Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Antilichaam reacties zijn bereikt door verschillende kritische B-cel-intrinsieke processen, met inbegrip van somatische hypermutation (SHM), klasse-switch DNA recombinatie (CSR) en plasma celdifferentiatie. In de afgelopen jaren is epigenetische veranderingen of factoren, zoals Histon deacetylation en microRNAs (miRNAs), gebleken om te interageren met de B-cel genetische programma's vorm antilichaam reacties, terwijl de disfunctie van epigenetische factoren blijkt te leiden tot autoantibody reacties. Het analyseren van genoom-brede miRNA en mRNA uitdrukking in B cellen in reactie op de epigenetische modulatoren is belangrijk voor het begrijpen van de Epigenetische regulatie van de B-cel functie en antilichaam reactie. Hier tonen we een protocol voor inducerende B cellen ondergaan van MVO en plasma cel differentiatie, behandelen deze B-cellen met histone deacetylase (HDAC) remmers (Hotel) en analyseren van mRNA en microRNA expressie. In dit protocol, analyseren we rechtstreeks aanvullende opeenvolgingen van DNA (cDNA) met behulp van volgende-generatie mRNA sequencing (mRNA-seq) en miRNA-seq technologieën, in kaart brengen van de volgorde leest aan het genoom, en kwantitatieve omgekeerde transcriptie (qRT)-PCR. Met deze aanpak, die we hebben gedefinieerd dat in B cellen geïnduceerde ondergaan MVO en plasma celdifferentiatie, HDI, een epigenetische regulator, selectief miRNA en mRNA uitdrukking moduleert en verandert van MVO en plasma cel differentiatie.
Inleiding
Epigenetische merken of factoren, zoals methylation van DNA, histone posttranslationele modificaties en niet-coderende RNAs (inclusief microRNAs), moduleren functie cel door gene expression1te wijzigen. Epigenetische aanpassingen reguleren B-lymfocyt functie, zoals immunoglobulin klasse-switch DNA recombinatie (CSR), somatische hypermutation (SHM) en differentiatie geheugencellen B of plasmacellen, waardoor het moduleren van het antilichaam en autoantibody Reacties2,3. MVO en SHM vereisen kritisch activering-geïnduceerde cytosinetrifosfaat Dipyridamol (steun, gecodeerd als Aicda
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
het protocol volgt de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de institutionele zorg van het dier en gebruik commissies van de University of Texas Health Science Center in San Antonio.
1. stimulatie van de muis B cellen voor MVO, Plasma celdifferentiatie en HDI behandeling
- voorbereiding van milt cel schorsingen
Opmerking: alle stappen in een laminaire flow-kap met uitzondering van de muis euthanasie en dissectie.- De specifieke pathogenen vrije C57BL/6J muis (8-12 weken oud) CO 2 inademing euthanaseren.
- Leg de muis op ontleden bord met de buik naar boven gericht. PIN a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van onze protocol, gezuiverd B cellen geplaatst met LPS (3 µg/mL) en IL-4 (5 ng/mL) voor 96 h 30-40% van MVO te IgG1 en ~ 10% van plasma celdifferentiatie kan veroorzaken. Na behandeling met HDI (500µM VPA), de CSR aan IgG1 verlaagd naar 10-20%, terwijl plasma celdifferentiatie tot ~ 2 daalde % (Figuur 1). HDI-gemedieerde remming van MVO was verder bevestigd door verminderde aantallen na recombinatie Iμ-Cγ1 en volwassen VH-DJH-afschriften .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt uitgebreide benaderingen om te induceren van B-cel klasse schakelen en plasma celdifferentiatie; voor het analyseren van de gevolgen daarvan door epigenetische modulatoren, namelijk HDI; en het effect van HDI op mRNA en miRNA expressie in deze cellen worden opgespoord. De meeste van deze benaderingen kan ook worden gebruikt voor het analyseren van de impact van epigenetische factor op menselijke expressie van B-cel functie en mRNA/miRNA. De qRT-PCR en mRNA-seq/miRNA-seq benaderingen kunnen ook worden g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de NIH grants AI 105813 en AI 079705 (op PC), toekennen het Bondgenootschap voor Lupus onderzoek Target identificatie in Lupus Grant ALR 295955 (op PC), en het onderzoek van de artritis National Research Foundation (HZ). TS werd gesteund door de kindergeneeskunde Medical Center, tweede Xiangya ziekenhuis, centrale Zuid-Universiteit, Changsha (China), in het kader van het Xiangya-UT School van geneeskunde San Antonio medisch student bezoekende programma.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 muizen | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X met L-Glutamine (Grootte: 6 x 500mL; Met L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Oplossing 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes met Dop | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Naald Alleen 18 Gauge 1.5 inch KORT BEVEL 100/doos | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-muis CD138 (Syndecan-1) Antilichaam | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antilichaam | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-muis/mens CD45R/B220 antilichaam | Biolegend | 103212 | |
| Muis APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-muis IgM Antilichaam | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-muis/mens CD45R/B220 Antilichaam | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Muis CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumine, Fractie V, Warmteshockbehandeld | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysacchariden uit Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant muis IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (grootte: 10 ug) | |
| Valproïnezuur natriumzout | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Klasse II Type A2 Bioveiligheidskast | The Baker Company | SG404 | |
| Grote capaciteit Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Ronde Bodem Polystyreen Testbuisje | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifugebuizen | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microbuisje, helder | Genesee | 22-282 | |
| Hoge Snelheid Easy Reader Plastic Centrifugebuizen 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Draagbare Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serologische pipettentips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serologische pipettentips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serologische pipettentips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-wells platen | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Niet-Gekoeld | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontaal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Gekoeld | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Vaste Hoek | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Ong. 0,75% Ethanol als Conserveermiddel/Moleculair Biologie) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Vrije Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrofotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthese Systeem RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Platen, verpakking van 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD |
Referenties
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
