Gebruik van een varkensmodel voor de studie van anesthesie-geïnduceerde ontwikkelingsneurotoxiciteit (AIDN): een vertaal-neuroscience-benadering

Samenvatting

Anesthesie-geïnduceerde ontwikkelingsneurotoxiciteit (AIDN) onderzoek heeft zich gericht op knaagdieren, die niet breed van toepassing zijn op mensen. Niet-menselijke primatenmodellen zijn relevanter, maar zijn kosteloos en moeilijk te gebruiken voor experimenten. Het piglet is daarentegen een klinisch relevant, praktisch diermodel dat ideaal is voor de studie van anesthetische neurotoxiciteit.

Samenvatting

Anesthesie kan niet worden vermeden in veel gevallen wanneer een operatie nodig is, met name bij kinderen. Recente onderzoeken bij dieren hebben zorgen gemaakt dat de blootstelling aan anesthesie kan leiden tot neuronale apoptose, bekend als anesthesie-geïnduceerde ontwikkelingsneurotoxiciteit (AIDN). Bovendien hebben sommige klinische studies bij kinderen voorgesteld dat blootstelling aan anesthesie later in het leven kan leiden tot neurodevelopmentele tekorten. Desalniettemin is een ideaal diermodel voor preklinische studie nog niet ontwikkeld. Het neonatale piglet is een waardevol model voor preklinische studie, aangezien zij een opvallend aantal ontwikkelingsaantallen met mensen delen.

De anatomie en fysiologie van biggen zorgen voor de implementatie van strenge humane perioperatieve aandoeningen in zowel overlevings- als niet-overlevingsprocedures. Katheterisatie van de femorale arterie zorgt voor een nauwkeurige monitoring, waardoor de eventuele afwijking van de vitale tekens en chemische stoffen van de piglet snel wordt gecorrigeerd. ikN toevoeging, er zijn meerdere ontwikkelings-overeenkomsten tussen varkens en menselijke neonaten. De technieken die nodig zijn om varkens te gebruiken voor experimenten, hebben ervaring om te beheersen. Een kinderanesthesioloog is een kritisch lid van het onderzoeksteam. We beschrijven in het algemeen het passende gebruik van een pigletmodel voor neurodevelopmentele studie.

Inleiding

Elk jaar krijgen miljoenen kinderen in de VS algemene verdoving, veel van hen jonger dan 4 jaar. Anesthesie-geïnduceerde ontwikkelingsneurotoxiciteit (AIDN) is uitgegroeid tot een focus van pediatrische anesthesie onderzoek, aangezien het van essentieel belang is om de effecten van verdoving op onvolwassenen te begrijpen. Vorige onderzoek heeft aangetoond dat vaak gebruikte anesthetica, zoals isofluraan, kan leiden tot verhoogde neuronale apoptose in de hersenen van jonge dieren. Studies bij kinderen hebben ondubbelzinnige resultaten opgeleverd ² . Het begrijpen van de pathogenese van AIDN, het identificeren van mogelijke therapeutische doelen voor het voorkomen of verbeteren ervan, en het beschrijven van de veiligste verdovingsregelingen die beschikbaar zijn, zijn dringende doelen van de pediatrische anesthesie gemeenschap geworden. Het hoofddoel van deze studie was het ontwikkelen van een optimaal diermodel en een methode om de effecten van verdovingsmiddelen op de ontwikkelende hersenen te kwantificeren en zorgvuldig te stimulerenOntworpen onderzoek naar de veiligheid van huidig ​​gebruikte anesthetica.

In een recent systematisch overzicht van het huidige lichaam van preklinische literatuur over AIDN merkten de auteurs op significante methodologische heterogeniteit in meer dan 900 studies ³ . Velen beschouwden dit als een oproep voor een klinisch relevant, goed ontworpen preklinisch model, dat nog niet bestaat, ondanks meerdere jaren onderzoek over dit onderwerp. De meeste knaagdiermodellen gebruiken, vanuit noodzaak, een aanpak die geen nauwkeurige fysiologische controle, bloedmonsterneming of mechanische ventilatie mogelijk maakt. Aangezien de hersenen buitengewoon gevoelig zijn voor fysiologische afwijkingen, is het moeilijk om op de resultaten van dergelijke modellen te vertrouwen. Een primair doel voor de ontwikkeling van dit model was om het zo te ontwerpen dat alle fysiologische variabelen zoals bloedgasparameters, lichaamstemperatuur, ademhalingsparameters, enz. Worden gecontroleerd en gecorrigeerd indien nodig.

Bovendien, omdat de neurotoxiciteit van de anesthesie waarschijnlijk afhankelijk is van de ontwikkelingsvordering van de hersenen op het moment van blootstelling, moet een diermodel worden gekozen die de ontwikkeling en structuur van het neonatale menselijke brein het beste kan nabootsen om de maximale De translationele relevantie van de resultaten ⁴ . Het translatie-pigletmodel geeft het niveau van de klinische relevantie die in deze recensies en redactionele artikelen wordt gezocht, aangezien het is ontworpen om deze behoefte aan relevante voorklinische gegevens aan te pakken die toekomstige klinische studies kunnen informeren.

Isofluraan, een GABA type A (GABA _A ) receptor agonist en een zwakke NMDA receptor antagonist, is het algemeen gebruikte inhalatie verdoving in de klinische praktijk wereldwijd. Anesthetica zoals isofluraan zijn als veilig beschouwd zolang ze geen hypotensie of hypoxie veroorzaken; Toch kunnen meer subtiele effecten optreden. Wanneer de hersenen blootgesteld zijn aan algemene verdoving, is het evenwicht van GABA aGonisme en NMDA antagonisme wordt verstoord, wat resulteert in veranderingen in cellulaire architectuur, connectiviteit en functie. Bovendien, terwijl GABA over het algemeen een remmende neurotransmitter is, is het bekend dat ze excitatorisch zijn in onvolwassen hersenen ⁵ . Juist wanneer GABA's overgang van exciterend naar remmend voorkomt, is het niet goed begrepen, en is het waarschijnlijk speciesafhankelijk.

Wanneer een onbalans tussen excitatoire en remmende input in de hersenen optreedt tijdens de zogenaamde "brain growth spurt", kan de resulterende excitotoxische dysregulatie van kritische moleculaire pathways leiden tot abnormale neurodevelopment, zoals apoptotische neurodegeneratie. Naast verhoogde apoptose kan oxidatieve stress en ontsteking ook worden geïnduceerd, terwijl neuronale cel proliferatie, neuronale migratie en axonale arborisatie onderdrukt of gedisreguleerd worden ⁶ . Het netto resultaat is neurocognitieve stoornissen die in adul kunnen voortzettenDood ² .

Om de neurotoxische effecten van isofluraan op jonge zoogdieren te meten, worden neonatale biggen gebruikt. Varkens delen meer CNS-overeenkomsten met mensen dan elk ander zoogdier, en als zodanig maken hun neurodevelopmentele en neuroanatomische overeenkomsten ze een ideaal dier voor een klinisch relevant zoogdiermodel van AIDN. Zowel mensen als biggen hebben gyrencefalische hersenen, die gelijkenissen delen in het karakter en de verspreiding van hersengroei, grijze materie en witte materie. De hippocampus van het varken, basale ganglia en hersenstammen zijn ook topografisch vergelijkbaar met die van mensen ⁷ . Ontwikkeld zijn varkens een van de weinige niet-menselijke zoogdieren die perinatale hersengroei en myelinering ondergaan ⁸ . In de utero, zowel menselijke als piglet hersenen ondergaan significante groei tijdens de zwangerschap van de late trimester. Bij correlatie, bij de geboorte, zijn respectievelijk 27% en 25% van de volwassen hersenen bij de mens en de pigment hersenen. Magnetische resonantie beeldvorming heeft aangetoond dat een een week oude piglet hersenen ongeveer gelijkwaardig is aan een één maand oude menselijke hersenen in termen van neuronale rijping en dendritische arborisatie ⁹ . Daarnaast delen de piglet en de menselijke hersenen talrijke overeenkomsten met betrekking tot patronen van neurodevelopment. Bijvoorbeeld zijn de expressie- en mRNA-sequentie van reelin ¹⁰ , de topografische verdeling van 5-HT neuronen ¹¹ en neurale buis sluiting ¹² allemaal evenwijdig aan die welke bij mensen wordt gezien. Verder is er een uitgebreide homologie tussen de genen van biggen en mensen ¹³ .

De relevantie van een diermodel moet worden begrepen in de context van de menselijke pathologie, met name in relatie tot de hersenmoedigheid en pathobiologie van het menselijke zuigeling. De meeste van de bestaande anesthesie toxiciteitsstudies gebruiken een knaagdiermodel, met een paar die niet-menselijk zijnPrimate modellen. Knaagdieren en primaten zijn echter niet de ideale dieren om AIDN te onderzoeken.

Hoewel veel gebruikt worden, zijn knaagdierhersen heel anders dan die van mensen tijdens de ontwikkeling. Meestal hebben knaagdieren lissencephalische (of gladde) hersenen. De knaagdierbrein mist de gyri en sulci die kenmerkend zijn voor meer neurologisch complexe organismen. De knaagdierbrein ondergaat ook een postnatale hersengroeispurt ¹⁴ , verschillend van mensen en biggen. Er is opgemerkt dat er variaties zijn in de kwetsbaarheid van verschillende hersengebieden naar ingeademde verdoving ¹⁵ . Daarom moet het belangrijk zijn dat het diermodel voor het bestuderen van AIDN een hersenen heeft die neurodevelopmenteel en neuroanatomisch vergelijkbaar zijn met die van een mens, om zo de anesthesie-geïnduceerde hersenveranderingen het beste te kunnen modelleren, dat waarschijnlijk bij pediatrische patiënten wordt gezien. Zoals eerder beschreven, hebben de biggen een hersenen die ikS veel beter geschikt voor deze rol. Bovendien zijn de gemeenschappelijke vormen van neuro-cognitieve testen van knaagdieren, zoals ruimtelijk leren en geheugen, geëvalueerd in het Morris-waterdool, niet direct relevant of vergelijkbaar met de neurocognitieve beoordelingen bij jonge kinderen ¹⁶ . Een van de voordelen van het gebruik van varkens voor ontwikkelingsneurowetenschappen is dat ze op jonge leeftijd uiterst aanvaardbaar zijn voor neurocognitieve testen. Talrijke neurocognitieve tests die nuttig worden beschouwd voor andere zoogdieren, zijn succesvol gebruikt en gevalideerd bij varkens. Terwijl het nog steeds een ontwikkelend veld is, bevat neurocognitieve beoordeling bij varkens meer complexe tests die de menselijke tekorten beter nabootsen, zoals een hellende straalmotor test ^{17 , 18} en spatiale bewustheidstest ¹⁹ . Motor testen met de hellende straal, als onderdeel van de traumatische hersenletsel studie bij biggen, toont een hoge betrouwbaarheid in de beoordelingVan de motorfunctie. De spiegeltest toont het geheugen van het omringende milieu, plus herkenning en gebruik van een gereflecteerd beeld om voedselbeloning te zoeken.

Aan de andere kant kunnen niet-menselijke primaten een passend model zijn voor pediatrische anesthesiestudies, maar er zijn een aantal onbuigzame factoren, waaronder kosten en moeilijkheden bij gebruik. Bovendien zijn ze extreem gevoelig voor vroege opvangomstandigheden, met name stress en materiële scheiding ²⁰ . Factoren die belangrijk zijn voor de studie van AIDN, zoals allosterische modulatoren, receptor-ligand affiniteiten, post-translationele modificaties, receptor subeenheidssamenstellingen en alternatieve splitsingsvarianten, zijn onbekend in het geval van primaten. Dit komt omdat genen die relevant zijn voor dergelijke concepten niet zijn gekloneerd. Daarentegen zijn ze in varkens gekloneerd. Als zodanig is slechts beperkt werk gedaan in niet-menselijke primaten ^{21 , 22} .

Het pigletmodel maakt gebruik van de voordelen van de knaagdier- en niet-menselijke primaatmodellen: het is kosteneffectief, makkelijk te gebruiken in relatie tot niet-menselijke primaatstudies, en is neuroanatomisch en neurofysiologisch vergelijkbaar met de pediatrische menselijke hersenen. Het gebruik van varkens in neurowetenschappelijk onderzoek is in de afgelopen jaren gegroeid, waaronder een aantal studies die pediatrische neuro-inflammatoire aandoeningen hebben onderzocht. Effecten van respiratoire virale infectie op hippocampus en ruimtelijk leren ²³ , vermindering van de hersenceldood na beroerte ²⁴ , neurogenese na traumatische hersenletsel ²⁵ en enzymactiviteit tijdens aanvallen ²⁶ zijn enkele van de studies die neonatale biggen hebben gebruikt. Dit substantiële en groeiende literatuurstuk geeft kracht aan de geschiktheid en duurzaamheid van het klinisch relevante en zeer reproduceerbare pigletmodel voor het bestuderen van anestheesSia-geïnduceerde neurotoxiciteit.

Protocol

Gezonde, huishoudelijke biggen ( Sus Scrofa) worden verkregen uit een boerderij die is goedgekeurd door de Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle dierproeven worden uitgevoerd volgens het IACUC-beleid van de Ohio State University, na goedkeuring van het protocol.

1. Dieren en dierenbehandeling

1. Gebruik mannelijke biggen in dit experiment om de mogelijke confounding effecten van seks te elimineren. OPMERKING: Als experimentele doelen evaluatie van effecten van het experiment op dieren bevatten, terwijl tijdens de periode van maximale hersengroei, gebruik geen varkens ouder dan 14 dagen.
2. Scheduleer de biggetjes om minstens 24 uur in het vivarium te komen voor experimenten om acclimatie toe te laten aan het milieu.
   OPMERKING: Opgeleide dierenartsen die onder toezicht van de vergunninghoudende dierenartsen worden gecontroleerd, bieden routine dierenzorg.
   1. Houd de biggen in individuele temperatuurbeheerde kooien en geef een voedingswaardeNally complete, commerciële varkensmelkvervanger ad libitum. Lever de dieren met een deken en een speelgoed. Controleer de temperatuur constant in de dierenbehuizingen.
3. Voor deze voorlopige haalbaarheidsstudie gebruikte 18 biggen voor de isofluranarm en 22 biggen voor de controlearm. Bereken voorbeeldgrootte berekeningen op basis van het studieontwerp indien mogelijk. Randomize de beschikbare biggen aan een controle- of blootstellingsgroep voor de juiste lengte van de blootstelling. Uit ervaring, zelfs met meerdere onderzoekers, verwacht men niet meer dan 2 experimenten per dag (2 dieren totaal).

2. controleer dieren

1. Doe geen experimentele interventie op controledieren.
2. Induik diepe algemene anesthesie via het gezichtkegelmasker voor de perfusie- en weefselinzamelprocedure. Specifiek, na de 24-uursacclimatieperiode, verdovende varkens met 5% isofluraan of 8% sevofluraan in 100% zuurstof <Em> via gezichtkegelmasker. Gebruik geen desfluraan voor inductie.
   OPMERKING: De tijd tussen inductie van anesthesie en instelling van koude PBS perfusie moet zo kort mogelijk zijn. Ervaren technici kunnen dit proces in minder dan 5 minuten voltooien.
   1. Bevestig de voldoende diepte van de verdoving door het ontbreken van dewclaw-pinch reflex met behulp van een chirurgische klem.
   2. Om hypoxische / ischemische beledigingen tegen de hersenen te vermijden, controleer het piglet met behulp van een pulsoximeter om te zorgen voor een voldoende zuurstof-, ventilatie- en hartuitvoer tot het perfectioneren van koud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) begint.
      OPMERKING: Om extra bescherming tegen weefselschade te bieden, pak het dier (inclusief het hoofd) in ijs na inductie van verdoving.
3. Voer een transcardiale perfusie uit.
   OPMERKING: omdat paraformaldehyde wordt gebruikt, moet de perfusieprocedure worden uitgevoerd onder een dampkap of op een downdraft tafel.
   1. Maak een craniocaudal iNcision langs de lengte van de sternum met behulp van een scalpel. De diepte van de insnijding zou voldoende moeten zijn om de baarmoeder bloot te stellen.
   2. Zorg voor een middelste sternotomie met een paar scherpe zware scharen, om schade aan het hart, de longen of het membraan te vermijden. Plaats indien nodig een vinger tussen het achterste gedeelte van de baarmoeder en de intrathoracale inhoud om letsels te vermijden. Manoeuvreer een vinger in de mediastinum door een kleine (vingergrootte) incisie in het diafragma te maken.
   3. Na het binnengaan van de thoracale holte, houd de ribbekap open met behulp van een zelfstandige retractor.
   4. Inciseer het pericardium met behulp van tang en een schaar, waarbij het kloppend hart wordt blootgesteld. Wees voorzichtig om het hart niet te beschadigen.
   5. Identificeer de linker ventrikel en plaats een canule (zoals een 14 G angiocatheter) zorgvuldig door de apex van de ventrikel. Verwijder de naald, laat de katheter op zijn plaats.
      OPMERKING: Wees voorzichtig om de achterste wand van de ventrikel niet te punkteren.Pulsatiele bloeduitkomst van de katheter geeft aan dat het goed geplaatst is. Bloed kan op dit moment gemakkelijk van het dier worden bemonsterd.
   6. Na het identificeren van het rechter atrium, voer een atriotomie uit door een grote incisie in het atrium te maken met een schaar om exsanguinatie en ontsnapping van perfusaat mogelijk te maken.
      OPMERKING: Isofluraan via inademing moet worden voortgezet tot de sterfte van het hart is bevestigd. Hartsterfte wordt bevestigd door direct geconstateerd gebrek aan hartuitvoer.
4. Perfuse het piglet met behulp van een perfusaat bestaande uit koud (4 ° C) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die heparine bevat bij een concentratie van 5 eenheden per ml. Perfuse bij 300 ml per min gedurende 5 minuten of tot de oplossing loopt.
   1. Wees voorzichtig dat de perfusie canule niet wordt ontlost tijdens perfusie. Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare peristaltische pomp voor dit en alle andere perfusies.
5. Voer een hemicraniectomy uit om weer te gaanBeweeg een halfrond van de hersenen voor verse weefsel analyse.
   OPMERKING: Dit protocol maakt het mogelijk om een ​​halfrond van vers hersenweefsel te herhalen. Het andere halfrond is vast. Als er geen vers weefsel nodig is, ga dan naar stap 2.6.
   1. Tijdens deze procedure, ga door met de circulatie van ijskoud PBS met een snelheid van 50 ml per uur om ervoor te zorgen dat de hersenen koud blijven.
   2. Maak een longitudinale incisie in de hoofdhuid langs de lengte van de sagittale hechting tot de foramen magnum een ​​scalpel gebruiken. Gebruik tijdens het proces stevige druk om een ​​score in de schedel te creëren. Weerspiegelen de hoofdhuid om het hele cranium bloot te stellen.
   3. Gebruik rongeurs en begin bij de foramen magnum, verwijder de schedel aan de ene kant door de rongeurs tussen de schedel en de dura mater te plaatsen, met voorzichtigheid om de onderliggende hersenweefsel niet te beschadigen. Verwijder bot in stukken, gebruik de rongeurs om het weg te laten van het hersenparenchym.
   4. Zodra de schedel is verwijderd, inciseer en verwijder de duRa mater met behulp van tang en schaar, opnieuw met behulp van voorzichtigheid om het onderliggende hersenweefsel niet te verwondigen.
   5. Plaats een scalpelblad tussen de twee hemisferen om de corpus callosum nauwkeurig te verdelen.
   6. Met behulp van een platte gereedschap, zoals het brede handvat van de tang, trekt u de voorste lap voorzichtig terug, waarbij u de kraniale zenuwen geleidelijk afbreekt, werkzaam in de voorkant van de achterkant. Bij het meest achterste aspect van het halfrond, gebruik een scalpel om het ruggenmerg te snijden. Verwijder het halfrond en blok.
      OPMERKING: Onbeperkt hersenweefsel is breekbaar. Wees voorzichtig bij het verwijderen van het halfrond om verstoring van de bloedtoevoer van het overige hemisfeer te voorkomen.
   7. Deel het verwijderde halfrond. Als aangegeven, knipperen onmiddellijk in 2-methylbutaan gekoeld tot -160 ° C in een vloeibaar stikstofbad om weefselafbraak te vermijden en onmiddellijk bij -80 ° C te bewaren voor latere analyse.
      OPMERKING: Wij raden u aan om de hersenen coronaal te snijden in stappen van 2 mm met behulp van een matrix, maar specifieke afwijkingenDe secties zullen afhankelijk zijn van specifieke experimentele doelen.
6. Verander het perfusaat naar 4% paraformaldehyde (PFA). Vervolg de PFA perfusie bij 300 ml per minuut gedurende tenminste 5 minuten.
   VOORZICHTIGHEID! PFA is giftig, vermijd contact met huid, ogen of slijmvliezen. PFA dampen niet inademen.
7. Verwacht het lichaam van het varken te verstijfen door de vorming van aldehyde-cross-linkages die in spier worden gecreëerd. Nadat perfusie van PFA is voltooid, verwijder het resterende halfrond op dezelfde manier als die beschreven in stap 2.5.5.
   OPMERKING: De behoorlijk geperfumeerde hersenen zullen bleek zijn en volledig geëxcanguineerd worden.
   1. Plaats het resterende halfrond in een kleine houder met verse 4% PFA bij 4 ° C. Houd het halfrond in PFA gedurende 24-48 uur om het fixatieproces te voltooien.
   2. Na 24-48 uur verplaatst u de vaste hersenen naar een oplossing van PBS die 0,1% natriumazide bevat, omdat het essentieel is om overfixatie te voorkomen. Over-fixatie kan resulteren in masKoning van de epitoop of sterke non-specifieke achtergrondkleuring. De toevoeging van natriumazide voorkomt bacteriële groei.
      OPMERKING: Het weefsel kan gedurende maximaal één maand bij 4 ° C worden opgeslagen.

3. Isofluraan (Experimentele) Dieren

OPMERKING: Eventueel verdoving of interventie kan worden gebruikt, maar we adviseren niet desfluraan voor inhalatie-inductie.

1. Inductie en onderhoud van anesthesie:
   1. Voer de anesthesie uit met een klinisch anesthesie werkstation uitgerust met een pediatrische ventilator en bewakingsapparatuur.
   2. Na de 24 uur acclimatieperiode verdoving de biggen met 8% sevofluraan in 100% O2 via het gezichtsbeenmasker.
   3. Controleer continu oximetrie, niet-invasieve bloeddruk, elektrocardiografie en temperatuur tijdens de inductieperiode en te allen tijde tijdens de studieprocedure.
   4. Na inductie, titreer sevofluraan of isofluRennen naar een concentratie die zorgt voor een voldoende diepte van verdoving, terwijl blijvende spontane ademhaling (typisch bij een concentratie van 3-4%) wordt gewaarborgd.
   5. Plaats een 24 G perifere intraveneuze katheter in de marginale oorader ( Figuur 1 ).
   6. Plaats het varken in de rugleuningpositie voor tracheale intubatie ( Figuur 2 , paneel A). Gebruik een Miller # 1 of # 1.5 mes om de instrumentatie van de hypofarynx en intubatie van de luchtpijp te vergemakkelijken. OPMERKING: tijdens de laryngoscopie is een ervaren operateur en assistent nodig.
      1. Laat een assistent de tong van het dier verplaatsen met behulp van een droog gaas om de larynx en visualisatie van de stembanden te vergemakkelijken ( Figuur 2 B ).
         OPMERKING: De pigment epiglottis is morfologisch vergelijkbaar met die van mensen ( Figuur 2C). De groentekoorDs kan moeilijk zijn om te visualiseren, omdat ze meerdere millimeter diep in de longaanduiding liggen ( Figuur 2 D ).
      2. Verplaats de epiglottis: plaats de punt van het laryngoscoopblad onder de epiglottis en lig het mes omhoog om de larinks bloot te leggen.
      3. Voordat u de buis in de luchtpijp plaatst, spuit de stembanden met 0,5 ml 2% lidocaïne om laryngospasm te voorkomen tijdens de doorgang van de endotracheale buis, aangezien de varkens bijzonder gevoelig zijn voor laryngospasmen.
   7. Plaats en bevestig een 3.0 mm cuffed tracheaalbuis.
      1. Zorg voor bilaterale ademgeluiden en duurzame kooldioxide met gebruik van borst auscultatie met een stethoscoop en EtCO ₂ monitoring.
      2. Blader de longen van de bigget naar een doorlopende luchtwegdruk van 20 cm H ₂ O. Blader dan de manchet van de endotracheale buis op tot de minimale druk die nodig is om luchtlek te voorkomen bij een druk van 20 cm H _{2 O, luisterend over de luchtpijp om luchtlekken te identificeren indien aanwezig.
         OPMERKING: Dit is belangrijk om mucosale ischemie te voorkomen tijdens intermitterende positieve drukventilatie.}
      3. Normoxia en normocarbia worden onder narkose gehouden.
   8. Begin de toediening van 2% isofluraan in 50% zuurstof / 50% lucht. Titreer zuurstof om PaO ₂ van 90 - 100 mmHg te handhaven. Ga verder gedurende 3 uur (of gewenste experimentele duur).
   9. Ophthalmische zalf op de ogen toedienen om droogheid te voorkomen voor de duur van de verdoving.
2. Begin de femorale arteriële catheterisatie na de aanvang van 2% isofluraan.
   1. Administreer breedbeeld-antibiotica pre-incision (cefazoline, 25 mg / kg) via de perifere intraveneuze lijn om infectie van de chirurgische plaats te voorkomen.
   2. Steriliseer beide groenten met gekleurde chlorhexidine om een ​​goede steriele veld te verzekeren en plaats een passende steriele draperie ( Figuur 3 B ). Minimaal moeten medewerkers die deelnemen aan overlevingskirurgie een chirurgische cap, masker, steriele handschoenen en oogbescherming dragen.
   3. Palpate de femorale puls bij de inguinale vacht met behulp van de index en de middelste vingers.
   4. Maak een oppervlakkige 1,5 cm craniocaudale incisie met behulp van een scalpel ( Figuur 3 C ).
   5. Dissect tussen de twee hoofden van de Gracilis-spier met behulp van een stomp instrument, zoals chirurgische hemostat of stompe schaar ( Figuur 3 D ).
      OPMERKING: De femorale neurovasculaire bundel wordt typisch gevonden tussen en net diep aan deze twee spieren. ( Figuur 4 A ).
   6. Met behulp van vaatlussen of zijden banden, isoleer de slagader bij het proximale en distale uiteinde. Gebruik de lus om de slagader naar het vlak van de huid distaal te trekken ( Figuur 4 B ).
   7. TerwijlPlaatsing van tractie op de proximale das voldoende om de bloedstroom te onderbreken, maak een kleine arteriotomie met een paar tenotomische scharen.
      1. Wees voorzichtig om de slagader niet door te voeren. Een kleine arteriotomie is voldoende. Alternatief, gebruik een naald-en-draad benadering om de slagader te bereiken ( Figuur 4 C ).
      2. Zachte tractie op de proximale das voorkomt teveel bloedverlies op elk moment tijdens dit gedeelte van de procedure. Als u de naald- en draadbenadering gebruikt, moet u de geleidedraad (geleverd met de kit of afzonderlijk) door de naald en in de slagader tot 5 cm overbrengen.
      3. Wees voorzichtig om de draad niet verder te bevorderen, omdat het ventriculaire ectopie kan veroorzaken. Verwijder de draad onmiddellijk 1-2 cm als dit gebeurt.
   8. Verwijder de naald uit het vat, let erop dat de geleidingsdraad in het vat wordt verlaten. Zet de katheter voorzichtig over de draad en in het vat ( Figuur 4 D).
      1. Gebruik een 3-franse, 8 centimeter katheter voor katheterisatie van de femorale arterie. Verwacht zachte weerstand wanneer de punt van de katheter eerst de oppervlakkige wand van het vat binnentreedt.
   9. Als u de arteriotomiebenadering gebruikt, voert u de katheter of polyethyleenbuis rechtstreeks in het vat. Bloedrendement moet onmiddellijk worden waargenomen.
   10. Bevestig de katheter direct aan een drukomvormer. Spoel de katheter met normale zoutoplossing om de katheterpatentie te behouden.
       1. Plaats hechtingen om de katheter vast te zetten. Bedek de snede met steriel gaas om verontreiniging te voorkomen. Gebruik een percutane aanpak van de catheterisatie van de femorale arterie.
          OPMERKING: Zorg dat de echografie door een ervaren technicus wordt uitgevoerd.
3. Intra-operatieve condities en monitoring:
   1. Verhit het piglet actief met een verwarmingsapparaat met gedwongen lucht en monitor het voortdurendRectale temperatuur ( figuur 3 A ).
   2. Voeg dextrose bevattende, isotonische vloeistof (5% dextrose in Ringer's lactaat of normale zoutoplossing) toe aan onderhoudsniveau (4 keer het gewicht van het varken in kilogram, ml / uur).
   3. Monitor vitale tekenen voor verstoringen (hypotensie, aritmie, hypo / hyperthermie, hypoxie)
      OPMERKING: Normale vitale tekenreeksen en bijbehorend voorgesteld beheer bij abnormaliteiten zijn samengevat in tabel 1 .
   4. Met behulp van een in de handel verkrijgbaar bloedanalysesysteem, meet de arteriële bloedgassen (arteriële pH, pCO2, pO2), elektrolyten (bicarbonaat, basisoverschot / tekort, natrium, kalium, ioniseerd calcium), hemoglobine en glucose minstens per uur tijdens de experimentele periode. Teken arterieel bloedmonster uit de femorale arteriekatheter.
      OPMERKING: Normale zuur- en elektrolytwaarden samen met aanbevelingen voor correctie als abnormaliteiten worden gezien aOpnieuw samengevat in tabel 1 .
4. Na 3 uur de blootstelling van isofluraan, verwijder de femorale slagaderkatheter.
   1. Zet de proximale vasculaire zijde voorzichtig vast om de femorale slagader permanent vast te houden om bloeden te voorkomen. Als alternatief gebruik je een vasculaire clip.
   2. Zorg voor volledige hemostase voordat u de incisie sluit. Besproei de incisie met 10-20 ml steriele zoutoplossing om infectie te voorkomen.
5. Na afloop van het experiment sluit de huidinsnijding met eenvoudige, onderbroken hechtingen met behulp van een 3-0 niet-absorbeerbaar hechtmateriaal.
   1. Infiltreer de wond met 0,5-1 ml / kg 0,25% bupivacaïne met 1: 200.000 epinefrine voor pijnbestrijding. Bedek de incisie met een steriele, chirurgische huidkleefstof.
      OPMERKING: Er is geen dressing nodig.
6. Stop de verdoving en laat het varken wakker worden.
7. Verwijder de endotracheale buis op tekenen van awaKening (opening van de ogen, poging om te staan, schoppen en openen en sluiten van de mond), met tekenen van stabiele hemodynamica, voldoende zuurstofopname en voldoende ventilatie.
8. Na extubatie, voer aanvullende zuurstof via gezichtsketen tot toereikendheid van zuurstof en ventilatie verzekerd zijn.
9. Buprenorfine 0,05 mg / kg subcutaan toedienen voor aanvullende pijnbestrijding. Alternatief kan transdermale fentanyl worden gebruikt.
10. Verplaats indien nodig het varken naar zijn huiskooi. Verlaat het varken niet onbewaakt totdat het voldoende bewustzijn heeft hersteld om de sternale recumbency te behouden. Stuur geen dier terug naar een kooi met andere dieren totdat het volledig is hersteld van verdoving.
    1. Verwarm de kooi van de prive-woning actief met een warmtelicht.
    2. Volg het dier nauwkeurig na verdoving door getrainde dierenarts of onderzoekspersoneel. Zorg voor de varkensmelkvervanger.
11. Laat de biggen terugkomenVoor 48-72 uur, afhankelijk van de experimentele doelen.
    1. Spuit varkens met buprenorfine subcutaan in een geschikte dosis, om de drie uur zo nodig om pijnbestrijding te waarborgen, naar keuze van dierenzorgmedewerkers die ervaren zijn om na-chirurgisch ongemak bij dieren te beheersen.
    2. Monitor de varkens elke uur voor de eerste 6 uur na de operatie en om de 4 uur daarna. Voer dieropoffering en weefselaanvraag op identieke wijze uit om dieren te controleren, zoals hierboven beschreven.

Resultaten

Veertig biggen werden onderzocht (18 isofluraan, 22 controle). Studieprocedures werden goed door alle dieren getolereerd. Alle geteste piglets waren mannelijk. Er was geen significant verschil tussen de groepen met betrekking tot leeftijd of gewicht ( tabel 2, figuur 5 ). Gemiddelde laboratoriumwaarden tijdens experimenten in de isoflurangroep zijn in tabel 3 gegeven . Deze waarden tonen aan dat het experimentele protocol interne consistentie en reproduceerbaarheid bezit, omdat we in de loop van twee jaar meerdere technici hebben uitgevoerd. Ongezien van deze nummers zijn de vele aanpassingen en correcties die we tijdens de operaties moesten uitvoeren om fysiologische hemostase te behouden. CO ₂ retentie, lage kernlichaamstemperatuur en hypoglykemie zijn enkele van de vele confounders die we afwijken door middel van uitgebreide monitoring en aanpassing, indien nodig.

T 'fo: keep-together.within-page = "1">
Figuur 1:. Plaatsing van de perifere intraveneuze lijn. Een 24 G intraveneuze katheter wordt geplaatst in de marginale oorader. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Sequence of Events in Piglet Intubation. ( A ) Piglets worden geplaatst in de laterale liggend stand voor intubatie. Standaard monitoren worden geplaatst. ( B ) Een assistent verplaatste de tong van de mondholte terwijl de laryngoscopist laryngoscopie verricht. ( C ) De epiglottis is morfologisch vergelijkbaar met die van een mens. In deze afbeelding is de tip van thHet blad is in de vallecula. ( D ) Larynxale anatomie van varkens is duidelijk verschillend van die van mensen; De stembanden zijn enkele millimeter diep aan de laryngeale inlaat. In deze afbeelding heeft de punt van het mes de epiglottis verplaatst en de larinks blootgesteld. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Femoral Artery Approach. ( A ) De diertemperatuur wordt gehandhaafd door gebruik te maken van een geforceerde luchtverwarmingsinrichting. Monitoring wordt gedurende de gehele procedure gebruikt. Een breed steriel veld wordt bereid met getinte chloorhexidine en het dier is bedekt met een fenestrated steriele drape. ( B ) Palpatie bij de inguinale vlek onthult de femorale puls. ( C ) Een crAniocaudale huidinsnijding, ongeveer loodrecht op de ingewanden en ongeveer 1,5 cm lang, wordt uitgevoerd boven de femorale puls. ( D ) Een stompe dissectie wordt bereikt om de femorale neurovasculaire bundel bloot te stellen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Femoral Artery Cannulation. ( A ) Van de laterale naar de mediale bevat de neurovasculaire bundel de femorale zenuw, de slagader en de ader. ( B ) De femorale slagader is geïsoleerd met behulp van vaatlussen en / of hechting. Doorlopende spanning op het proximale das voorkomt buitensporig bloedverlies terwijl de slagader is gestoken (zie het witwassen van het vat). ( C ) Een naald wordt gebruikt om de femorale a te puncturenRerving, vermijding van perforatie van de achterste wand van de slagader. Wanneer het bloed terugkomt, wordt een geleidingsdraad door de naald in de slagader gevorderd. ( D ) De naald is verwijderd en de katheter wordt over de geleidingsdraad in de dijbeenslagader. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Vergelijking van gemiddeld gewicht en leeftijd van controle en isofluraan behandelde varkens. De foutbalken staan ​​voor +/- 1 standaardafwijking, waarbij de standaardafwijkingswaarde boven elke foutbalk wordt vermeld.

Tabel 1: Samenvatting van Normaal Piglet Vital Signs, ArteriAl Bloedgas- en Serumelektrolytwaarden met voorgestelde correctiemethoden. Klik hier om een ​​grotere versie van deze tabel te bekijken.

Tabel 2: Samenvatting van het gemiddelde gewicht en de leeftijd van de controle tegen isofluraan behandelde varkens. Een unpaired twee-tailed T-test werd uitgevoerd, waarbij geen significant verschil is tussen de twee groepen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze tabel te bekijken.

Tabel 3: Gemiddelde vitale tekens en laboratoriumwaarden van isofluraan behandelde dieren. In de loop van de thE operaties, afwijkingen van de vitale tekens en laboratoriumwaarden van de normale rangen worden snel gecorrigeerd. Klik hier om een ​​grotere versie van deze tabel te bekijken.

Discussie

Critical Protocol Steps / Problemen oplossen

Naarmate het experiment begint, moet het induceren van niet-invasieve vitale symptomen beginnen. Bloeddruk, hartslag, zuurstofverzadiging en rectale temperatuur kunnen gemakkelijk worden verkregen en gecontroleerd. Het varken moet onder een luchtverwarmingsapparaat zijn om een ​​goede lichaamstemperatuur te behouden, aangezien deze dieren snel onder algemene verdoving hypothermisch kunnen worden. Snelle plaatsing van een perifere intraveneuze katheter zorgt voor de behandeling van noodgevallen als ze ontstaan ​​tijdens de inductie. Het is belangrijk om de varken continu, niet-invasieve of invasieve doorlopend te monitoren gedurende zowel de isofluraanprocedure als de offerprocedure. Het piglet kan zeer vaak tijdens arteriële zuurstof-desaturatie tijdens meerdere stappen tijdens het protocol ervaren, vooral tijdens de luchtwegmanagement en intubatie. We gebruiken 8% sevofluraan om anesthesie te veroorzaken om de menselijke pediatrische praktijk te herhalen en te sprekenD inductie. Echter, 5% isofluraan is succesvol gebruikt en is geschikt. Gezien de verschillen in anatomie en een aanleg voor laryngospasmen, kan het varken moeilijk zijn om te intuberen. Als het varken begint te desatureren tijdens de inductie- en / of luchtwegbeheersing, dient 100% zuurstof en sevofluraan onmiddellijk via gezichtskegel te worden toegediend om een ​​veilig zuurstofverzadigingsniveau en een adequate diepte van verdoving te herstellen. Houd er rekening mee dat, terwijl het narkoseplan diep genoeg moet zijn om intubatie mogelijk te maken, kan overmatige verdoving leiden tot apneu. Voortdurende waakzaamheid ten aanzien van de ventilatie van het dier en oxygenatie is vereist, met dienovereenkomstig de titratie van de ingeademde verdoving. Intubatie kan dan opnieuw worden aangetoond zodra de zuurstofherstelling is hersteld en voldoende narkose is bereikt. Positieve drukventilatie via de gesigskegel kan gepoogd worden, maar is meestal mislukt. Als laryngospasm optreedt, wordt de toepassing van lidocaïneoplossing direct aan de voc toegediendAlkoorden zijn aangegeven om tracheale intubatie toe te staan.

Noodgeneesmiddelen moeten altijd beschikbaar zijn en dienen zo nodig te worden toegediend tijdens de kritieke delen van het protocol om fysiologische verstoringen te corrigeren. Terwijl een grondige discussie over verdovings- en drugsgebruik in varkens buiten het bereik van dit manuscript valt, is Swindle's "Swine in the Laboratory: Chirurgie, Anesthesie, Imaging en Experimentele Technieken" een uitstekende bron. ²⁷

Op soortgelijke wijze kan het pigment snel tijdens het offer gaan desatureren, na het openen van de borstholte tijdens de middelste sternotomie. De operator moet snel maar veilig werken om het hart bloot te leggen en de angiocatheter in te voeren om de koude PBS te starten. Een grondige koude PBS perfusie (en snelle fixatie met PFA, indien aangegeven) is nodig om ischemische schade aan de hersenen te voorkomen.

Zodra het varken is geïncubeerd, respiRatory rate en end-tidal carbon dioxide tracking begint ( Tabel 1 ). Stabiliseer de pigment's ultieme zuurstofvorming en ventilatie door de ventilatorsteun te titreren, terwijl voldoende narkose wordt behouden. We gebruiken mechanische ventilatie om zo veel mogelijk gebruik van mensen te gebruiken. Hyperoxie moet worden vermeden om de kans op oxidatieve stress te minimaliseren.

De isofluraanpigleten ondergaan een femorale arteriecannulatie om 2 redenen: de voortdurende bloeddruk van de arteriële bloedwegen controleren; En om arterieel bloed te beoordelen voor de beoordeling van de zuurbasisstatus, bloedgassen en elektrolyten gedurende de gehele procedure. Kannulatie van de femorale slagader kan uitdagend zijn. Zie de video voor volledige details. Voor overlevingsexperimenten dient deze procedure onder steriele omstandigheden in een steriele werkomgeving te worden uitgevoerd. Na de canulatie van de femorale slagader, begin de uurlijkse monitoring van arterieel bloedgas en serumelektrolyten, indien nodig corrigeren omHomeostase behouden ( tabel 1 ). De piglet moet continue dextrose bevattende isotonische vloeistof ontvangen om voldoende bloedglucose te behouden. Tijdens het experiment moet het dier voortdurend worden gecontroleerd op de normotermie, en er moet nodig worden geforceerd-luchtverwarming. Het is even belangrijk om hypothermie en hyperthermie te vermijden.

Terwijl dit protocol een halfrond van "frisse" hersenen en een halfrond van vast neuraal weefsel biedt, kan dit gemakkelijk aangepast worden om alternatieve studieontwerpen te kunnen aannemen. Aanvullende monsters kunnen ook bij het varken worden verzameld. CSF kan worden verkregen na het narkosen van het varken, met of zonder fluoroscopische begeleiding. Bloed kan ook worden verzameld uit de piglet bij verschillende stadia van het protocol, inclusief de van de femorale arteriekatheter, evenals direct vanaf de linker ventrikel via de angiocatheter direct voor perfusie. De herhalingsperiode kan ook verlengd of sh Gerangschikt voor respectievelijk onderzoek van de chronische of acute respons.

Beperkingen van de techniek

Dit protocol en model zijn technisch uitdagend. Een deskundige onderzoeker en een volledig geleverde operationele suite zijn nodig, met name voor overlevingsexperimenten. De onderzoeker (en assistent voor bepaalde delen van het protocol) moet comfortabel zijn met zowel de chirurgische en anesthetische componenten van dit protocol, dat training en ervaring vereist om te beheersen. Andere beperkingen omvatten de kosten van de biggen ten opzichte van knaagdiermodellen, hoewel het pigletmodel veel minder kosteloos is dan niet-menselijke primaten. Hoewel de kosten van varkens zullen variëren op basis van de regio en de boerderij waaruit dieren zijn verkregen, kan men verwachten dat de kosten per dier minder zijn dan $ 500, terwijl niet-menselijke primaten duizenden dollars per dier kunnen zijn. Volgens onze ervaring bedraagt ​​de gemiddelde kosten per dier ongeveer 200 dollar.

Jove_content "> Ten slotte, zoals het doel van het pigletmodel is om het ontwikkelende menselijke brein te nabootsen, dienen alleen neonatale biggen te worden gebruikt. Het centrale zenuwstelsel is het meest kwetsbaar tijdens de periode van snelle groei en bij varkens komt deze periode uit Zes weken voor de geboorte tot vijf weken na de geboorte ^8. Het gebruik van oudere biggen die ver weg zijn van hun verouderingsdatum, dragen de kans om de klinische relevantie van het pigletmodel te verzwakken. Hoewel er sprake is van significante controverse met betrekking tot de "gelijkwaardigheid" Die van een menselijk neonaat, zijn er opvallende overeenkomsten wanneer vroege postnatale hersenontwikkeling tussen mensen en varkens wordt vergeleken. Bij geboorte is de hersenen van mensen en varkens respectievelijk 27% en 25% van het volwassen gewicht. ¹⁴ Gebaseerd op het werk van Johnson En collega's, kunnen we concluderen dat die ene weekweek ongeveer gelijk is aan één menselijke maand. ⁹ Deze resultaten, gebaseerd op wh Ole-brain volume data, zijn gevalideerd door het werk van Workman en collega's. ²⁸ We hebben 7-14 dagen oude biggen geselecteerd om een ​​mens van 1-2 maanden te benaderen. Het kan echter voorzichtig zijn om jongere dieren (1-5 dagen oud) te gebruiken als het experimentele doel is om de zeniet van de spiergroentespur te stimuleren. Dit is haalbaar, aangezien de varkens bij de geboorte gespeen kunnen worden. Ons gebruik van het pigletmodel zal aanpassen aangezien nieuwe gegevens beschikbaar worden gesteld met betrekking tot de parallellen tussen de ontwikkeling van menselijke en varkens postnatale hersenen.

Betekenis van de techniek met betrekking tot alternatieve / bestaande methoden

Het varken bezit opvallende overeenkomsten met menselijke neonaten, inclusief kritische parallellen in de ontwikkeling van hersenen en pathofysiologische reacties. Het is daarom een ​​klinisch relevant zoogdiermodel en de proof of concept-studie geeft aan dat het varken een geschikt model is voor de studie van anesthetische neurotoxiciteitRef "> 29 ^{, 30.} Het model kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere vormen van ontwikkelingsonderzoek op neurowetenschappen. Het model is ontworpen om met behulp van wetenschappelijke autoriteit te onderzoeken dat de omvang en het mechanisme van AIDN minimaliseren betreft confounders zoals hypoxie of hypercarbia Veroorzaakt neurologische schade die kan worden geïnterpreteerd als anesthesie-geïnduceerde. Om dit te bereiken wordt het piglet behandeld met dezelfde perioperatieve chirurgische en anesthetische aandoeningen en monitoring die door pediatrische patiënten wordt ervaren.

Toekomstige Aanwijzingen en Toepassingen Na het Bemeesteren van de Techniek

Voorwaarts zijn varkens ook zeer vatbaar voor neurocognitieve testen ¹⁷ . Dit attribuut zal een complexe, uitgebreide evaluatie van de neurocognitieve uitkomst mogelijk maken na anesthetische blootstelling in toekomstige experimenten. Ook moet worden onderstreept dat kinderen in de klinische omgeving meestal verdoving ondergaanRa fysiologisch stressvolle procedure (operatie). De interacties tussen anesthesie en post-chirurgische ontsteking evenals het daaruit voortvloeiende neuronale letsel en / of toxiciteit (zoals gezien bij knaagdieren en primaten) verdienen verdere exploratie en significante overweging. Het neonatale piglet biedt een uniek, klinisch relevant basislijnmodel voor de effecten van verdoving op de ontwikkelende hersenen zonder de confounding invloed van de operatie (nabootsing van algemene klinische scenario's bij kinderen). Het effect van verschillende typen operaties of andere confounders (ischemie, hersenletsel, genetische predispositie, enz. ) Kan nu betrouwbaar getest worden met dit model.

In laboratorium zijn we van plan meerdere electrofysiologische en elektrochemische methoden te gebruiken om de anesthesie- en AIDN-mechanismen verder te onderzoeken in intacte neurale circuits. Deze technieken omvatten in vivo meting van de neurotransmitteractiviteit, het opnemen van hele cellen patch-clamp, neuroimaging enNeurofysiologische onderzoeken in hersenplakken. Met betrekking tot de neurowetenschappen in de onvolgroeide hersenen zijn varkens meer relevant voor mensen dan muizenmodellen met zeer weinig van de nadelen die bij niet-menselijke primaten aanwezig zijn. Met verdere ontwikkeling kunnen piglets het ideale model zijn voor human developmental neuroscience onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Liqui-Wean	Melk Specialiteiten	454836
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask	VetEquip	921428
Masterflex L/S Peristaltic Pump	Cole-Parmer	EW-77916-20	Alternatieve peristaltische pompen kunnen worden gebruikt, zolang een constante en voldoende perfusiesnelheid kan worden bereikt
Masterflex L/S Pump Tubing, 25 ft	Cole-Parmer	EW-96410-24
14 G angiocatheter	Becton-Dickson	381164
10x PBS	Thermo-Fisher Scientific
Paraformaldehyde poeder	Sigma-Aldrich	P6148-5KG	Ons lab maakt dit reagens van het poeder omdat het veel kosteneffectiever is. Voorbereide paraformaldehyde kan ook worden gekocht.
2-methylbutaan	Sigma-Aldrich	M32631-4L
Naadlehouder	Teleflex	152720
Rechtshoekige klem	Teleflex	496217
Rongeurs	Teleflex	028120
Tenotomie schaar	Teleflex	423480
Naaischaar	Teleflex	423440
McPherson Tying Forceps	Teleflex	425200
Adson Tissue Forceps	Teleflex	181223
3-0 nylon hechtdraad	Medline	ETH627H
Integra SL Anesthesia Workstation	DRE Veterinary	2350	Deze anesthesiewerkplaats is gekozen om de klinische monitoring die kinderen in de operatiekamer ervaren zo goed mogelijk te imiteren. Elke anesthesiemachine kan worden gebruikt zolang deze voldoende fysiologische monitoring en interventie mogelijk maakt.
Laryngoscope handgreep	Teleflex	8710000
Miller 1 Laryngoscope kling	Teleflex	2216100
Bair Hugger	3M	750
Bair Hugger Torso Deken	3M	540
iStat Handheld	Abbott Point of Care	300	Alternatieve punt van zorg arteriële bloedgasanalyse apparaten kunnen worden gebruikt
iStat Cartridges	Abbott Point of Care	CG8+
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive	Ethicon	DNX6
LMA Laryngotracheale Atomisatie Apparaat	Teleflex	MAD720	Een met katoen bedekt applicatoretje gedrenkt in lokaal anestheticum kan ook worden gebruikt
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheale Buis	Teleflex	5-10106	Dit model ETT is geselecteerd omdat het een Murphy's oog heeft, wat belangrijk is om ETT-occlusie tijdens het experiment te voorkomen
Pediatra Intubatie Stylet	Smiths Medical	100/120/100
24 G angiocatheter	Becton-Dickson	381112
#10 Wegwerp Scalpel	Ted Pella, Inc	549-9-10
Arteriële Druk Monitoring Kit (3 French, 8 cm katheter)	Cook Medical	C-PMSY-300-FA	Eenvoudige polyethyleen buis met een luer-lock adapter kan ook worden gebruikt
Intramedic PE90 Polyethyleen buis	Fisher Scientific	14-170-12D
Monoject Blunt Cannula	VWR International	15141-144