Methodenartikel

Isolatie van Mouse Endometrial epitheliale en stromale cellen voor

26.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55168

⸱

2 maart 2017

 ,  , 
1Department of Development and Regeneration, Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een gestandaardiseerde en gevalideerde methode voor de isolatie en kweek van primaire muis endometriale stroma- en epitheelcellen, die kan worden gebruikt in een cocultuursysteem om in vitro decidualisatie te bestuderen.

Samenvatting

Decidualisatie een progesteron-afhankelijke differentiatieproces van endometriale stromale cellen en is een voorwaarde voor een succesvolle implantatie embryo. Hoewel veel pogingen zijn gedaan om de onderliggende mechanismen van decidualisatie blijkt, blijft de exacte signalering tussen de epitheliale cellen die in contact met het embryo en de onderliggende stromale cellen slecht begrepen. Daarom bestuderen decidualisatie op een manier die zowel de epitheliale en stromale cellen houdt rekening kon verrij- de moleculaire details van decidualisatie. Daartoe in vivo modellen van kunstmatige decidualisatie fysiologisch het meest relevant; echter manipulatie van intercellulaire communicatie beperkt. Momenteel, in vitro kweken van endometriale stromale cellen worden gebruikt om de modulatie van decidualisatie onderzoeken door verschillende signaalmoleculen. Conventioneel, humane of muizen endometriale stromale cellengebruikt. Echter, de beschikbaarheid van menselijke monsters vaak gering. Bovendien is het gebruik van murine weefsels gepaard met variatie in de wijze van kweken. Deze studie geeft een gevalideerde en gestandaardiseerde methode om pure Endometrial epitheelcellen (EEG) en Stromal Cell (ESC) culturen met behulp van volwassen intact muizen behandeld met oestrogeen gedurende drie opeenvolgende dagen te verkrijgen. Het protocol is geoptimaliseerd om de opbrengst levensvatbaarheid en zuiverheid van de cellen te verbeteren en verder uitgebreid om decidualisatie studeren in een gemengde cultuurmedium van EEG en ESC. Dit model kan geschikt zijn om het belang van beide celtypes in decidualisatie benutten en de bijdrage van belangrijke signaalmoleculen uitgescheiden door EEG of ESC tijdens de intercellulaire communicatie evalueren.

Inleiding

De menselijke endometrium is de binnenvoering van de baarmoeder en ondergaat de maandelijkse cyclus van afbraak en reparatie als voorbereiding op mogelijke zwangerschap. Het bestaat uit een enkele laag van epitheelcellen die de baarmoeder lumen en de onderliggende stroma die in dikte varieert afhankelijk van fluctuaties van geslachtshormonen oestrogeen en progesteron. Tijdens de luteale fase zal de postovulatory progesterongolf differentiatie van endometriale stromale cellen in grotere, ronde decidua cellen, een proces genaamd decidualisatie 1, 2 te induceren. Bij de mens komt dit verschijnsel spontaan de predecidua vormen, maar wordt meer uitgesproken bij embryo implantatie. Een functionele consequentie van decidualisatie is dat de baarmoeder ontvankelijk voor innesteling van het embryo wordt kortstondig. Dit interval wordt aangeduid als het "venster van implantatie. Tijdens de vroege periode van embryoimplantatie, de gedecidualiseerde endometrial stromale cellen rondom de implantatie embryo een barrière voor de doorgang van schadelijke stoffen aan het embryo 3 voorkomen. Tijdens de zwangerschap wordt dit decidua nutriënten aan de foetus voordat placentation heeft plaatsgevonden, en zal later vormen de maternale deel van de placenta 4.

Ethische en praktische overwegingen beperken de opzet van humane studies om het proces van decidualisatie onderzoeken en het gebruik van diermodellen hebben geleid. Als lid van de groep hemochorial placenta, zal het endometrium van knaagdieren ook decidualisatie ondergaan vóór 5 placenta. Bij knaagdieren, maar de opening van het decidualisatie is afhankelijk van de aanwezigheid van blastocysten in de baarmoeder lumen, wat aangeeft dat een extra stimulans moeten de deciduale respons 6 veroorzaken. Dit impliceert een ingewikkelde communicatie tussen the endometrium epitheelcellen die direct contact met de blastocyst hebben, en de onderliggende stromale cellen. Niettemin kan decidualisatie kunstmatig worden geïnduceerd middels stimuli mechanische krassen of instillatie olie in een hormonaal geprimede baarmoeder. Hoewel in vivo studies met behulp van kunstmatige decidualisatie modellen ons hebben toegestaan om onze inzichten te verbeteren in het complexe proces van signalering decidualisatie, mechanistische diepgaande studies, bijvoorbeeld, het onderzoek van de onmisbare communicatie tussen epitheliale en stromale cellen, zijn beperkt. Derhalve kunnen in vitro decidualisatie studies worden gebruikt om belangrijke paden manipuleren en bestuderen fundamentele processen. Hiertoe kunnen endometriale stromale primaire celculturen worden opgezet vanuit humane of knaagdier endometrium. Gebruikmakend knaagdieren instemt het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren de rol van een specifiek eiwit van belang gedurende het proces decidualisatie onderzoeken. Echter, onvolwassen, prepuberty muizen worden vaak gebruikt om complicaties van de loopsheid voorkomen, terwijl in andere gevallen baarmoeders verzameld bij alle fasen van de loopsheid, waardoor een heterogeniteit in de kweken. Bovendien is het proces van decidualisatie onderzocht bij verschillende protocollen, bijvoorbeeld door (i) vullen hormonen (oestrogeen, progesteron of cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP)) naar het kweekmedium, of door (ii) isolatie van decidua cellen uit muizen dag 4,5 van (pseudo) zwangerschap, die extra behoefte aan plug controle en gevasectomiseerde mannetjes te eisen. Deze beperkingen tonen de noodzaak van een gestandaardiseerde methode studie in vitro decidualisatie. In deze studie, een fysiologisch model voor in vitro onderzoeken decidualisatie vanaf volwassene zal niet (pseudo) zwangere muizen worden gepresenteerd. In deze werkwijze dagelijkse injectie van 17β-oestradiol (E2) proliferatie van endometriale cellen induceren, wat resulteert in een verhoogde opbrengst van homogene en pure celpopulaties. Bovendien is het gebruik van een coculturing systeem maakt het onderzoek mogelijk van de epitheliale-stromale overspraak en de mogelijkheid om het proces van decidualisatie manipuleren op verschillende niveaus.

Protocol

AlexaFluor

Alle dierproeven voor deze studie zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de KU Leuven (België) (Project P174/2013). Muizen werden onder standaardvoorwaarden gehuisvest, met ad libitum toegang tot voer en kraanwater, en gehouden onder gecontroleerde omstandigheden (23 ±1.5 °C, relatieve luchtvochtigheid 40 - 60%, 12/12 licht/donkercyclus).

1. Muizen

  1. Gebruik een commercieel verkrijgbare muisstam (d.w.z. C57Bl/6, vrouwelijk 8 - 12 weken oud). Typisch zullen 4 - 5 muizen een geschikte hoeveelheid cellen opleveren voor verdere experimenten.
  2. Injecteer intacte muizen subcutaan met 100 µL van de 17β-estradiol (E2) oplossing (100 ng/100 µL) gedurende 3 opeenvolgende dagen vóór de isolatie om de fase van de oestruscyclus van de dieren te standaardiseren en om proliferatie van endometriumcellen te induceren. Het is niet nodig om de cyclusfase van de muizen te controleren voordat het protocol wordt gestart vanwege de 3 dagen estradiolbehandeling.

2. Voorbereidingen

  1. Maak een oplossing van 100 ng/100 µL E2 in arachis olie. Voor de injecties van vijf muizen (zoals beschreven in 1.2), is een hoeveelheid van 1,5 mL nodig.
    1. Los 1 mg E2 op in 1 mL ethanol om een stamoplossing van 1 mg/mL te hebben.
    2. Verdun deze stamoplossing 1:1.000 in arachis olie.
  2. Maak 500 mL van Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) 1x aangevuld met 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine (hierna HBSS+ genoemd).
  3. Maak 500 mL van gefilterd Mouse Endometrial Stromal Cell (MESC) medium voor het kweken van MESC: Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F12 (DMEM/F12) met fenolrood, L-glutamine en 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES) bevattend 10% FBS, 0,5 µg/mL amfotericine B, en 100 µg/mL gentamicine (hierna MESC medium genoemd).
  4. Maak 500 mL van gefilterd 2% MESC medium voor het kweken van MESC tijdens decidualisatie: DMEM/F12 met fenolrood, L-glutamine en HEPES bevattend 2% FBS, 0,5 µg/mL amfotericine B, en 100 µg/mL gentamicine.
  5. Bereid 500 mL van gefilterd Mouse Endometrial Epithelial Cell (MEEC) medium voor: DMEM bevattend 10% FBS, 0,5 µg/mL amfotericine B, 100 µg/mL gentamicine, 25% MCDB-105 medium, en 5 µg/mL insuline (hierna MEEC medium genoemd).
  6. Bereid Poly-L-Lysine (PLL) gecoate dekglasjes voor MESC-kweek.
    1. Los 25 mg PLL op in 250 mL gedistilleerd water. Filter de oplossing met een 0,22 µm filter.
    2. Voeg steriele dekglasjes toe in een 12-well plaat. Voeg 300 µL van de opgeloste PLL toe op de dekglasjes.
    3. Verwijder de oplossing na 30 min incubatie. De platen kunnen worden bewaard bij 4 °C tot verder gebruik (tot 1 - 2 maanden).
  7. Bereid een 10 mg/mL stamoplossing van collagenase type IA en bewaar aliquots van 300 µL bij -20 °C. Filter voor gebruik.

3. Voorbereidingen Vereist 24 uur voorafgaand aan Isolering

  1. Bereid collageen gecoate dekglasjes voor MEEC-kweek.
    1. Bereid een 0,02 M oplossing van azijnzuur in gedistilleerd water (1 mL per dekglasje).
    2. Voeg 150 µL collageen toe in 12 mL van 0,02 M azijnzuur om een eindconcentratie van 50 µg/mL te verkrijgen.
    3. Voeg steriele dekglasjes toe in een 12-well plaat.
    4. Voeg 1 mL van de collageenoplossing toe (zie 3.1.2).
    5. Incubeer O/N (minimaal 12 uur) bij 37 °C.
      Tijdens isolatie:
    6. Verwijder de collageenoplossing van de dekglasjes door middel van zuiging en laat het in een steriele omgeving luchtdrogen (in de laminar flow kast).
    7. Was de dekglasjes twee keer met Phosphate-buffered Saline (PBS).
  2. Bereid een 2,5% pancreatine oplossing door 0,25 g pancreatine toe te voegen in een 15 mL canoniek buisje met 10 mL van HBSS+. Schud (200 rpm) de oplossing bij 37 °C gedurende 1 uur om de oplosbaarheid te verhogen. Bewaar bij 4 °C.

4. Isolatie en Kweek van Mouse Endometrial Epithelial Cells (MEEC) en Mouse Endometrial Stromal Cells (MESC)

  1. Voeg 25 mg trypsine toe in een 15 mL buisje met 2,5% pancreatine oplossing (zie 3.2) om te eindigen met een eindoplossing bevattend 0,25% trypsine (hierna MESC-verteringsmix genoemd).
  2. Isolatie van uteri
    1. Controleer de cyclusfase van de dieren met een vaginale uitstrijkje.
      1. Beperk het dier

Resultaten

Algemeen overzicht van het protocol

Figuur 1A illustreert een algemeen overzicht van het protocol. Een dagelijkse injectie van E2 (100 ng) gedurende drie opeenvolgende dagen werd gebruikt om de dieren te synchroniseren en de fase van de oestruscyclus te standaardiseren. De oestruscyclus kan worden beoordeeld via vaginale spoelingen en is onderverdeeld in de proestrus-, oestrus-, diestrus- en metestrusfase. De cyclusfase kan worden vastgesteld op basis van de verhouding gedesquameerde cellen in de spoeling, die onderhevig zijn aan hormonale veranderingen. Toenemende estrogenniveaus zorgen ervoor dat de dieren evolueren naar de oestrusfase. Deze fase kan eenvoudig worden gedetecteerd door de aanwezigheid van uitsluitend verhoornde epitheelcellen en de afwezigheid van leukocyten (Figuur 1B). Op dag 4 worden de uteri van dieren die zich in de oestrusfase bevinden verzameld en worden MEEC en MESC geïsoleerd (Figuur 1C). Decidualisatie kan worden geïnduceerd door 0,5 mM cAMP en 1 µM MPA toe te voegen aan het 2% FBS-medium tijdens een incubatieperiode van 5 d.

Kwaliteitscontrole van MEEC- en MESC-culturen

De zuiverheid van de primaire celculturen kan worden beoordeeld aan de hand van het verschil in vimentine- en cytokeratine-expressie. Vimentine is een intermediair filament dat tot expressie komt in mesenchymale cellen, en dus in de endometriale stromale cellen. Cytokeratine is een intermediair filament dat voorkomt in het cytoskelet van epitheliaal weefsel. Figuur 2A toont het mRNA-expressieniveau van vimentine en cytokeratine in MEEC en MESC, bepaald met behulp van qRT-PCR. Vimentineniveaus zijn hoog in MESC en laag in MEEC (2,2x hoger, p < 0,001), terwijl cytokeratineniveaus hoog zijn in MEEC en laag in MESC (36x hoger, p < 0,001). Er werd een dubbele kleuring voor vimentine/cytokeratine uitgevoerd, waaruit bleek dat stromale cellen vimentine tot expressie brengen terwijl epitheliale cellen cytokeratine tot expressie brengen (Figuur 2B, C). De afwezigheid van het primaire antilichaam diende als negatieve controle voor de immunokleuring (Figuur 2D, E). Deze immunohistologische kleuringen tonen aan dat beide endometriale celculturen (MEEC en MESC) een zuiverheid tot 90% hebben.

Decidualisatie in MEEC/MESC-coculturen

Na isolatie werden endometrale cellen en stromale cellen van muizen uitgezaaid in een co-cultuursysteem om de endometrale omgeving na te bootsen. De cellen werden gekweekt totdat de epitheelcellen een monolaag vormden in de celkweekinsert (TEER-waarden van 800 - 1.000/well) en de stromale cellen een sub-confluente staat bereikten. Decidualisatie werd in de stromale cellen geïnduceerd door toevoeging van 0,5 mM cAMP en 1 µM MPA. Na vijf dagen incubatie werden de prolactine-mRNA-niveaus in de stromale cellen bepaald via qRT-PCR als indicatie voor decidualisatie (Figuur 3A). Prolactineniveaus waren sterk tot expressie gebracht in cellen die waren blootgesteld aan de hormonen en waren niet detecteerbaar in cellen die waren geïncubeerd met het controlemedium (p < 0,01).

Omdat epitheelcellen moeilijk te visualiseren zijn in de celluicultuur-inserts, werd onmiddellijk na de incubatieperiode van vijf dagen een levensvatbaarheidsassay uitgevoerd (Figuur 3B). Een mengsel van normaal groeimedium en een levensvatbaarheidsreagens werd aan de wells toegevoegd en gedurende een periode van minimaal 8 - 12 h geïncubeerd. De kleurverschuiving van blauw naar helder roze duidde op de aanwezigheid van levensvatbare epitheelcellen. Let op dat de kleurverschuiving alleen optreedt wanneer levensvatbare cellen aanwezig zijn.

figure-results-1
Figuur 1: Algemeen overzicht van het protocol. (A) Schema van het isolatieprotocol, beginnend met drie opeenvolgende dagen oestrogenejecties. Op dag 3 moeten de benodigde preparaten worden klaargemaakt. Op dag 4 wordt de oestrusfase geëvalueerd (aangegeven met een ster) door middel van een vaginale lavage. MESC en MEEC worden geïsoleerd via verschillende digestiestappen. Op dag 6, of wanneer de cellen confluent zijn, kan decidualisatie in het co-culturesysteem worden geïnduceerd door cAMP en MPA aan het medium toe te voegen, gevolgd door een incubatieperiode van vijf dagen (dag 6 - 11). (B) Representatieve afbeelding van de oestrusfase, gekenmerkt door de aanwezigheid van verhoornde epitheelcellen in de vaginale lavage (vergroting 10X). (C) Representatieve afbeelding van MESC en MEEC (vergroting 20X, schaalbalk: 100 µm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immunokleuring en kwantitatieve RT-PCR voor vimentine en cytokeratine in MEEC en MESC. (A) Messenger RNA-niveaus van vimentine- en cytokeratine-expressie om de zuiverheid van de culturen aan te tonen. RNA-niveaus werden relatief gekwantificeerd ten opzichte van het geometrisch gemiddelde van de housekeeping-genen ACTB en TBP. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Vimentine/cytokeratine dubbele kleuring van MESC-culturen (B) en MEEC-culturen (C). De inzet links toont een weergave bij 63X vergroting. Negatieve controle waarbij het primaire antilichaam is weggelaten voor MESC (D) en MEEC (E) (Schaalbalk: 50 µm). ***: p <0,001 met Two-way ANOVA met Bonferroni-correctie voor meervoudig testen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Validatie van decidualisatie via RT-PCR. (A) mRNA-niveaus van prolactine-expressie in stromale cellen om decidualisatie te evalueren. RNA-niveaus werden relatief gekwantificeerd ten opzichte van het geometrisch gemiddelde van de housekeeping-genen PGK1 en TBP. De fold change in cellen gekweekt in controlemedium of decidualisatiemedium wordt weergegeven als gemiddelde ±SEM. (B) Illustratieve afbeeldingen van stromale cellen vóór (boven) en na (onder) stimulatie van decidualisatie. De inzet rechts toont een vergroting van een gedecidualiseerde stromale cel. Decidualisatie wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van meerkernige cellen, aangegeven met zwarte pijlen. (C) Representatieve afbeeldingen van de beoordeling van de viabiliteit van epitheelcellen in de insert na de assay. Foto's zijn genomen direct na toediening van het viabiliteitsreagens (Prestoblue) (0 h) en de volgende ochtend (ON). **: p <0,01 met Mann-Whitney U-test. ON: overnight. Schaalbalk: 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Decidualisatie is de progesteron-afhankelijke differentiatie van endometriale stromale cellen in ronde, afscheidende deciduale cellen. Bij de mens vindt dit proces spontaan plaats tijdens de luteale fase van de menstruatiecyclus en wordt het geïnitieerd in de stromale cellen rond de vasculaire cellen om de predecidua te vormen. Bij knaagdieren is echter de aanwezigheid van een blastocyst onmisbaar om decidualisatie te induceren. Het feit dat decidualisatie alleen optreedt na contact met de endometrium-epitheelcellen impliceert dat belangrijke factoren door de epitheelcellen worden uitgescheiden om decidualisatie in het onderliggende stroma te induceren. Hoewel dit verschil in de initiatie van het decidualisatieproces moet worden erkend, suggereert het feit dat menselijke decidualisatie robuuster wordt na embryo-implantatie dat vergelijkbare mechanismen betrokken kunnen zijn. In vitro celculturen worden vaak gebruikt om het effect van specifieke moleculen tijdens het decidualisatieproces te bestuderen. Niettemin is de beschikbaarheid en hoeveelheid menselijk weefsel dat kan worden verzameld vaak beperkt en gepaard gaat met variaties, bijv. cyclusfase, aantal zwangerschappen en aanwezigheid van gynaecologische aandoeningen zoals endometriose of adenomyose. Veel van deze problemen kunnen worden voorkomen door het gebruik van muisweefsel dat gemakkelijk toegankelijk is en onafhankelijk van de cyclusfase. Een ander sterk voordeel van het gebruik van muisweefsel is de mogelijkheid om genetisch gemodificeerde knaagdieren te gebruiken en de mogelijkheid om een groot aantal experimenten op te zetten. Op dit moment zijn er veel verschillende isolatieprotocollen beschreven in de literatuur met een hoge variabiliteit in de leeftijd van de dieren en de periode in de oestrusfase op het moment van gebruik.

Deze studie presenteert een nieuwe methode voor primaire endometriale co-culturen van stromale en epitheelcellen waarbij gebruik werd gemaakt van een gestandaardiseerde oestruscyclus door dagelijks oestrogeen te injecteren voorafgaand aan de isolatie. Bovendien is bekend dat oestrogeen proliferatie induceert in epitheel- en stromale cellen, wat de opbrengst per isolatie verder verhoogt. Het isolatieprotocol dat in dit artikel wordt beschreven, was gebaseerd op Grant et al.7, maar er werden verdere optimalisatie stappen toegevoegd om de opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid van de verschillende celculturen te verhogen. Eerst werd HBSS altijd aangevuld met antibiotica om besmetting van de primaire cultuur te voorkomen. Tijdens de isolatie van MEEC werd een temperatuur aanpassing gedaan (15 min bij 37 °C) om de oogst van de epitheelcellen tijdens de eerste vertering te verhogen. Vervolgens werd een extra stap toegevoegd om de enzymatische activiteit na trypsine-vertering te temperen door medium met FBS toe te voegen om de activiteit ervan te remmen. Bovendien werden MEEC's door een filter gehaald waarvan de maas groter was dan wat gebruikelijk wordt beschreven (100 µm) omdat ze vaak in clusters en celvellen voorkomen. Bovendien werd besmetting door stromale cellen verminderd door een extra stap uit te voeren waarbij MEEC's en MESC's werden gescheiden op basis van zwaartekrachtsedimentatie. Ten slotte werden MEEC's gezaaid op met collageen gecoate coverslips om de hechting van cellen aan glazen coverslips te verhogen, aangezien duidelijk werd dat hechting aan niet-gecoate of PLL-gecoate glazen coverslips onvoldoende was. Tijdens de isolatie van de MESC's werd collageenase (1 mg/mL) toegevoegd om de vertering te verbeteren. Bovendien werd deze verteringsstap in duplicaat uitgevoerd om besmetting van resterende MEEC's te voorkomen. Al deze extra stappen resulteerden in zuivere en levensvatbare culturen van homogene celpopulaties.

De zuiverheid van de celpopulatie werd beoordeeld met immunokleuring en qRT-PCR met behulp van vimentine als stromale marker en cytokeratine als epitheliële marker. Duidelijk werd een tegengestelde expressiepatroon van vimentine en cytokeratine waargenomen in MEEC en MESC. Er kan echter worden opgemerkt dat de relatieve mRNA-expressie van vimentine en cytokeratine vergelijkbaar is in de MEEC-culturen. Vergelijkbare resultaten zijn gepubliceerd door andere onderzoeksgroepen, waarbij epitheelcellen in cultuur vimentine-expressie verkrijgen9. Belangrijker is het verschil in eiwitexpressie tussen vimentine en cytokeratine zoals waargenomen in de immunohistologische vlekken van de verschillende celpopulaties. Dubbele immunokleuring toonde aan dat EEC's positief waren voor cytokeratine en ESC's positief waren voor vimentine. Het gebruik van deze markers in immunokleuring is een gevestigde methode en wordt standaard gebruikt om de celtypen aan te geven10.

Hoewel er veel onderzoek is gedaan naar de decidualisatie van MESC, blijft het mogelijk dat de aanwezigheid van epitheelcellen in dit model de resultaten van decidualisatie kan veranderen. Ten eerste is aangetoond dat als MEEC groeit tot een monolaag in de aanwezigheid van MESC-geconditioneerd medium of in een co-cultuur omgeving, de monolaag een verbeterde epitheliale cel transepitheliale elektrische weerstand (TEER) heeft, resulterend uit factoren die worden uitgescheiden door MESC7. Bovendien leverde Pierro et al.11 bewijs dat epitheliale proliferatie, beïnvloed door 17β-oestradiol, kan worden gemedieerd door factoren die worden uitgescheiden door de stromale cellen, en alternatief kunnen epitheelcellen factoren afgeven die stromale decidualisatie moduleren12,13. Over het algemeen is het duidelijk dat de epitheliale-stromale co-cultuur omgeving een meer fysiologische situatie biedt die paracriene interactie en communicatie mogelijk maakt. De methode van het kweken van twee verschillende celtypen met behulp van een insert co-cultuur systeem werd eerder beschreven14,15 en werd aangepast voor het gebruik van muis primaire cellen. Door de detectie van prolactine mRNA-niveaus als een uitlezing voor decidualisatie,

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Research Foundation-Flanders (FWO G.0856.13N) en de Research Council van de KU Leuven (OT/13/113). K.D.C. wordt gefinancierd door de FWO België. A.H. wordt gefinancierd door OT/13/113. We willen de Cell Imaging Core faciliteit van de KU Leuven bedanken (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) voor het gebruik van de confocale microscoop.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparantGreiner Bio-one662610Inserts worden ook geleverd voor andere multiwell platen en/of andere poriegrootten. Andere leveranciers: Merck Millipore.
https://shop.gbo.com/nl/row/articles/catalogue/article/
0110_0110_0090_0030/13408/ 
Nunc Cell culture treated 24 well platesThermo Scientific142475http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium saltSigma AldrichB7880Bereid een stockoplossing van 100 mM in Milli Q water. Bewaar aliquots bij -20 °C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=nl®ion=NL 
Medroxyprogesterone 17-acetateSigma AldrichM1629Bereid een stockoplossing van 250 µM in ethanol. Bewaar aliquots bij -20 °C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=nl®ion=NL 
Arachis oilSupermarketGebruik standaard kook pindaolië dat in elke supermarkt te vinden is
PrestoBlue cell viability reagentThermo ScientificA13261https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol redGibco14175-046Bewaar in de koelkast zolang mogelijk. Gebruik koude HBSS+ tijdens het protocol.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 
17-β EstradiolSigma AldrichE8875Bereid een stockoplossing van 1 mg/mL in EtOH voor verdunning in arachis olie (1:1,000).
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=nl®ion=NL
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilizedMerck MilliporeSCGPU05REhttp://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)Gibco15070-063https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPESGibco11330-032https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America OriginGibco10500-056https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin BGibco15290-018https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL)Gibco15750-037https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol redSigma AldrichD5921http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=nl®ion=NL
MCDB-105Sigma AldrichM6395Verdun in Milli Q water, pas pH aan op 7 met NaOH en filter voor gebruik. Bewaar in het donker.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=nl®ion=NL 
Insulin from bovine pancreasSigma AldrichI1882http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=nl®ion=NL
Coverslips, glass, 18 mm ØGlaswarenfabrik Karl Hecht1001/18http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937
&tx_rmproducts_pi1[p]=3504
&tx_rmproducts_pi1[v]=20088
&cHash=abd12065683fe74b00eaa
5e562824d06
Poly-L-lysineSigma AldrichP2636http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=nl®ion=NL
Collagenase type IA from Clostridium histolyticumSigma AldrichC2674http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=nl®ion=NL
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-094https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreasSigma AldrichT7409http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=nl®ion=NL
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300-054Op kamertemperatuur brengen voor gebruik.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 
Cell strainer, 40 µm mesh, disposableBD Falcon352340https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680

Referenties

  1. Cummings, A. M., Yochim, J. M. Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone. J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).
  2. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
  3. Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).
  4. Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).
  5. Power, M. L., Schulkin, J. The evolution of the human placenta. , Johns Hopkins University Press. (2012).
  6. Finn, C. A. The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse. J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).
  7. Grant, K. S., Wira, C. R. Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture. Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).
  8. De Clercq, K., et al. Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle. Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).
  9. Pieper, F. R., et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells. Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).
  10. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  11. Pierro, E., et al. Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).
  12. Kim, M. R., et al. Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells. Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).
  13. Chen, J. C., et al. Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production. Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).
  14. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J Vis Exp. (113), (2016).
  15. Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
  16. Park, D. W., et al. A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion. Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endometriale epitheelcellenendometriale stromale cellenisolatie van de baarmoeder van de muisweefseldigestiecelseparatiemedium voor stromale cellenmedium voor epitheelcellenvimentine cytokeratine kleuringinductie van decidualisatieco culturesysteem

Gerelateerde artikelen