Het oor model van de kale SKH1-Hr uur muis maakt intravitale fluorescentiemicroscopie microcirculatie en fototoxische trombus inductie zonder voorafgaande chirurgische preparaten in de onderzochte microvasculaire bed. Daarom is het oor van de haarloze muis is een uitstekend in vivo model voor de complexe interacties te bestuderen tijdens microvasculaire trombusvorming, trombus evolutie, en trombolyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opklaren en Trombus inductie in de oorlel van een Hairless Mouse
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Trombotische complicaties van vasculaire ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de geïndustrialiseerde landen. Vanwege de complexe interacties tussen cellulaire en niet-cellulaire bloedcomponenten bij thrombusvorming, kan betrouwbare studies van de fysiologie en pathofysiologie van trombose alleen worden uitgevoerd in vivo. Daarom worden in dit artikel een oor model in haarloze muizen en richt zich op de in vivo analyse van de microcirculatie, trombusvorming en trombus evolutie. Via intravitale fluorescentiemicroscopie en intraveneuze (iv) toepassing van de respectieve fluorescerende kleurstoffen, kan een herhaalde analyse van de microcirculatie in de oorschelp gemakkelijk worden uitgevoerd, zonder de noodzaak van chirurgische voorbereiding. Bovendien kan dit model worden aangepast voor in vivo studies van verschillende zaken, zoals wondgenezing, reperfusieletsel, of angiogenese. Kortom, het oor van haarloze muizen is een ideaal model voor de in vivo onderzoek microcirculatie in fysiologische of pathofysiologische aandoeningen en de evaluatie van de reactie op andere systemische of topische behandelingen.
Inleiding
Het doel van dit artikel is de techniek van intravitale microscopie toegepast op de oorschelp van de haarloze muis voor de directe observatie en analyse van microcirculatie, trombusvorming en trombus evolutie beschrijven. Met een incidentie van 1 op 1000, veneuze trombose nog steeds een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit. Hoewel diagnostiek, preventiestrategieën en therapieën zijn in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een derde van de veneuze trombose manifesteert zich als een longembolie 1. Arteriële trombose speelt een cruciale rol in hart- en vaatziekten, die de meest voorkomende doodsoorzaak in geïndustrialiseerde landen zijn. Arteriële trombose op basis van de breuk van atherosclerotische plaques is betrokken bij hartaanvallen, mesenteriale infarcten, en beroerte. Elke operatie bloot subendotheliale structuren bloedcomponenten, verandert de dynamiek van de bloedstroom, en immobiliseert de patiënt. In endoprosthetische operatie aan de onderste ledematen, orgel transplantation en flap chirurgie trombose zijn frequente oorzaken van complicaties. Microvasculaire trombose in het bijzonder veroorzaakt vaak onherstelbare schade, als gevolg van het gebrek aan klinische symptomen. Ook microvasculaire trombose speelt een cruciale regel in verschillende ziekten, waaronder trombotische trombocytopenische purpura, sepsis, diffuse intravasale stolling, antifosfolipidensyndroom en veneuze insufficiëntie, onder anderen.
Verschillende nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling en preventie van trombose werden ontwikkeld in de afgelopen jaren, maar antiplatelet drugs en antistollingsmiddelen hebben nog steeds bijwerkingen, gebrek antagonisten, en zijn voorzien van lange duur effecten. Deze tekortkomingen leiden tot problemen in dringende medische zorg. Aldus is meer onderzoek nodig om de complexe processen die optreden tijdens trombose, die nauwelijks kan worden gesimuleerd in vitro bloot te leggen.
De haarloze SKH1-Hr hr muis werd ontdekt 1926 in een dierentuin in Londen.Vanwege een gendefect op chromosoom 14, het dier verliest zijn vacht na postnatale dag 10. Dit geeft een goed gevasculariseerde auricula toegankelijk intravitale microscopie van de vaten. De gemiddelde dikte van het oor is 300 urn. Het bestaat uit twee lagen van de dermis, die worden gescheiden door kraakbeen. Aan de convexe dorsale zijde van het kraakbeen, 3 vaatbundels voert de oorlel. Apicale vasculaire bogen en basale shunts sluit de drie bundels. De venules hebben diameters tussen 200 urn (basaal) en 10 urn (apicale). Fijnmazig haarvaten rond de lege haarzakjes 2. De anatomie van de haarloze SKH1-Hr hr muis maakt de oorschelp een krachtige en kosteneffectieve model voor trombose onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle in vivo-experimenten (7221.3-1-006 / 15) werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake de bescherming van dieren en de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council).
1. Algemene houden van de dieren
- Voer de experimenten met mannelijke SKH1-Hr uur muizen van 4 tot 6 weken. Dieren worden gebruikt met een gewicht tussen 20 en 25 g.
- Bewaar de dieren in een pathogeenvrije faciliteit en onder gestandaardiseerde omstandigheden van 24 tot 26 ° C en 60% relatieve vochtigheid, met constante toegang tot water en voedsel ad libitum.
- Blijf op de vijf mannelijke dieren in een kooi. Zorg voor beddengoed en verrijking materiaal tijdens de behuizing van de dieren voor hun welzijn.
2. prearrangement of the Animals
- Weeg een muis en laadt de respectievelijke geneesmiddel (bijvoorbeeld de cannabinoïde, 5 mg / kg lichaamsgewicht (BW)) in een insulinespuit. Toedienen van het geneesmiddel 30 minuten voorafgaand aan inductie trombus.
- Door het vasthouden van de nek van de muis tussen duim en wijsvinger en de staart van de muis met de pink, strekken het dier en injecteer het geneesmiddel intraperitoneaal (ip) in de linker kwadrant van de buik. Zet het dier weer in de kooi gedurende 15 min.
- Bereiden anesthesie met ketamine (90 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (25 mg / kg lichaamsgewicht). 15 minuten vóór inductie trombus, verdoven de muis. Zet de muis in de kooi, trek de staart licht, en injecteer de verdoving ip een insulinespuit.
- Zet de muis terug in de kooi tot het begin van de anesthesie. Om voldoende verdoving controleren, knijp de staart met een tang.
- Load 0,05 ml ontdooid fluoresceïne-isothiocyanaat gemerkt dextran (FITC-dextran, 5%, 150 kDa) in een insulinespuit. Het vullen van de injectiespuit zorgen dat er geen luchtbellen achterblijven, omdat zelfs kleine intravenously (iv) -administered luchtbellen dodelijk voor het dier.
- Plaats de verdoofde muis op een verwarmingsplaat in de beneden positie. Pas de verwarmingsplaat op 37 ° C.
- Zet oogzalf op het hoornvlies van de muis. Ontsmet de huid en het gebruik van steriele instrumenten.
- Steek twee hechtingen van polypropeen 7/0 in de craniale en caudale rand van het rechter oor. Leg de steken zo dicht mogelijk bij de rand en dat proximaal aan de basis mogelijk (Figuur 1B).
- Schuif de muis om dorsale positie. Fix alle poten naar acrylglass platform met behulp van plakband. Haak een hechting onder de voortanden en plaats de kop in dorsiflexie door steken de hechtdraad de acrylglass plakstrips.
- Transloceren het dier op het platform in het kader van de operatie stereomicroscoop. Gebruik 16X vergroting.
3. Bereiding van de linker halsader en injectie van FITC-Dextran
Opmerking: voor microscopy van het rechter oor, de voorbereiding van de linker halsader.
- Met behulp van een scalpel, voer een 5-mm incisie in de huid aan de linkerzijde van de nek in een cranio-caudaal. Ontleden het subcutane weefsel met een microforceps en microscissors. Ofwel ligaat kruising schepen met polyester 8/0 hechtingen of met electrocoagulatie.
- Bevrijd de ader van de adventitia met behulp microforceps en microscissors zonder het aanraken van het schip.
- Met de bereide insuline spuit voor het injecteren van de fluorescerende kleurstof. pak voorzichtig de vaatwand met de microforceps, zonder perforeren de ader. Doordringen in de uitgezette vaatwand met de injectiespuit en injecteer FITC-dextran iv.
- Het bloeden te stoppen nadat de injectiespuit via wattenstaafjes onttrekken. Vermijd bloed en vervuiling van het oor verven.
4. Plaatsing van het rechter oor voor intravitale fluorescentiemicroscopie
- Breng het dier op de verwarmingsplaat een acrylglass construction met een sleuf voor de verwarmingsplaat en een 0,5 cm hoog vlak voor het positioneren van het oor.
- Bevestig het dier naar beneden op de verwarmingsplaat behulp plakstrips. Plaats de relatief sterke en convexe kraakbeen bij de basis van het oor naast het 0,5 cm hoog vlak voor het oor (figuur 1B) zodat het apicale deel van het oor plat worden geplaatst op het vliegtuig.
- Één druppel kamertemperatuur 0,9% NaCl om het acrylglass vlak om het oor te plaatsen. Leg het rechter oor, de afgesproken hechtingen aan zijn concave ventrale zijde naar beneden op de daling van 0,9% NaCl. Gebruik wattenstaafjes, absorberen de druppel NaCl en laat capillaire krachten bevestig het oor vliegtuig naar het acrylglass.
- Tape de hechtingen aan de acrylglass de positie van het oor vast.
- Één druppel 0,9% NaCl kamertemperatuur aan de convexe dorsale zijde van het oor. Zorgvuldig zet een dekglaasje (0,5 cm diameter) op het oor zonder samendrukken van de basale schepen die the oor. Gebruik wattenstaafjes, verwijder zoveel mogelijk NaCl onder het dekglaasje om de afstand tussen het dekglaasje en het oor doelvaten minimaliseren.
5. intravitale fluorescentiemicroscopie en Trombus Inductie van het rechteroor
- Stel de intravitale fluorescentiemicroscoop voor FITC-dextran visualisatie (450-490 nm; FT: 510; LP: 520). Met een variabele-100 W kwiklamp als lichtbron. Sluit een hoge resolutie, zwart-wit CCD-camera op een DVD recorder.
- Breng het dier op de acrylglass met de verwarmingsplaat met de vaste ontvoerde oor naar het bureau van de intravitale fluorescentiemicroscoop.
- Gebruik 20X vergroting (20X / 0.95 numerieke apertuur) en 20% lichtintensiteit zoeken naar een veneus vat 50 - 60 urn in diameter en met een voorwaartse bloedstroom van 400-600 um / s.
- Voeg een druppel water op kamertemperatuur om het dekglaasje voor onderdompeling in water van de 63x magnification doelstelling (63X / 0.95 numerieke apertuur). Met een spuit met een 1-mm canule en plaats de druppel op het objectief van de microscoop. Voeg net genoeg water om contact op met de dekglaasje en de doelstelling om met het water te laten vallen.
- Onmiddellijk na het aanbrengen van de waterdruppel, de gegevens van de vat gedurende 20 seconden met 20% lichtintensiteit voor offline meten van de diameter en de bloedstroom.
- Beginnen trombus inductie 5 minuten na de injectie van FITC-dextran. Voor dit doel verhogen de lichtintensiteit tot 100%.
- Bij thrombusvorming inductie, sluit de opening van de microscoop 2 sec binnen 30 s om de bloedstroom te controleren. Bij persisterende bloedstroom, opent de opening weer. Bij gestopt bloedstroom, acht het vat gedurende 30 s.
LET OP: Het schip is geclassificeerd als afgesloten wanneer de stroom stil staat gedurende 30 seconden of meer, of indien het bloed stroomt retrograad. Indien de orthograde bloedstroming opnieuw gestart, het diafragma en Contin volledig openen ue de trombus inductie tot vatafsluiting zoals boven bedoeld. Tijdens de vroege trombus inductie waarborgen dat de tijd dat de opening werd gesloten om de bloedstroom te controleren zo kort mogelijk teneinde nagenoeg continue epi-belichting handhaven. Later, tijdens trombus groei, het vat geperfuseerd met minder fluorescerende kleurstof, zodat het kan continu worden waargenomen. - Selecteer en af te sluiten 5 vaten per oor. Tijdslimiet van trombus inductie onder de microscoop op ongeveer 1 uur na de injectie van FITC-dextran.
6. Follow-up Activiteiten
- Voer een wond sluiting van de nek met behulp van transcutane polypropyleen 6/0 hechtingen.
- Tijdens het herstel van de anesthesie, zet de muis terug in de kooi en verwarm het dier met infrarood licht.
- Breng de geregistreerde gegevens van de DVD-recorder op software waarmee de meting van de diameter van de vaten en de snelheid van de bloedstroom.
- Liet het dier herstellen en elimineren alle geïnjecteerde FITC-dextran gedurende 48 uur.
- Voer de hierboven beschreven stappen, dit keer de voorbereiding van de rechter halsader en het linker oor.
8. Weefsel Asservation
- Na intravitale fluorescentiemicroscopie van het linkeroor, monster 0,5 ml bloed uit de ader retrobulbaire plexus van het oog met een glazen capillair. dringen voorzichtig de binnenste palpebrale hoek schroeven bewegingen tot veneus bloed door het capillair stroomt. Verzamel de sonde per ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bloed buis.
- Na bloedafname, offeren het dier door het injecteren van 500 mg / kg lichaamsgewicht ketamine in de staartader.
- Tel de bloedcellen met behulp van een hematologie-analysator voor een kwantitatieve beoordeling van leukocyten, erytrocyten, trombocyten, hemoglobine en hematocriet.
- Centrifugeer de resterende EDTA bloed bij 2500 x g en kamertemperatuur gedurende 10 min. Pipetteer en vries het bloedplasma voor verder onderzoek.
- Met een schaar, knip de oorschelpen en ze op te lossen in 4% formaldehyde voor histologisch onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Effecten van Cannabinoid Treatment thrombogenese
Na injectie van 0,05 ml FITC-dextran, fototoxisch trombus inductie leidt tot een endotheliale laesie en de vorming van een pariëtale plaatjesprop (figuren 2 en 3). In deze studie thrombus-inductie na ip injectie van cannabinoïden (5 mg / kg lichaamsgewicht) of vehikel tot een trombotische occlusie vat alle venules (figuur 4). Bij m...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn een aantal cruciale stappen voor de succesvolle trombus inductie in de oorlel van SKH1-Hr hr muizen. Voor het oplossen van problemen, worden de respectievelijke stappen van het protocol aangegeven tussen haakjes.
Onderzoek omstandigheden zijn ideaal bij jonge dieren op de leeftijd van 4-6 weken en met een lage verhoorning van de opperhuid. Bij oudere dieren, de kwaliteit van visualisatie van de vaten slechter en meer vergelijkbaar vanwege de hogere afstand tussen het huido...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| SKH-1/hr muizen | Charles River | 477 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| standaard laboratoriumvoer | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| operatie stereomicroscoop | Leica | M651/M655 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| intravitale microscoop | Zeiss | Axiotech Vario 100 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| objectief (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| objectief (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| zwart-wit CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| natriumchloride | Braun | 5/12612055/1011 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| dexapanthenol 5% oogzalf | Bayer | 6029009.00.00 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| DMSO | Sigma | 472301 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Hechtstrips | Leukosilk | 4683400 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| hematologie analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| EDTA-bloedbuis | Sarstedt | 201,341 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| wattenstaafjes | Sanyo | 604-A-1 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| infraroodlicht | Beurer | 5/13855 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| eenmalig gebruik spuit | Braun | 2020-08 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| insulinespuit | Braun | 9161502 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| wegwerp hypodermische naalden | Braun | 465 7640 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| eind-tot-eind capillair | Sarstedt | 19,447 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| verwarmingsplaat | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| schaar 14,5 cm | Aesculap | BC259R | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| naaldhouder | Aesculap | BM081R | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| microforceps | Aesculap | BD331R | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| microschaar | Aesculap | OC496R | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| elektrocauterisatie | Servoprax | H40140 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| acrylglas pad | geïntegreerde verwarming, 0,5 cm hoge vlakte |
Referenties
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331(1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
