortices. De methode van de euthanasie is onthoofding, zoals goedgekeurd door de NIH richtsnoeren.

1. voorbereiding van de instrumenten en materialen voor chirurgie

  1. Sterilize instrumenten in een autoclaaf (temperatuur: 121 ºC, druk: 15 psi, tijd: 30 mins) met behulp van een stalen doos of een instant afdichten sterilisatie etui. Zie materialen in Tabel of Materials.

2. Voltooien van de voorbereiding van de DMEM

  1. In een bekerglas van één liter met 700 mL gesteriliseerde met autoclaaf water toevoegen Dulbecco ' s gewijzigd Eagle ' s middellange poeder bij kamertemperatuur.
  2. Toevoegen van 3,7 g/L natriumbicarbonaat, terwijl de oplossing wordt geroerd met een magneetroerder.
  3. Aanpassen de pH aan 7.4, met gesteriliseerde met autoclaaf water brengen van volume tot 1 L, filtreer vervolgens. Behoeve van de cultuur, vullen het gewenste volume van media met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine, en warm op 37 ˚C. Zie materialen in Tabel of Materials.
    Opmerking: De pH is aangepast aan 7.4 via het invoegen van de pH-meter-elektrode in de media. De media moeten worden roeren, vervolgens langzaam toevoegen van 1 M NaOH met behulp van een druppelaar.

3. Primaire Astrocyt cultuur

Opmerking: na het zaaien, cel media moet worden gewijzigd om de drie dagen en cellen kunnen worden verbouwd tot confluentie (11-13 dagen). Op de derde dag, tik op de kolf meerdere malen naar lift microglial cellen en Oligodendrocyt voorlopercellen uit de cultuur, verwijdert u alle de ' oude ' media, wassen tweemaal met 10 mL PBS, gecombineerd de PBS, voeg dan verse nieuwe media. Zie materialen in Tabel of Materials.

  1. Dissectie van pasgeboren rat hersenen
    1. uitvoeren de dissectie in een weefselkweek kap. Verkrijgen van 1-4 dagen oude rat pasgeboren pups (2 rat hersenen worden gebruikt per 75 cm 2 kolf).
    2. Bereiden drie 60 mm petrischalen en Pipetteer 5 mL van de volledige DMEM op elk.
      Opmerking: Ze kunnen als volgt worden onderverdeeld: #1 voor elke rat brain, #2 voor alle de cortices van de hersenen, en #3 voor alle de gepelde cortices (zonder hersenvliezen).
    3. Begrijpen de pup en spray met 70% ethanol. Decapitate het en zich te ontdoen van het lichaam in een afvalcontainer kleine biohazard.
    4. Met behulp van de micro-ontrafeling pincet, houd het hoofd en snijd de huid op de top van het hoofd om de schedel bloot.
    5. Met een andere schaar, maken een " T " snede vanaf de achterkant van de schedel naar de neus. Een paar pincet gebruiken om voorzichtig de schedel.
    6. Verwijder de blootgestelde hersenen met een pincet en plaats van de hersenen in een van de eerder gevuld met medium petrischalen.
    7. Gebruiken een andere set van steriele instrumenten voor de latere stappen.
    8. Gebruik micro-ontrafeling pincet om één hersenen zachtjes op het omgekeerde deksel van een petrischaal 60 mm. Wanneer de petrischaal op steriel gaas wordt geplaatst, is het mogelijk om de hersenen duidelijk weer te geven en het is makkelijker om te ontleden.
    9. Stabiele van de hersenen met een micro-ontrafeling Tang en scheiden van de cerebrale hemisfeer door zachtjes plagen langs de middellijn kloof met de scherpe einde van de verlostang micro-ontrafeling.
    10. Deflect en schil van het cortices, weggaand achter de witte stof, en hen overbrengen in een petrischaal, eerder met het label #2. Herhaal de procedure voor alle van de hersenen, het combineren van alle de ontleed cortices in de petrischaal Label #2.
    11. Neem uit de hippocampus uit onder elke cortex en negeren it.
    12. Met de pincet micro-ontleden en een 60 mm petri schil voorzichtig de hersenvliezen van de individuele corticale lobben en plaats hen in de petrischaal label #3.
  2. Weefsel Dissociatie: homogenizer blender methode
    1. giet weefsel/medium schorsing (gepelde cortices van de hersenen) in de zak van de steriele blender en voeg voldoende medium om het totale volume in de zak tot 5 mL.
    2. Plaats de zak in de homogenizer blender, terwijl ongeveer 2 cm van de zak zichtbaar boven de gesloten deur. De cel dissociatie gebeurt tijdens 2,5 min op hoge snelheid.
      Opmerking: Ook kan dit worden gedaan door te sluiten van de zak en stampende het zachtjes met een bekerglas in de kap. Zorg ervoor dat u een doek tussen de zak en bekerglas om wrijving.
    3. Giet de celsuspensie in een nummer 60 maaswijdte van de zeef en giet de gefilterde stroom door naar het nummer 100 zeef, zodat het filteren door de zwaartekracht.
    4. Met behulp van 15 mL buizen, centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g in een klinische centrifuge (bij voorkeur schommel emmer rotor) voor 5 min.
    5. Giet af de bovendrijvende substantie in een bekerglas, dan met behulp van een serologische precisiepipet, resuspendeer en distantiëren van de pellet van cellen in een maximum van 5 mL media.
  3. Cel tellen
    1. met een micropipet, verzamelen van 100 µL celsuspensie in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL en voeg 100 µL van blauwe trypan.
    2. 10 µL van de verzamelde schorsing invoegen in de hemocytometer en graaf alle cellen die levensvatbaar in alle uithoeken van het plein zijn.
    3. De formules voor de berekening van de dichtheid van de cellen voor het voorbereiden van de kolven worden:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. toevoegen van ten minste 500.000 cellen per 25 cm 2 kolf. Pipetteer tot 5 mL van de DMEM in elke kolf. Het mengsel moet niet het bereiken van de hals van de kolf. Plaats ze in een incubator 37 ° C bij 5% CO 2, gedurende 3 dagen, dan veranderen de media.
  4. Astrocyt zuivering technieken: media wijzigen, mechanische en chemische strategieën
    Opmerking: de stofwisseling van astrocyten is hoog in vergelijking met andere celtypes, daarom in voedingswaarde beroofd voorwaarden, deze cellen Toon lage overlevingskansen na een paar dagen. In tegenstelling tot de astrocyten, microglia worden niet beïnvloed door voeding ontbering en vermenigvuldigen in dergelijke omgevingen 18. Als u wilt behouden van een beperkt aantal microglial cellen, wijzigen de auteurs de astroglial media voor de cultuur van de cel om de 3 dagen Deze constante verandering in cel media zal ook dalen de microglial bevolking die op de top van de astrocytic cel enkelgelaagde in de kolf 19 kan groeien.
    1. Gebruik een Pasteur pipet om de media met niet-aanhanger microglial cellen uit elk van de kolven gecombineerd. Wassen puin achtergelaten met behulp van steriele gefiltreerd PBS aan elk van de kolven op een dropwise wijze (5 mL/kolf).
    2. Toevoegen de steriele-gefilterd DMEM (met antibiotica en foetale runderserum) ontkleuring aan elke maatkolf (5 mL/kolf). Zachtjes doorroeren in een cirkelvormige beweging ter dekking van het gehele aardoppervlak.
    3. Plaats cellen in een 37 ° C incubator op 5% CO 2 8-10 dagen totdat de kolven confluentie bereiken (> 95% dekking van de plaat).
      Opmerking: Verschillende protocollen hebben aangetoond dat wanneer de astrocyten bereiken confluentie, mechanische methoden, zoals het schudden van de cultuur van 2 tot 24 h, leidt tot het detachement van cellen die op de top van deze astrocyten, voornamelijk microglia en voorloper cellen liggen 19 , 20.
    4. Non-astrocytic cellen zijn cultuur verminderd met het uitvoeren van de orbitale schudden bij 180 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten. Na het verwijderen van cellen in de bovendrijvende substantie, verse media is afgepipetteerde in de maatkolf (~ 15 mL).
    5. Te elimineren de Oligodendrocyt voorlopercellen, schudden snelheid verhogen tot 200 rpm voor 6 h 21 , 22 , 23, aspirate supernatant en Pipetteer verse media.
      Opmerking: Om te verminderen de aanwezigheid van microglia in de culturen, twee chemische methoden kunnen opeenvolgend worden gebruikt (niet tegelijkertijd) in de primaire cel cultuur methodologie: Arabinose cytosine (Ara-C) en L-leucine methyl ester (LME) 24.
    6. Onmiddellijk wanneer cellen bereiken confluentie (100%), 3-4 dagen na de mechanische verwijdering van microglia, deze cellen kunnen worden behandeld met 8 µM van de antimitotische samengestelde Arabinose cytosine (Ara-C) in DMEM voor 5 dagen (wijzigen naar verse Ara-C in DMEM dagelijks).
      Opmerking: Het punt van de tijd toe te voegen van Ara-C is van cruciaal belang omdat deze verbinding een antimitotische drug, die het aantal snel-delende cellen zoals microglia 19 , 25 en fibroblasten vermindert 26 . In tegenstelling tot microglia, wanneer confluente, astrocyten stoppen prolifererende via contact remming 27.
    7. 2 dagen voor de cellen om te herstellen van Ara-C behandeling toestaan.
    8. Een verdere verlaging van de besmetting van de microglial, nadat cellen confluentie bereiken, 50 mM van L-leucine methylester (LME) gebruiken in de DMEM vastgesteld op pH 7.4, gedurende 1 uur bij 37 ˚C.
      Opmerking: LME kruist het membraan van cellen en organellen en na wordt gehydrolyseerd, de L-leucine geproduceerd accumuleert in de lysosomen van deze cellen. De accumulatie van dit aminozuur leidt tot een osmotische zwelling en breuk van lysosomen 28 , 29. LME is zeer effectief bij het elimineren van microglia, ten opzichte van andere cellen 20 , 30.

4. Cultiveren van astrocyten bij 6-Wells-platen

  1. coverslips van de Coating met poly-D-lysine
    1. Put een dekglaasje aan in elk 35 mm petrischaal, dan Voeg 100 µL van de verdunde oplossing van de Poly-D-Lysine voor elke dekglaasje aan en wacht 1 h.
    2. Verwijderen van de Poly-D-Lysine en spoel tweemaal met 2 mL steriel water.
    3. Verwijderen van water en wacht op coverslips te drogen in de kap. Opslaan van de coverslips bij-20 ° C voor maximaal twee weken.
      Opmerking: Bevriezen van de verdunde oplossing van de Poly-D-Lysine; het kan worden opgeslagen voor maximaal twee weken.
  2. Trypsinebehandeling
    1. met behulp van een pipet van Pasteur, gecombineerd met het medium van de kolven. Voeg toe 5 mL/kolf van steriele gefiltreerd PBS te voorzichtig spoelen van de cellen.
    2. Aspirate uit de PBS, en voeg vervolgens toe 5 mL/kolf steriele gefiltreerd 0,25% trypsine en 0,5 mM EDTA-oplossing. Plaats de kolf in de 37 ˚C, 5% CO 2 incubator voor 10 min.
      Opmerking: Terwijl de cellen worden aan het broeden, verwarm 5 mL/destillatiekolf van verse volledige DMEM bij 37 ° C.
    3. Na 10 min van incubatie, doorroeren om ervoor te zorgen dat alle cellen worden getild aan de kolf. Voeg snel de 5 mL warme volledige DMEM aan elke maatkolf, te neutraliseren de trypsine.
    4. Pipetteer zachtjes de cellen op en neer meerdere malen te breken om het even welk " bosjes ". Zwevende cellen van beide kolven overbrengen naar een conische centrifuge tube van 15 mL.
    5. Centrifuge voor 5 min. op 200 x g voor het verzamelen van de cel-pellet. Resuspendeer de pellet in 500 µL van medium en overgaan tot het plaatsen van de cellen in de kolven.
      Opmerking: Voorbeelden van analyses te verrichten met cellen: 1) Reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) voor het analyseren van genexpressie; 2) westelijke vlek te evalueren eiwit expressie; 3) stroom cytometry analyse te kwantificeren van het aantal neurale voorlopercellen en proteïnen van belang; 4) immunofluorescentietest voor het analyseren van eiwit expressie en localisatie.
  3. Seeding astrocyten
    1. na de behandeling van de primaire astrocyten met trypsine (Zie 4.2), verzamelen van 100 μl van de celsuspensie in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL en voeg 100 μl van 0,5% trypan blauwe.
    2. Toevoegen 10 μL van de verzamelde suspensie in trypan aan de hemocytometer blauw met graaf alle cellen die levensvatbaar zijn.
    3. Gebruik van de formules in stap 3.3 voor het berekenen van de dichtheid van de cellen voor het voorbereiden van de kolven.
    4. Voorbereiden de multi goed gerechten door het toevoegen van een steriele, poly-D-Lysine gecoat dekglaasje aan aan elk putje. Pipetteer van de 50.000 cellen en vul de rest van het volume in elke multi goed schotel met verse medium (ongeveer 2 mL).
    5. Plaatst de multi goed gerechten in de incubator 37 ˚C op 5% CO 2 en, na 5-7 dagen, de astrocyten kunnen groeien en betrekking hebben op het gehele oppervlak van de coverslips.

5. OGD Protocol voor primaire astrocyten

  1. middelgrote voorbereiding van OGD
    1. Supplement Dulbecco ' s bewerkt Eagle ' s middellange-free glucose met 3,7 g/L natriumbicarbonaat, en 1% penicilline/streptomycine. Zie materialen in tabel 4.
    2. Purge 20 mL van de glucose vrij medium door borrelen met 95% N 2 / 5% CO, 2 voor 10 min op een stroom van 15 L/min (aangegeven met de flowmeter) door het invoegen van een serologische pipet op het gassysteem op de middellange.
      Opmerking: Na het verwijderen van het medium van zuurstof, breng de pH op 7.4 (zie opmerking op stap 2.1).
    3. Filteren het gezuiverd glucose-gratis medium gebruik van een systeem van de filter van de buis van 50 mL.
      Opmerking: Maken van verse OGD medium voor elk experiment, borrelen met 95% N 2 / 5% CO, 2 alvorens het te gebruiken, om ervoor te zorgen dat de cellen worden blootgesteld aan een omgeving gezuiverd van zuurstof.
  2. Experimentele procedure
    1. binnen de kap weefselkweek, verwijder Astrocyt medium van eerder bereid coverslips (zie stap 4.3.5) en wassen met cellulaire PBS tweemaal te verwijderen glucose in de cellen.
    2. Voeg toe 2 mL van het OGD-media aan elk goed en plaats de multi goed gerechten binnen de hypoxie kamer met hun deksels af
    3. Sluit het gasmengsel aan de klep van de ingang en laat de exit-klep open. Spoelen van de zaal met het gasmengsel van 95% N 2 / 5% CO 2, op 15 L/min gedurende 5 minuten
    4. Sluit de gasstroom, en eerst sluit de klem op de klep afsluiten, dan sluit de klem op de gas ingang ventiel slang.
      Opmerking: Zorg ervoor er geen lekkage gas door te bedekken het zegel van de kamer met zeepwater. Als het zegel veilig is, geen luchtbellen vormen moeten.
    5. Plaats van de hele zaal in de cel cultuur incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur of 6 h in OGD.
    6. Na incubatietijd voorbij is, de media van OGD gecombineerd en zorgvuldig Pipetteer 2 mL van volledige DMEM op elk 4,67 cm 2 goed voor de normoxic verwerken 24 h.

6. Protocol voor primaire Astrocyt immunofluorescentie voorbereiding

Opmerking: om te beoordelen Astrocyt zuiverheid, verschillende hersenen cel typen, zoals oligodendrocyten, microglia en neuronen kunnen worden gedetecteerd door immunofluorescentie met behulp van verschillende cel markeringen. Proliferatie markeringen, PCNA en propidium jodide (PI) kunnen worden gebruikt op primaire astrocyten blootgesteld aan OGD gevolgd door normoxic voorwaarden. Zie materialen in Tabel of Materials.

  1. Immunofluorescentie voorbereiding
    Opmerking: dit is een algemene immunofluorescentie protocol, kleine wijzigingen kunnen worden uitgevoerd om te bereiken van een optimale signaal (bijvoorbeeld, langere perioden van de incubatie, incubatietemperatuur). Iedere markeerdraad uit tabel 1 kan worden gebruikt volgens de fabrikant ' s-protocol.
    1. Om te beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen, cellen kunnen worden geïncubeerd gedurende 5 minuten bij 37 ° C met PI (5 µM in volledige DMEM) en was tweemaal met 2 mL PBS voor 5 min. cellen die Toon PI kleuring minder levensvatbare zijn.
      Opmerking: Gebruik de cellen behandeld in stap 5.2.6.
    2. Om op te lossen cellen na PI kleuring, voeg 2 mL 4% formaline per 4,67 cm 2 Nou, gedurende 20 minuten op 4 ˚C. Voor monsters met PCNA het label, de voorkeur fixing oplossing is methanol gedurende 10 minuten op 4 ˚C.
      Let op: Formaline en methanol giftig zijn.
      Opmerking: Controleer altijd specifiek antilichaam Protocollen van elke onderneming.
    3. Cellen met 2 mL PBS gedurende 5 minuten wassen en herhaalt u deze stap 3 keer.
    4. Incubeer de cellen in het blokkeren van de oplossing (0,5% niet-ionogene oppervlakteactieve stof, 10% FBS in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    5. De cellen met 2 mL PBS gedurende 5 minuten wassen, wassen 3 keer herhalen.
    6. Incubeer bij 4 ° C, 's nachts (16u), met primair antilichaam (PCNA, GFAP) in een oplossing van 1% FBS in PBS.
    7. Verwijderen van de primair antilichaam-oplossing, de cellen met 2 mL PBS gedurende 5 minuten wassen en herhaal deze stap 3 keer.
    8. Incubate met secundair antilichaam geconjugeerd met fluorophore in een oplossing van 1% FBS in PBS, gedurende 1 uur, bij kamertemperatuur.
    9. Wassen van de cellen met 2 mL PBS voor 5 min, herhaalt u deze stap 3 keer. Voeg 1 µg/mL DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) voor 5 min om vlek celkernen.
    10. Wassen van cellen met 2 mL PBS 5 min, herhaalt u deze stap tweemaal en houd in PBS.
    11. Voorbereiden van de coverslips op een microscoopglaasje met montage middellange.
  2. Confocal microscoop
    1. na het opzetten van de Microscoop, leg het dekglaasje aan kant naar beneden in het werkgebied Microscoop.
    2. Met behulp van de software, selecteer een laserstraal op 543nm voor GFAP-Cy3 geconjugeerd antilichaam.

7. Cel levensvatbaarheid Assay

  1. Trypsinize en kwantificeren van astrocyten door stap 4.3 en 4.4.
  2. 1 x 10 4 cellen per putje toevoegen aan 96-wells-platen en ze groeien naar confluentie.
  3. Hand van de methodologie uit stap 5, bloot gekweekte 96-wells-platen aan beide normoxic 1 h OGD of 6 h OGD.
  4. Na OGD behandeling, normoxic media wordt toegevoegd aan alle cellen gedurende 24 uur en levensvatbaarheid is gemeten met behulp van MTT reagens assay (gebruiken als fabrikant ' s instructies aangeven).
  5. Van een MTT-oplossing van 5 mg/mL, voeg toe 10% van het totale volume aan elk putje en incubeer gedurende 3 uur op 37 ˚C met het reagens MTT.
  6. Verwijder media en resuspendeer kristallen met behulp van 200 µL dimethylsulfoxide. Lees de plaat in een spectrofotometer bij 570 nm.
    Opmerking: Een verminderde absorptie ten opzichte van de cellen zal correleren met minder levensvatbaarheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste zorgen van de primaire astrocytic cultuur is de aanwezigheid van andere cellen zoals neuronen, oligodendrocyten, microglia en fibroblasten. In Figuur 1, geïsoleerde cellen van rat cortices hadden media wijzigingen om de 3 dagen en waren ofwel onbehandeld of behandeld met toegevoegd LME voor 1 h. 24 h later, cellen werden immunostained voor GFAP en counterstained met DAPI. Onbehandelde cellen toonde een gemiddelde van 39% niet-GFAP pos...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het isolement van astrocyten van rat cortices. In deze methode is het cruciaal belang voor het verminderen van de verontreiniging met andere cellulaire soorten zoals oligodendrocyten, microglia en fibroblasten. Verklein het aantal microglia en verschillende stappen kunnen worden genomen: de media, orbital schudden en chemische behandelingen wijzigen. Zodra de zuiverheid van de cultuur wordt bevestigd door immunofluorescentie met behulp van selectieve cellulaire markeringen of voor de meest promine...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Paola López Pieraldi dank voor de technische bijstand. A.H.M. is dankbaar voor de subsidies 8G12MD007600 en U54-NS083924, die deze publicatie worden ondersteund. Wij danken de NIH-NIMHD-G12-MD007583 subsidie voor de ondersteuning van de faciliteit. D.E.R.A. is dankbaar voor de fellowship geboden door NIHNIGMS-R25GM110513. We zijn dankbaar voor het gebruik van de gemeenschappelijke ruimte van de instrumentatie en de hulp van Dr. Priscila Sanabria voor het gebruik van de optische Imaging faciliteit van het programma van de RCMI door G12MD007583 verlenen. Wij willen bovendien Jose Padilla bedanken voor zijn uitstekende rol in filmen en bewerken van het visuele protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Instruments voor chirurgie - Stap 1
Operatie schaar 5.5”Roboz CompanyRS-6812Gereedschap dat wordt gebruikt om de ratten te onthoofden.
Gebogen pincet 7” Roboz CompanyRS-5271Houdt de huid van de rat vast terwijl de schedel wordt verwijderd.
Micro-dissectie schaar 4” Roboz CompanyRS-5882Snijdt zowel de huid als de schedel van de rat.
Micro-dissectie pincet 4” hoekig, fijn scherp Roboz CompanyRS-5095Houdt de huid van de rat vast terwijl de schedel wordt verwijderd.
Micro-dissectie pincet 4” licht gebogen 0.8Roboz CompanyRS-5135Gereedschap dat wordt gebruikt om cortices te scheiden.
Micro-dissectie pincetRoboz CompanyRS-4972Schaalt de hersenmeningen.
Dissectie microscoopOlympusSZX16Belangrijk voor het verwijderen van de meninge van de cortices.
DMEM-voorbereiding - stap 2
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium (DMEM)GibCo. Company11995-065Ondersteunt de groei van cellen.
NatriumbicarbonaatSigma-Aldrich CompanyS7277Supplement voor het celkweekmedium.
Foetaal bovien serum (FBS)GibCo. Company10437-010Serum-supplement voor de celkweek.
Penicilline-Streptomycine GibCo. Company15140-148Inhibeert de groei van bacteriën in de celkweek.
Filtersysteem 1L met 0.22um porieCorning431098
Astrocytenkweek - stap 3
Serologische pipetten 5mLVWR89130-896Om DMEM naar containers met cellen te pipetten.
Serologische pipetten 10mLVWR89130-898Om DMEM naar containers met cellen te pipetten.
Serologische pipetten 25mLVWR89130-900Om DMEM naar containers met cellen te pipetten.
Centrifuge konische buis 15mLSanta Cruz Biotechnologysc-200250
Safe-lock buis 1.5mLEppendorf022363204
Barrier Tips 200 uLSanta Cruz Biotechnologysc-201725
Barrier Tips 1 mLSanta Cruz Biotechnologysc-201727
Biohazard Oranje Zak 14 x 19"VWR14220-048
60mm petrischalenFalcon351007
Steriele gaaskussentjesHoneywell Safety89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar Lab System030010019Tritureert het hersenweefsel.
Stomacher 80 Blender Steriele ZakkenSewar Lab SystemBA6040Steriele zak voor de stomacher celhomogenisator.
Beker 400mLPyrex1000
Steriele celdissociatie zeef, maas #60 Sigma-Aldrich CompanyS1020Om een uniforme enkele cel suspensie te verkrijgen.
Steriele celdissociatie zeef, maas #100Sigma-Aldrich CompanyS3895Om een uniforme enkele cel suspensie te verkrijgen.
Invert fase microscoopNikonEclypse Ti-SControleert cellen op besmetting of abnormale celgroei.
75cm2 steriele kolvenFalcon353136
Multi-well plateFalcon353046
Micro dekglazen (dekglasjes), 18mm, rondVWR48380-046
Bright-Line hemacytometerSigma-Aldrich CompanyZ359629
Pasteur pipettenFisher Scientific13-678-20D
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich CompanyE7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)Sigma-Aldrich CompanyL1002Begunstigt de eliminatie van microglia cellen in de primaire corticale astrocytenkweek.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)Sigma-Aldrich CompanyC1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000Sigma-Aldrich CompanyP0899
Trypsine/EDTAGibCo. Company15400-054
Trypan BlauwSigma-Aldrich CompanyT8154
Fosfaat bufferoplossing (PBS) tablettenCalbiochem524650
Steriele waterSigma-Aldrich CompanyW3500
 OGD Medium Voorbereiding - stap 5
Centrifuge konische buis 50 mLVWR89039-658
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium-vrije glucoseSigma-Aldrich CompanyD5030Ondersteunt de groei van cellen.
NatriumbicarbonaatSigma-Aldrich CompanyS7277Supplement voor het celkweekmedium.
Penicilline-Streptomycine GibCo. Company15140-148Inhibeert de groei van bacteriën in de celkweek.
200mM  L-glutamine GibCo. Company25030-081Aminozuur dat de groei van cellen aanvult.
Phospahet bufferoplossing (PBS) tablettenCalbiochem524650
Filtersysteem 50mL met 0.22um porieCorning430320
Centrifuge kon

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278(2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574(2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282(2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987(2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26(2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van astrocytenzuurstof en glucoseprivatieprimaire astrocytenkweekGFAP immunofluorescentiePCNA proliferatieassayneonatale rattenkortexweefseldissociatiehypoxiekamercelproliferatiereactieve astrocyten

Gerelateerde artikelen