Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Samenvatting

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Samenvatting

-Perfusie gebaseerde eilandje-isolatie protocollen van grote zoogdieren pancreata zijn goed ingeburgerd. Dergelijke protocollen worden gemakkelijk uitgevoerd in vele laboratoria vanwege de grote omvang van de ductus pancreaticus die het mogelijk maakt om collagenase injectie en daaropvolgende weefselperfusie. Daarentegen eilandje isolatie van kleine pancreata, zoals die van pasgeboren muizen is uitdaging omdat perfusie is niet gemakkelijk verkrijgbaar in de kleine pancreata. Hier kunt u een gedetailleerde eenvoudige procedure die aanzienlijke aantallen eilandjes van pasgeboren muizen met visuele hulp herstelt beschrijven we. Vers ontleed gehele pancreata werden gedigereerd met 0,5 mg / ml collagenase IV opgelost in Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) bij 37 ° C, in microcentrifugebuizen. Buizen werden regelmatig afgeluisterd om weefsel verspreiding te helpen. Wanneer de meeste van het weefsel werd gedispergeerd kleine clusters ongeveer 1 mm, werden lysaten 3:57 maal met kweekmedium gewassen met 10% foetaal runderserum (FBS). Islet clusters,verstoken van herkenbare acinar weefsels, kan vervolgens worden teruggewonnen onder ontleden stereoscoop. Deze methode herstelt 20-80 kleine tot grote eilandjes per pancreas van pasgeboren muizen. Deze eilandjes zijn geschikt voor de meeste denkbaar downstream assays, waaronder insuline secretie, genexpressie en cultuur. Een voorbeeld van insulinesecretie assay wordt aan de isolatie te valideren. De genetische achtergrond en de mate van vertering de grootste factoren die de opbrengst. Vers gemaakte collagenase oplossing met een hoge activiteit heeft de voorkeur, aangezien het helpt bij endocriene exocriene isolatie. De aanwezigheid van kationen [calcium (Ca2 ⁺⁾ en magnesium (Mg2 ^+)] in alle oplossingen en foetaal runderserum in de was / picking media nodig zijn voor een goed rendement eilandjes met goede integriteit. Een ontleden scope met een goed contrast en vergroting zal ook helpen.

Inleiding

Het isoleren van pure pancreaseilandjes is essentieel voor het meten van glucose-gestimulante insulinesecretie (GSIS) van bètacellen en voor eilandjetransplantatie van lijkschoners ^1-3. Het is ook noodzakelijk om endocrijn genexpressie in eilandjecellen vast te stellen ^{4, 5}. Voor dit doel zijn gedetailleerde protocollen opgesteld om de isolatie van pancreaseilandjes uit grote alvleesklieren mogelijk te maken (⁶ en referenties daarin). Deze methoden zijn gebaseerd op enzymatische perfusie om acinar-weefsel los te koppelen van eilandjeweefsel, gekoppeld aan gradiëntscheiding en handmatig plukken. Aldus kan eilandje-isolatie uit grote pancreassen gemakkelijk worden uitgevoerd in de meeste laboratoria. Aan de andere kant bestaat er geen gedetailleerd stapsgewijs protocol om eilandjes te isoleren uit pancreassen die te klein zijn om te perfunderen.

Het bestuderen van genexpressie en functie van neonatale eilandjes is belangrijk. Neonatale eilandjes hebben andere eigenschappen dan volwassenen wat betreft insulinesecretie en proliferatievermogen ^{7, 8}. Echter, het isoleren van eilandjes van pasgeboren dieren, vooral muizen, is een uitdaging vanwege de kleine omvang van de pasgeboren pancreas. De grootte verhindert het gebruikelijke perfusieproces wanneer collagenase wordt geïnjecteerd via de pancreasgang. Inderdaad, verschillende papers hebben studies gepresenteerd langs deze lijnen, met enzym- of niet-enzymgeassisteerde isolatieprocedures ^{7, 9, 10}. Echter, een gedetailleerde beschrijving van het eilandje-isolatieproces met visuele hulp ontbreekt ^{7, 9}, waardoor het voor de meeste onderzoekers een uitdaging is om soortgelijke studies uit te voeren.

We hebben verschillende verschillende omstandigheden onderzocht die hoge kwaliteit eilandjes uit neonatale muizen opleveren. Hier presenteren we een protocol dat onderzoekers zal helpen de belangrijkste details in het eilandje-isolatieproces te leren. Dit protocol is toepasbaar op muizenpancreas tot twee weken oud, waarna perfusie kan worden uitgevoerd voor routinematige eilandje-isolatie. Eilandjes kunnen direct worden gebruikt voor insulinesecretie en genexpressie-assays.

Protocol

Dierlijk gebruik volgt de in protocol M procedures / 11/181 van de Vanderbilt Institutional Animal Care en gebruik Comite voor Gu goedgekeurd. CD1 of CBA / Bl6 muizen werden gekocht bij commerciële leveranciers en in de Vanderbilt dier faciliteit gekruist met pasgeboren muizen te verkrijgen.

1. Bereiding van Muizen, Stock Solutions en Equipment

1. Voor de muis kruis: het opzetten van een muis kruis en noteer de inpluggen data om de experimentele planning te helpen. CD1 muizen meestal bevallen rond dag 19 na de paring. Gebruik CD1 of CBA / Bl6 kruist om CD1 of CBA / Bl6 pasgeborenen te verkrijgen, respectievelijk. Kruisingen tussen de twee lijnen te gebruiken CD1 vrouwtjes en CBA / Bl6 mannetjes.
2. Voor de collagenase voorraad: weeg 200 mg collagenase type IV met een hoge precisie balans. Over te dragen aan een 50 ml centrifugebuis. Los op in 40 ml HBSS met Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ (1,26 en 0,5 mM, respectievelijk) een 5 mg / ml voorraadoplossing te maken.
   1. Laat collagenase aanontbinden gedurende ~ 30 min met zacht schudden. Aliquot en bewaar de oplossing bevroren -20 ° C als voorraad, die actief blijft gedurende ten minste één jaar.
3. Autoclaaf meerdere paren pincetten, scharen en P20 tips steriliseren dissectie en eilandje plukken.
4. Voor de 1 M glucose voorraad: weeg 9 g glucose in een 50 ml centrifugebuis, voeg 50 ml RPMI 1640 medium met glucose lossen. Laat van 4 ° C tot gebruik, maar niet meer dan 6 maanden.

2. Werken Solutions

LET OP: De dag van het eilandje isolatie, de voorbereiding van de volgende reagentia.

1. Voor het type collagenase IV werkende oplossing: dooi en verdun collagenase voorraad op ijs. Verdeel 0,15 ml bouillon in elk 1,7 ml microfugebuis. Voeg 1,35 ml HBSS met Ca ²⁺ / Mg ^2+. Keer de buis 5 keer. Laat op ijs gedurende 15 min.
   1. Spin op hoge snelheid gedurende 3 minuten in een microcentrifuge. Transfer supernatant naar een nieuwe buis. Laat op ijs tot gebruik. Gooi de buis met onoplosbare puin.
2. Voor de volledige RPMI 1640 media: voeg 2,5 ml 1 M glucose, 50 ml hitte-geïnactiveerd FBS en 5 ml 100x Pen-Strep voorraad in 500 ml RPMI 1640 media. Laat op ijs tot gebruik.

3. Pancreas Isolatie en de spijsvertering

1. Euthanaseren pasgeborenen met isofluraan, gevolgd door onthoofding volgens de goedgekeurde protocollen.
2. Leg de muis met zijn buik naar boven. Spray met 70% ethanol voor sterilisatie.
3. Til het beenvlies met een pincet en snijd de huid en spierlagen lengterichting langs de middellijn met een schaar, uit het genitale gebied de ribbenkast. Dit opent de buikholte om alle interne organen bloot te leggen.
4. Transfer alle inwendige organen een 100 cm schotel met een pincet. Zoek de pancreas, hetgeen een verspreide orgel met een dorsale gedeelte dat vast aan de maag en milt en ventrale gedeelte dat vast aan de twaalfvingerige darm ^11.
5. Voeg HBSS in de schaal om de organen onder te dompelen. In oplossing, de pancreas weefsels niet meer vast aan de twaalfvingerige darm, maag en milt. Het is gemakkelijk herkenbaar onder een dissectie scope vanwege zijn typische witte kleur. Gebruik een pincet om weg te komen uit de omliggende weefsel en de overdracht schil de pancreas weefsel om een ​​nieuwe 60 mm schotel met HBSS.
6. Snijd elke alvleesklier met een schaar in stukken kleiner dan 5 mm tegenover elke dimensies. Verwijzing naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Tot vijf pancreata (jonger dan P7) worden gedigereerd in een buis. Voor P8-P16 muizen, gebruiken één buis per alvleesklier.
7. Voeg 0,5-1 ml collagenase werkende oplossing aan elke buis (0,2 ml per P1-P7 pancreas Gebruik 0,5 ml per P8-P16 pancreas.). Laat de buis in een 37 ° C incubator gedurende maximaal 15 minuten. Omkeren van de buis twee keer per min.
8. Na ~ 5 min, tikt u op de buis naar de vertering status van de pancreas weefsel te controleren. Ga door het verteringsproces tot het grootste deel van de pancreasweefsel verschijnt als gefragmenteerd cel clusters, met een diameter van <2 mm. Het lysaat wordt troebel, wat te wijten is aan normale acinaire cel autolyse verschijnen.

4. Lysate Wassen

1. Spin het lysaat bij 500 g gedurende 10 s in een microcentrifuge. Verwijder de bovendrijvende laag met een P1,000 Pipetman. De bovenstaande vloeistof moet verschijnen troebel, maar verstoken van de cel clusters. Gebruik geen aspiratie, die snel weg kunnen zuigen het weefsel fragmenten onderaan vanwege de aanwezigheid van enkele kleverige DNA.
2. Voeg 1 ml RPMI 1640 compleet medium. Tik op de buis voorzichtig om de gefragmenteerde lysaat mengen. Te keren op en neer 10 keer. Herhaal stap 4.1.
3. Herhaal stap 4.2 nog twee keer of totdat de bovenstaande blijkt duidelijk. Resuspendeer gewassen alvleesklier fragmenten in 1 ml compleet RPMI 1640 media.

5. Islet Isolatie

Opmerking: Voor kleine aantallen pancreata, directe hand oppakken zoals hieronder (5,1) kan worden gebruikt voor eilandje isolatie. Voor grote aantallen pancreata (> 6), de in 5,2 werkwijze heeft de voorkeur.

1. Direct de hand-picking:
   1. Transfer lysaat uit stap 4.3 op een 60 mm schaal. Voeg 5 ml compleet RPMI 1640 media. Breng onder een dissectie microscoop.
   2. Stel de helderveld verlichting op de microscoop. Pas de lichtintensiteit tot ~ 50% van het maximale vermogen. Onder deze voorwaarde, eilandjes verschijnen als lichtroze clusters, terwijl acinaire cellen zo donker onregelmatig gevormde clusters (Figuur 1A). Een vergroting van ~ 50X (het combineren van de kracht van de doelstelling en het oog stuk) wordt aanbevolen om de beste manier van visualiseren eilandjes en de pipet tip opening gelijktijdig voor het plukken bieden.
   3. Pick-up eilandjes met een P20 pipet tip terwijl het vermijden van acinar clusters. Verdeel eilandjes-verrijkte fracties in nieuw 60 mm schaal met RPMI compleet medium (Figuur 1B).
   4. Herhaal de hand picking-proces nog twee keer. Laat pure eilandjes in een nieuw 60mm schotel met 4 ml compleet RPMI media (figuur 1C).
2. Gradiënt centrifugeren:
   1. Bereid een 15 ml centrifugebuis dat is voorgeladen met 2 ml polysucrose en natrium diatrizoaat met een dichtheid van 1,077 g / ml. Laat de buis op ijs tot gebruik.
   2. Breng de suspensie van stap 4.3 op de bovenkant van de polysucrose en natrium diatrizoaat oplossing met een Pasteur pipet. Niet storen de onderste laag. Weefsels van maximaal 10 pasgeboren of 2 P17 pancreata kan worden geladen in elke 15 ml buis.
   3. Spin de buis op ~ 600 xg in een swing rotor gedurende 15 min bij 4 ° C. Gebruik rem-off instellingen.
   4. Na centrifugeren overdracht van de media en de interfase lagen (merk op dat onder ideale bedrijfsomstandigheden, wordt de eilandjes worden in de interfase tussen de polysucrose en kweekmedia na centrifugeren) in een nieuwe 15 ml buis. Voeg 10 ml media, meng grondig, maar voorzichtig.
   5. Spin down the-eilandje verrijkte fractiebij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het wassen media. Herhaal het wassen nog een keer met een complete RPMI media. Resuspendeer pellets in 4 ml media, die meestal eilandjes en leidingen (figuur 1D) bevat.
   6. Hand-pick de eilandjes, zoals beschreven in paragraaf 5.1.

6. GSIS Testen in geïsoleerde eilandjes

1. Incubeer de eilandjes uit stap 5.1.4 in volledige RPMI media 2 uur in een 37 ° C weefselkweek incubator.
2. Gebruik een pipet om RPMI verwijderen onder een dissectie microscoop. Voeg 3 ml KRB oplossing met 2,8 mM glucose op de plaat ^3. Swirl 10 keer om de eilandjes te wassen. Verwijder KRB oplossingen.
   1. Herhaal het wasproces keer. Incubeer de eilandjes met 3 ml KRB oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator.
3. Aliquot 1 mL KRB in elk putje van een 12-wells plaat. Pre-warm de KRB voorraad en de plaat tot 37 ° C in een incubator.
4. Was de eilandjes tweemaal met voorverwarmd KRB zoals in 6.2. Transfer 10 eilandjes aan elk putje van de voorverwarmde platen. Incubeer in een 37 ° C incubator.
5. Na 45 minuten intrekken 50 pl supernatant. Bevat de insulineoplossing afgescheiden onder basale glucose.
6. Voeg 32 ul 500 mM glucose. Swirl de plaat 20 keer om de oplossing te mengen. Incubeer in een 37 ° C incubator. Swirl de plaat 5 maal om de 5 min.
7. Na 45 min, in te trekken 50 ul supernatant. Dit is de insuline afgescheiden onder hoge glucose.
8. Breng alle eilandjes naar een 1,5 ml buis. Bevriezen in -20 ° C gedurende 30 minuten. Ontdooien bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Herhaal het invriezen en ontdooien proces.
9. Voeg 0,5 ml 70% ethanol met 20 mM HCl. Laat 's nachts. Dit is de insuline in eilandjes.
10. Gebruik conventionele ELISA voor insuline niveaus te testen, eerder ³ beschreven.

Resultaten

Onder optimale omstandigheden kan de onderhavige methode verkregen 20-80 eilandjes van elke kleine muis alvleesklier. Dit aantal is afhankelijk van de genetische achtergrond, leeftijd van de muizen, en de grootte van de eilandjes te vorderen. Onder de meest gebruikte, CD1 out-gefokt en C57BL / 6J raszuivere muizen produceren minder eilandjes met een kleinere omvang dan hybriden tussen CD1 en C57BL / 6 of commerciële B6CBAF1 / J muizen doen. Directe hand oppakken algemeen heeft een kleine...

Discussie

Hier geven we een stap-voor-stap protocol eilandje isolatie van pancreata die te klein om conventionele perfusie. Naar verwachting eilandjes klaar voor eilandjes gebaseerde studies zoals beta-cel zuivering genexpressie analyse eilandje beta-cel maturatie, proliferatie, cel-stress responsen, celoverleving, metabolisme en functioneel beheer GSIS, enz verkregen. Dit zal, naar ons beste weten is de eerste gedetailleerde visuele protocol dat nieuwe onderzoekers gidsen voor eilandje isolatie uit te voeren vanaf neona...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Collagenase Type IV	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C5138
1x HBSS met Ca2+/Mg2+	Mediatech/Cellgro, Manassas, VA	MT21020CV	Als HBSS zonder Ca2+/Mg2+ wordt verkregen, kunnen CaCl2 en MgSO4 worden toegevoegd tot respectievelijk 1,26 en 0,5 mM.
RPMI 1640 zonder glucose	Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA	11879-020	Glucose moet worden toegevoegd tot specifieke niveaus om niet te interfereren met het daaropvolgende eilandgebruik.
Glucose	Sigma Aldrich, St Louis, MO	G-7021
Polysucrose en natriumdiatrizoaat-oplossing	Sigma Aldrich, St Louis, MO	Histopaque-10771
Stereoscoop	Carl-Zeiss, Oberkochen, Duitsland	Stemi2000
Stereoscoop	Leica, Wetzlar, Duitsland	Leica M165
Microcentrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	Centrifuge 5417C
Centrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	Centrifuge 5810R
15-mL centrifugebuizen	VWR, Radnor, PA	89039-666
50-mL centrifugebuizen	VWR, Radnor, PA	89039-658
Precisiebalans	VWR, Radnor, PA	VWR-225AC
Microfugebuizen	VWR, Radnor, PA	87003-294
Pipetman P1000	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123602
Pipetman P20	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123600
100 x 15 mm schaal	VWR, Radnor, PA	25384-088
60 x 15 mm schaal	VWR, Radnor, PA	25384-168
12-wells platen	VWR, Radnor, PA	665-180
Schaar	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	14080-11
Pincet	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	5708-5
CD1 muizen	Charles River Laboratories, Wilmington, MA	CD-1
C57BL/6J	The Jackson Laboratory, Farmington, CT	C57BL/6J
B6CBAF1/J	The Jackson Laboratory, Farmington, CT	B6CBAF1/J