Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ioniserende straling (IR) induceert talrijke stabiele en onstabiele chromosomale aberraties. Onstabiele aberraties, waarbij de chromosoommorfologie aanzienlijk wordt aangetast, kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door conventionele chromosoomkleuringstechnieken. De detectie van stabiele aberraties, die betrekking hebben op uitwisseling of translocatie van genetisch materiaal zonder aanzienlijke wijziging in de chromosoommorfologie, vereist echter geavanceerde chromosoomkleuringstechnieken die afhankelijk zijn van in situ hybridisatie van fluorescent gelabelde DNA-sondes, een chromosoomkleuringstechniek die populair bekend staat als fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). FISH-sondes kunnen specifiek zijn voor volledige chromosooom(en) of precieze subregio's op chromosooom(en). De methode staat niet alleen de visualisatie van stabiele aberraties toe, maar kan ook de detectie mogelijk maken van het/de chromosooom(en) of specifiek DNA-sequentie(s) die betrokken zijn bij een specifieke aberratievorming. Er zijn verschillende chromosoomkleuringstechnieken beschikbaar in de cytogenetica; hier worden twee zeer gevoelige methoden, meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY), besproken om inter-chromosomale stabiele aberraties te identificeren die zich vormen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling. Hoewel beide technieken afhankelijk zijn van fluorescent gelabelde DNA-sondes, zijn de detectiemethode en het proces van beeldverwerving van de fluorescente signalen anders. Deze twee technieken zijn gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, zoals stralingsbiologie, kankercytogenetica, retrospecieve stralingsbiodosimetrie, klinische cytogenetica, evolutionaire cytogenetica en vergelijkende cytogenetica.
Inleiding
De twee meest betrouwbare methoden voor het identificeren van straling-geïnduceerde stabiele inter-chromosomale afwijkingen zijn multiple fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH), die het mogelijk maakt om twee of meer chromosomen gelijktijdig te kleuren, en spectraal karyotypering (SKY), die een aparte kleur geeft aan elk homoloog chromosoombeslag in het genoom. In tegenstelling tot onstabiele afwijkingen, zijn stabiele afwijkingen van persistente aard en kunnen ze voor meerdere generaties worden overgedragen in bestraalde populaties1, en worden ze beschouwd als kritische moleculaire "handtekeningen" van door straling geïnduceerde cytogenetische....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het dier protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen. Alle dieren werden gehuisvest onder standaard voorzien van airconditioning, dier faciliteit bij 20 ± 2 ° C met 10 - 15 per uur cycli van frisse lucht en gratis toegang tot standaard knaagdier voedsel en water. Bij aankomst werden de muizen in quarantaine gehouden voor 1 week en op voorwaarde dat gecertificeerd knaagdieren chow.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Total body bestraling induceert talrijke chromosomale afwijkingen in de beenmergcellen van bestraalde muizen. Het huidige protocol is geoptimaliseerd voor in vivo mitose van beenmergcellen na blootstelling aan straling, oogst van beenmergcellen van de achterpoten van bestraalde muizen, de isolatie van beenmerg mononucleaire cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie, bereiding van metafase cel smeersels, en daaropvolgende detectie van straling veroorzaakte stabiele chromosomal.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Verschillende kritische stappen bepalen het succes van mFISH en SKY. De eerste en meest kritische stap is het colchicine behandeling in vivo mitose van het beenmerg mononucleaire cellen te optimaliseren. De colchicine concentratie en de duur van de behandeling individueel of in onderling overleg bepalen de mitotische index evenals chromosoom condensatie-twee belangrijke voorwaarden voor een effectieve chromosoom schilderij. Een hoge concentratie colchicine of langere behandeltijd leidt tot zeer gecondenseerde c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door Arkansas Space Grant Consortium en het National Space Biomedical Research Instituut met behulp van National Aeronautics and Space Administration, verleent NNX15AK32A (RP) en RE03701 (MH-J), en P20 GM109005 (MH-J), en de Amerikaanse Veterans Administration ( MH-J). Wij danken Christopher Fettes, Program Coordinator voor het Ministerie van Milieu en Occupational Health aan de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen, voor redactionele ondersteuning bij de voorbereiding van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Formamide | Sigma-Aldrich | 221198-100ML | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| SKY Laboratory Reagent for Mouse | Applied Spectral Imaging | FPRPR0030/M40 | |
| CAD - Concentrated Antibody Detection Kit | Applied Spectral Imaging | FPRPR0033 | |
| Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua | Applied Spectral Imaging | FPRPR0182/10 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545B | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics | Fisher Scientific | AC45055-0025 | |
| Fisherbrand Glass Staining Dishes with Screw Cap | Fisher Scientific | 08-816 | |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | Life Technologies | 10575-090 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Colcemid powder | Fisher Scientific | 50-464-757 | |
| Histopaque-1083 | Sigma-Aldrich | 10831 | |
| Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator | J. L. Shepherd & Associates | Model 484B | |
| Syringe 1 mL | BD Biosciences | 647911 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Fisher Scientific | MEX02761 | |
| PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10-437-010 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454SK-4 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | AC295320010 | |
| Zeiss Microscope | Zeiss | AXIO Imager.Z2 |
Referenties
- Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
- Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
