Methodenartikel

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/55196

⸱

1 november 2017

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste doelen voor regeneratieve geneeskunde is de generatie en het onderhoud van hematopoietische stamcellen (HSCs) afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Tot voor kort hebben hematopoietische progenitorcellen die ontbreken van HSC potentieel, en in plaats daarvan lijken dooierzak Haematopoiese voornamelijk gegenereerd door inspanningen om te onderscheiden van hPSCs in HSCs. Deze resulterende hematopoietische progenitorcellen mogelijk beperkte nut voor in vitro ziekte modellering van verschillende volwassen hematopoietische aandoeningen, met name die van de lymfoïde geslachten. Echter, we hebben onlangs beschreven methoden voor het genereren van erytro-myelo-lymfoïde multilineage definitieve hematopoietische progenitorcellen van hPSCs met een fase-specifieke gestuurde differentiatie-protocol, die we hier schetsen. Embryoid organen (EBs) worden door enzymatische dissociatie van hPSCs op de kelder membraan matrix-gecoate plasticware gevormd. EBs worden onderscheiden naar mesoderm door recombinant BMP4, die later naar de definitieve hematopoietische programma door de GSK3β-remmer, CHIR99021 is opgegeven. Als alternatief, primitieve Haematopoiese wordt bepaald door de PORCN-remmer, IWP2. Haematopoiese is verder gedreven door de toevoeging van recombinant VEGF en ondersteunende hematopoietische cytokinen. De resulterende hematopoietische progenitorcellen gegenereerd met behulp van deze methode hebben het potentieel om te worden gebruikt voor ziekte en ontwikkelingsstoornissen modelleren, in vitro.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) worden gedefinieerd als zowel de menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), en hebben de unieke mogelijkheid om niet alleen zelf-vernieuwing onder passende groei voorwaarden, ondergaan maar ook het vermogen om te differentiëren tot alle celtypes afgeleid uit de drie lagen van de kiem: ectoderm, endoderm en mesoderm1. Als gevolg van deze unieke vermogens houden hPSCs grote belofte voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en cel-gebaseerde therapieën2. Terwijl meerdere celtypen hebben met succes zijn onderscheiden van hPSCs, is één grote uitdaging de in vitro -specificatie van uitsluitend volwassene-achtige hPSC afkomstige hematopoietische cellen van de stam (HSCs) en definitieve hematopoietische progenitorcellen.

Een waarschijnlijk hinderpaal voor de ontwikkeling van de menselijke HSCs van hPSCs is de aanwezigheid van meerdere hematopoietische programma's binnen de menselijke embryo's3. Het eerste programma dat naar voren komt, genoemd "primitieve Haematopoiese," afkomstig is binnen de extraembryonic dooierzak weefsel en beste wordt gekenmerkt door zijn vluchtige productie van erytroblast progenitoren (EryP-CFC), macrofagen en megakaryocytes. Met name dit programma doet geen aanleiding geven tot HSCs, noch geeft het aanleiding tot T en B lymfoïde progenitoren. De dooierzak geeft Transient echter aanleiding tot beperkte definitieve hematopoietische progenitorcellen, zoals de erytro-myeloïde voorlopercellen (EMP4,5,6,7,8) en de erythroid-deficiënte lymfoïde-primer multipotente voorlopercellen (LMPP9). Noch EMPs, noch LMPPs zijn echter volledig multipotente, of staat van HSC-achtige engraftment in volwassen ontvangers. Daarentegen verderop in de ontwikkeling, is het klassiek gedefinieerde "definitief" hematopoietische programma opgegeven in de regio van de aorta-gonaden-mesonephros van het embryo zelf, die aanleiding geven tot alle volwassen hematopoietische lineages, met inbegrip van de HSC. De specificatie van deze intra embryonale definitieve hematopoietische stamcellen treedt op in een inkeping-afhankelijke manier, via een endotheel-naar-hematopoietische overgang van hemogenic endotheel (HE)3,10,11 ,12,13,14. Afgezien van reconstitutie capaciteit, kunnen de multilineage potentiële en Notch-afhankelijkheid van deze cellen worden gebruikt om te onderscheiden deze definitieve hematopoietische progenitorcellen van de EMP en de LMPP (herzien in verwijzingen3,13 ).

Inzicht in het bestuur van primitieve en definitieve hematopoietische specificatie van hPSCs mechanism(s) is waarschijnlijk cruciaal voor de reproduceerbare productie van definitieve hematopoietische progenitorcellen in allerlei hPSC lijnen. Tot voor kort bestond hPSC differentiatie protocollen die multipotente primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen scheiden kon niet15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Vele benaderingen met foetale runderserum (FBS) en/of stromale co cultuur eerst geschetst het hematopoietische potentieel van hPSC differentiatie, met mengsels van primitieve en definitieve hematopoietische potentiële15,16, 17,19,22,23,25. Verder veel serumvrij hematopoietische protocollen hebben beschreven de signaal-eisen voor de specificatie van mesoderm uit hPSCs die havens hematopoietische potentiële18,20,21, 24. aangezien deze methoden nog steeds gaf aanleiding tot heterogene mengsels van beide programma's, hun gebruik in klinische toepassingen en begrijpen van ontwikkelingsstoornissen mechanismen kunnen echter beperkt.

We hebben onlangs gebouwd op deze studies, hebben geschetst van de fase-specifieke signaal eisen voor ACTIVIN/NODAL en WNT signalering in primitieve en definitieve hematopoietische specificatie van hPSC afkomstige mesoderm18,26 . De laatste was bijzonder uniek, omdat het gebruik van fase-specifieke WNT signaal manipulatie voor de specificatie van uitsluitend primitief of uitsluitend definitieve hematopoietische progenitorcellen26 zorgt. Tijdens mesoderm specificatie, de remming van het canonieke WNT signalering met de PORCN-remmer IWP2 resulteert in de specificatie van CD43+ EryP-CFC- en myeloïde voorlopercellen, met geen detecteerbare lymfoïde potentieel. In schril contrast, stimulatie van het canonieke WNT signalering met de GSK3β-remmer, CHIR99021, tijdens dezelfde ontwikkelingsfase differentiatie resulteerde in de totale afwezigheid van detecteerbare CD43+ EryP-CFC, terwijl het tegelijkertijd leiden tot de specificatie van de CD34+CD43− HE. Deze bevolking bezeten myeloïde, HBG-erythroid en T-lymfoïde potentieel. Latere analyses vastgesteld dat hij als ontbreekt de uitdrukking van CD7327,28 , CD18428, en haar hematopoietische mogelijke NOTCH-afhankelijke28was. Verdere, eencellige klonale analyses aangetoond dat deze definitieve hematopoietische lineages kon worden afgeleid uit enige Multipotente cellen28. Samen genomen, blijkt deze studies dat stadium-specifieke WNT signalering manipulatie pure primitieve hematopoietische progenitorcellen of multipotente NOTCH-afhankelijke definitieve hematopoietische progenitorcellen kunt opgeven.

We schetsen hier, onze strategie van de differentiatie, dat de opbrengst uitsluitend primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen, via manipulatie van canonieke WNT signalering tijdens mesodermal patronen, en hun downstream hematopoietische afstamming testen. Dit protocol is van grote waarde voor onderzoekers die geïnteresseerd in de productie van primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen van hPSCs voor regeneratieve geneeskunde toepassingen zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. reagentia

  1. verkrijgen cel lijnen; hESCs of hiPSCs 1, muis embryonale fibroblasten (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
  2. reagens voorbereiding
    1. bereid een 0,1% w/v oplossing van gelatine in PBS. Steriliseren in autoclaaf en bewaren bij 4 ° C na aliquoting.
      1. De gelatine beklede plasticware voorbereiden. Jas 6-well gerechten met 1,5 mL 0,1% gelatine oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Onmiddellijk vóór gebruik, gecombineerd resterende gelatine oplossing.
    2. Bereiden de MEF media doordat IMDM met 15% v/v FBS en 1 x antibiotica. Aanvulling met 2 mM L-glutamine en 400 µM monothioglycerol (MTG) voorafgaand aan het gebruik en bewaren bij 4 ° C.
    3. Bereiden de hPSC cultuurmedia als een oplossing van DMEM/F12 met 20% v/v knockout serum vervanging (KOSR), 1 x niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1 x antibiotica, 55 µM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine en 10 ng/mL bFGF. Filter steriliseren met een 2 µm filter te bewaren in het donker bij 4 ° C.
    4. Voorbereiden de serumvrij Wash media als een oplossing van DMEM/F12 met 5% v/v KOSR en 4 mM HCl. Filter steriliseren met een 2 µm filter aliquoot, te bewaren in het donker bij 4 ° C.
    5. Maken een 1 mg/mL DNase ik oplossing door ontbinding DNase ik voor 3-4 h in ijskoude, steriel gedeïoniseerd water op het ijs. Filter steriliseren met een 2 µm filter en opslaan van aliquots bij -20 ° C.
    6. Bereid de STOP-oplossing met WASH media: Voeg 10% FBS en 10 µg Fe/mL DNase ik. De STOP-oplossing moet worden bereid onmiddellijk vóór gebruik.
    7. Bereiden de kelder membraan-matrix (bijvoorbeeld, matrigel, aangeduid als MAT tonkilometers) mengsel oplossing.
      Opmerking: Alle stappen bereiden en gebruiken van de MAT mengsel moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C. dooi bevroren MAT in ijs bij 4 ° C's nachts. MAT 1:1 verdunnen door het toevoegen van 10 mL ijskoud IMDM en chill in ijs bij 4 ° C's nachts. MAT mengsel met een extra 20 mL verdund ijskoude IMDM en chill in ijs bij 4 ° C's nachts. ALIQUOT in vooraf gekoeld buizen en opslag bij-20 ° C tot gebruik. Wanneer klaar voor gebruik, ontdooien MAT mengsel 's nachts bij 4 ° C.
      1. Jas de MAT cel cultuur platen.
        Opmerking: Alle stappen van coating MAT platen moeten worden uitgevoerd op het ijs. Vooraf chill 6-well en 24-well platen bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur. Als u klaar bent met vacht platen, plaats ze op het ijs. Coat elk putje met 4 x verdunde MAT, verwijderen en opnieuw met behulp van enige overtollige oplossing. Laat op het ijs voor 30-60 min en overtollige MAT gecombineerd. Droog de MAT gecoate platen in een 37 ° C 5% CO 2 incubator voor een minimum van 3 h. gebruik binnen 72 uur van een coating.
    8. Bereid de oplossing van 10% boviene serumalbumine (BSA) door het oplossen van 10% w/v BSA in ijskoude, gedistilleerd, gedeïoniseerd water bij 4 ° C voor 3-4 h. Filter te steriliseren met een 2 µm filter in een licht-blokkerende fles en winkel bij 4 ° C.
    9. Bereid de ascorbinezuur oplossing. Langzaam los een 5 mg/mL oplossing van L-ascorbinezuur in ijskoude, gedistilleerd, gedeïoniseerd water op het ijs voor 3-4 h. Swirl af en toe tot het is opgelost. Filter steriliseren met een 2 µm filter en opslaan van aliquots bij -20 ° C.
    10. Bereiden de media serumvrij differentiatie (Finaliteitsrichtlijn) door een oplossing van 75:25 van IMDM:Ham ' s F-12, voeg toe 0,5% BSA, 1 x B27, en 0,5 x N2 supplementen. Bewaren bij 4 ° C. Add 1 x L-glutamine, 50 µg Mo/mL ascorbinezuur, 400 µM MTG en 150 µg/mL holo-transferrine onmiddellijk voorafgaande gebruiken.
    11. Bereiden stamcel serumvrij voedingsbodems (bijvoorbeeld, StemPro, aangeduid als SP34 tonkilometers) per de fabrikant ' s instructies. Bewaren bij 4 ° C. Add 1 x L-glutamine, 50 µg Mo/mL ascorbinezuur, 400 µM MTG en 150 µg/mL holo-transferrine onmiddellijk voorafgaande gebruiken.
    12. Bereid de 0,2% Collagenase II oplossing oplossen Collagenase II bij een eindconcentratie van 0,2% w/v in 1:4 FBS:PBS oplossing. Oplossen in waterbad 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten Filter steriliseren oplossing met een 2 µm filter en opslaan van aliquots bij -20 ° C.
    13. Bereiden de fluorescentie geactiveerd Cell Sorting (FACS)-buffer als een oplossing van 5% FBS in te gebruiken onmiddellijk voorafgaande IMDM.
    14. Bereiden OP9 media als een oplossing van α-MEM, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, en 1 x antibiotica. Filter te steriliseren met een 2 µm filter bewaren bij 4 ° C.
    15. Verkrijgen op basis van methylcellulose media (bijvoorbeeld, MethoCult, hierna MeC tonkilometers) als pre-aliquoted 3 mL hoeveelheden of als een fles van 100 mL. Als gebruik van de 100 mL MeC, bij aankomst, verdeel in 2.5 mL aliquots in de conische buisjes 14 mL.
      Opmerking: Alle aliquots moeten worden opgeslagen bij-20 ° C. MeC medium aliquots moeten worden ontdooid onmiddellijk voorafgaand aan gebruik.

2. Mesoderm differentiatie van hPSCs

  1. groeien de hPSC cellijnen op MEFs naar 70-80% confluentie, in een incubator 37 ° C met 5% CO 2.
    Opmerking: De hPSCs moet hebben scherpe, ongedifferentieerde grenzen.
  2. Bereiden MAT beklede plasticware 24 h vóór de hPSCs passaging.
    Opmerking: Het totale aantal MAT beklede 6-well gerechten verschilt hPSC lijnen. Drie 6-well gerechten zijn normaal gesproken voldoende per 6-well schotel van confluente hPSCs op MEFs.
    1. Uitvoeren een proef feeder-uitputting met verschillende verhoudingen van confluente hPSCs:MAT wells (1:4, 1:3, 1:2, enz.) voordat de eerste differentiatie om te bepalen hoeveel MAT beklede 6-well gerechten moeten worden gebruikt voor de volgende differentiaties.
      Opmerking: moet 24 uur na de beplating op MAT, de hPSCs 80-90% heuvels, met cel bosjes van ongeveer 10-20 cellen in grootte.
  3. De media hPSC gecombineerd en voeg 1 mL 37 ° C 0,25% trypsine-EDTA aan elk goed voor 1 min. Aspirate en 1 mL STOP media toevoegen aan elk putje. Met behulp van een cel schraper, schraap de cellen uit de plaat. 1 mL was buffer toevoegen aan elk putje.
    1. Met een serologische Pipetteer 2 mL, triturate 3 - 5 keer breken grote bosjes van cellen en het overbrengen van de cellen naar een conische tube van 50 mL. Centrifugeer het hPSCs bij 330 x g gedurende 5 min.
  4. Resuspendeer de cellen in een totaal volume van hPSC media gelijk aan 2 mL per putje van de MAT beklede plasticware moet worden gebruikt. Voeg toe 2 mL/putje van hPSCs aan de plasticware en na een nacht bebroeden in een incubator 37 ° C met 5% CO 2.
  5. 24 h later gecombineerd van de media en vervangen door 37 ° C 0.05% trypsine-EDTA voor 1 min. gecombineerd de trypsine-EDTA en voeg 1 mL STOP media. Schraap de cellen krachtig met een cel schraper. 1 mL WASH media toevoegen aan elk putje. Met een serologische Pipetteer 2 mL, triturate van de cellen 1 - 2 keer en transfer naar een conische tube van 50 mL. Centrifugeer cellen bij 220 x g gedurende 5 min.
    Opmerking: De lengte van de tijd van trypsine-EDTA behandeling should worden bepaald door de onderzoeker voor elke regel hPSC. De trypsine behandeling moet worden toegepast voor zo lang mogelijk zonder eencellige dissociatie. Deze stap moet loskoppelen van alle de hPSCs van de MAT beklede platen, maar niet leidt tot een eencellige dissociatie. Resulterende EBs dient gemiddeld 6-10 cellen,.
  6. Gecombineerd de media. Met behulp van een serologische 5 mL-pipet, zachtjes resuspendeer de cellen in 20 mL WASH media. Centrifugeer bij 220 x g gedurende 5 min.
  7. Voorzichtig resuspendeer de EBs in dag 0 media (tabel 1). Afzien van differentiatie media met EBs in ieder putje van een 6-well laag-aanhanger cel cultuur schotel met behulp van een 10 mL serologische Pipetteer 2 mL. Plaats in een 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (multi gas) incubator.
    Opmerking: Dag 0 media: Finaliteitsrichtlijn media aangevuld met 10 ng/mL BMP4 (tabel 1). Gebruik voor elke twee platen van hPSCs, een 6-well laag-aanhanger cel cultuur schotel.
  8. 24 h later, voeg toe 2 mL dag 1 media (tabel 1). Incubeer de cellen overnachting in een multi gas incubator.
    Opmerking: Dag 1 media: Finaliteitsrichtlijn media aangevuld met 10 ng/mL BMP4 en 10 ng/mL bFGF aan elk putje (tabel 1).
  9. 18 h later voorzichtig oogst de EBs met een serologische Pipetteer 5 mL en spin op 100 x g gedurende 5 minuten wassen en de hele cultuur te combineren met 10 mL IMDM. Draai bij 100 x g gedurende 5 min. de media Aspirate.
    Opmerking: Puin zal bestaan in de culturen. Deze stap centrifugeren bij een lage snelheid (100 x g) zal het verwijderen van het puin.
  10. Zachtjes resuspendeer de EBs in de Finaliteitsrichtlijn media aangevuld met dag 2 media (tabel 1) en vervolgens het afzien van 2 mL per putje in 6-well laag-aanhanger cel cultuur platen. Incubeer in een incubator multi gas 37 ° C voor 30 h.
    Opmerking: Dag 2 media: 10 ng/mL BMP4, en 5 ng/mL bFGF, en de passende WNT agonist of antagonist (tabel 1).
    1. Toevoegen 3 µM CHIR99021 definitieve hematopoietische progenitorcellen opgeven. Alternatief, voeg 3 µM IWP2 en 1 ng/mL Activin A om aan te geven van primitieve hematopoietische progenitorcellen.
  11. Doorgaan naar sectie 3 voor specificatie van hematopoïetische voorlopercellen.

3. specificatie van CD34 + op hematopoietische progenitorcellen

  1. na 30u, isoleren de EBs met een Pipetteer 2 mL serologische op dag 3 van differentiatie. Overbrengen naar een conische tube van 50 mL en centrifugeer bij 330 x g voor 5 min. zachtjes resuspendeer en wassen met 10 mL van de IMDM. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 330 x g gedurende 5 min.
  2. De EBs resuspendeer in dag 3 media (tabel 2) en 2 mL afzien in elk putje van lage-aanhanger 6-Wells-platen. Incubeer de cellen in een incubator multi gas 37 ° C voor 72 h.
    Opmerking: Dag 3 media: SP34, aangevuld met 15 ng/mL VEGF en 5 ng/mL bFGF (tabel 2). Meer media per putje toevoegen als de pH van de media geoogst op dag 3 van differentiatie is aanzienlijk gewijzigd (dat wil zeggen, geel-oranje op media). Anderzijds gebruiken minder EBs per putje op dag 0.
  3. Na 72 uur incubatie, voeg 2 mL dag 6 media (tabel 2) aan elk putje. Incubeer in een incubator multi gas 37 ° C voor een extra 48 h.
    Opmerking: Dag 6 media: SP34 media, aangevuld met 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF 200 ng/mL SCF, 4 IU EOB, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 en 50 ng/mL IGF-1 (tabel 2). Als meer media is toegevoegd in stap 3.1, voegt u de equivalente hoeveelheid media in stap 3.2 zodat de definitieve cytokine concentraties hetzelfde blijven.
  4. Isoleren de EBs CHIR99021-behandeld op dag 8 van differentiatie. Gaat u verder met sectie 4.
  5. IWP2-behandelde EBs worden geoogst op dag 8 van differentiatie in een conische buis van 50 mL. Centrifugeer bij 330 x g gedurende 5 min. zachtjes resuspendeer in dag 8 media (tabel 2). Incubeer gedurende 24 uur in een 37 ° C 5% CO 2 incubator in lage aanhangend gerechten. Gaat u verder met sectie 4.
    Opmerking: Dag 8 media: SP34 media aangevuld met 100 ng/mL SCF, 2 IU EOB, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L en 30 ng/mL IL-3 (tabel 2).

4. Enzymatische dissociatie van EBs en hematopoïetische voorlopercellen isolatie

  1. isolaat de EBs met een serologische Pipetteer in een 50 mL conische buis. Centrifugeer bij 330 x g gedurende 5 min. Aspirate uit het supernatant.
  2. Voeg toe 2 mL trypsine-EDTA 0,25% tot de EBs. Vortex voor 5 s. Incubate in een waterbad 37 ° C voor 8 min. Voeg 5 mL eindeoplossing. Centrifugeer bij 330 x g gedurende 5 min. Aspirate uit het supernatant.
  3. Resuspendeer de EBs in 5 mL Collagenase II. Vortex voor 5 s en in een waterbad 37 ° C incuberen. Na 60 min, vortex voor 5 s en voeg 5 mL eindeoplossing. Spin bij 330 x g gedurende 5 min. Aspirate uit het supernatant.
  4. In 1 mL FACS buffer, resuspendeer de cellen. De cellen passeren door een zeef van 40 µm cel. Hiermee verwijdert u eventuele ongedissocieerde cel bosjes.
  5. De cellen tellen. Aliquot 1 x 10 6 cellen in een conische buis van 14 mL. Draai de cellen bij 330 x g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen bij een concentratie van 5 x 10 6 cellen/mL in FACS buffer. Aliquot en zwembad 10% van de cellen in elke voorwaarde voor stroom besturingselementen voor de kleur van de cytometrische. Incubeer de cellen in de antilichamen voor 30 min op het ijs, in het donker.
    Opmerking: Zie voorgesteld fluorophore combinaties in Tabel van materialen.
    1. Voor IWP2-behandelde cellen, gebruiken antilichamen anti-CD34 en anti-CD43.
    2. Voor CHIR99021-behandelde cellen, gebruiken antilichamen anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 en anti-CD184.
  6. Spoel de cellen tweemaal gebruik van FACS buffer. Draaien op 330 x g voor 5 min. resuspendeer de cellen bij een eindconcentratie van 5 x 10 6 cellen/mL.
  7. Analyseren of isolaat cellen door stroom cytometry. Voor primitieve hematopoietische progenitorcellen, analyseren de expressie CD34 en CD43 ( figuur 2A). Voor definitieve hematopoietische progenitorcellen, isoleren de HE (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) door FACS ( figuur 2B). Verzamelen van de cellen in de buizen met gekoeld FACS buffer.
  8. Om te beoordelen van het definitieve hematopoietische potentieel van geïsoleerd HE, blijven sectie 5 voor de endotheel-naar-hematopoietische overgang of sectie 7 voor T-lymfoïde assay. Voor primitieve hematopoietische CFC testen, blijven de sectie 6.

5. Endotheliale-naar-hematopoietische overgang

  1. Spin de geïsoleerde CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − cellen bij 330 x g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in hij media bij 200.000 cellen/mL ( Tabel 2). Het distribueren van de cellen in 50 µL aliquots in een 96-Wells laag-aanhanger cel cultuur plaat. Incubeer de cellen overnachting in een 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gas incubator.
    Opmerking: Hij media: SP34 media aangevuld met 5 ng/mL VEGF met 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EOB, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL angiotensine II en 100 µM Losartan kalium bij 2 x 10 5 cellen/mL (tabel 2).
  2. Bereiden de 24-well MAT beklede platen (zie stap 1.2.7.1), desgewenst.
  3. De cellen zal aggregaat in bosjes van 6-10 cellen 's nachts. Voor elk 50 µL volume van reaggregated cellen, breng zachtjes de cellen in het midden van een 24-well MAT beklede plaat op de volgende ochtend. Voorzichtig plaats plaat in meerdere gas incubator van 37 ° C gedurende 4-6 uur, tot de cellen zijn gekoppeld.
  4. Voeg 1 mL verse HE media aan elk putje, nadat de cellen zijn gekoppeld. Incubeer de cellen in een 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gas incubator totdat de hematopoietische cellen zichtbaar zijn (gewoonlijk 5-7 dagen; figuur 2D). Onder 100 X vergroting met behulp van een lichte Microscoop visualiseren.
  5. Oogst de definitieve hematopoietische progenitorcellen doordat zachtjes de HE-media uit cellen. Deze media passeren een 40 µm cel zeef en verzamelen. Aan de Adherente cellen in de put, Voeg 0,5 mL 0,25% trypsine-EDTA naar cellen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. 0,5 mL-eindeoplossing voor toevoegen aan elk putje. Passeren cellen door de dezelfde 40 µm cel zeef voor het bundelen van alle aanhanger en niet-aanhanger cellen samen. Spin bij 330 x g gedurende 5 min.
    1. Om te beoordelen van het potentieel van de CFC van deze bulk-cultuur, gaat u verder met sectie 6.
  6. Wassen van de cellen tweemaal in FACS buffer. Spin bij 330 x g gedurende 5 min.
  7. Resuspendeer de cellen in FACS buffer bij 5 x 10 6 cellen/mL. Vlekken van de cellen met anti-CD45 en anti-CD34 antilichamen voor 30 min op ijs in het donker (gesuggereerd fluorophores zijn in de Tabel van de materialen).
  8. Wassen de cellen tweemaal in FACS buffer. Spin bij 330 x g gedurende 5 min.
  9. Isoleren de CD34 + CD45 + cellen door FACS ( 2E figuur). Sorteren van de cellen in gekoeld FACS buffer.
  10. Beoordelen de definitieve CD34 + CD45 + hematopoietische progenitorcellen als nodig (CFC assay in sectie 6, lymfoïde potentieel in sectie 7, of een andere onderzoeker-geïnitieerd assay).

6. CFC Assay

  1. ontdooien aliquots van MeC voor elk monster die gebruikt voor de CFC-assay.
  2. De cellen om te worden getest (stappen 4.5, 4.7, 5.5 of 5,9) in MeC toevoegen. Vortex grondig en laat de MeC culturen staan gedurende 5-10 minuten totdat een eventuele luchtbellen verdrijven, volgens de fabrikant ' s instructies. Met behulp van een 16 ½ meten van de naald op een spuit met 3 mL, verwijder voorzichtig de MeC 2 mL.
    Opmerking: Typische plating dichtheden variëren van 1.000-20.000 cellen/mL, afhankelijk van de frequentie van de verwachte voorlopercellen.
  3. Breng zorgvuldig, 1 mL MeC cel mengsel in elk van de twee 35 mm weefselkweek gerechten. Verdeel de MeC in de 35 mm-gerechten door zachtjes te tikken en draaien van de schotel. Plaats elk van de bovenstaande gerechten in een 15 cm weefselkweek schotel gevuld met water. Incubeer in een incubator 37 ° C 5% CO 2.
  4. Visualiseren de MeC culturen met behulp van een lichte Microscoop met behulp van 40 X vergroting. Kwantificeren van de verschillende CFK's verkregen. Het analyseren van de primitieve CFC-assays 8-10 dagen na plating ( figuur 2C). Analyseer de definitieve CFC testen 14 dagen na de beplating. Representatieve CFC assay kolonie morphologies kunnen worden gezien in figuur 2F.

7. T Cell Assay te stellen definitieve hematopoietische potentiële

  1. groeien de OP9-DL4 cellen tot heuvels in een 100 mm weefselkweek schotel 30 , 31 , 32.
    1. dooi de OP9-DL4 cellen 72-96 uur voorafgaand aan de T cel assays plating. Resuspendeer de cellen OP9-DL4 10 ml OP9 media en afzien in een 10 cm plaat. Groeien in een 37 ° C 5% CO 2 incubator tot 70-90% heuvels.
    2. Om te oogsten van de cellen OP9-DL4 van een schotel van 100 mm, verwijder het medium en voeg 5 mL 0,25% trypsine-EDTA voor 5 min. stoppen de trypsine-activiteit met 5 mL OP9 media. Draai de cellen bij 330 x g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in 1 mL OP9 media en cellen tellen.
      Opmerking: Ene 10 cm plaat van confluente OP9-DL4 cellen zal opleveren ongeveer 10 x 10 6 OP9-DL4 cellen.
    3. 48 uur voorafgaand aan de T cel assay, plaat 2 x 10 6 cellen in 12 mL OP9 media in een 24-well schotel (0,5 mL per putje). Groeien in een incubator 37 ° C 5% CO 2.
  2. 2.000-10.000 cellen te worden bepaald (zoals verkregen in stappen 4.5, 4.7, 5.5 of 5,9) toevoegen aan 1 goed van OP9-DL4 cellen in OP9 media aangevuld met: 30 ng/mL SCF (eerste 6 dagen), 5 ng/mL IL-7 en 5 ng/mL FLT3-L. broeden in een 37 ° C 5% CO 2 inc ubator. Geen media-wijzigingen optreden bij deze stap.
  3. Elke 4 - 5 dagen, passage de T cel progenitoren op verse OP9-DL4 stromale cellen in een 6-well schotel. Triturate van de cellen met een pipet 1 mL en passeren een 40 µm filter te verwijderen van de bosjes. Spin bij 330 x g gedurende 5 min. Aspirate uit de media. Resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver vers OP9 media aangevuld met 5 ng/mL IL-7 en 5 ng/mL Flt3-L en op verse OP9-DL4 cellen.
    Opmerking: 48u vóór passaging, 2 x 10 6 vers OP9-DL4 cellen in 12 mL OP9 media plaat, en 2 mL/putje te verdelen over 6-well gerechten.
  4. Triturate na ten minste 21 dagen van co cultuur, de cellen krachtig en passeren een filter van 40 µm cel puin te verwijderen. Draai bij 330 x g gedurende 5 min en gecombineerd het supernatant.
  5. Wassen de cellen tweemaal in koude FACS buffer. Spin bij 330 x g gedurende 5 min.
  6. Resuspendeer de cellen in FACS buffer bij 5 x 10 6 cellen/mL. De cellen van de vlek met anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 en anti-CD8 antilichamen voor 30 min op ijs in het donker (voorgestelde fluorophore combinaties in de Tabel van de materialen zijn). Een leven/dood cel vlek (DAPI, enz.) als u wilt verwijderen van puin uit de analyse van de toepassing.
  7. Wassen de cellen tweemaal in FACS buffer. Spin bij 330 x g gedurende 5 min.
  8. Analyseren van de cellen met behulp van een cytometer van de stroom te beoordelen van de aanwezigheid van T-lymfocyten progenitoren ( Figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische voorstelling afgebeeld van de inductie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van hPSCs wordt geïllustreerd in Figuur 1. Mesoderm patronen door canonieke WNT signalering optreedt gedurende 2-3 dagen van differentiatie, gevolgd door hematopoïetische voorlopercellen specificatie.

Representatieve flow cytometrische analyse en kolonievormende methylcellulose tes...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt een snelle serumvrij, stroma-vrije methode voor de differentiatie van primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen beschreven. Mesodermal specificatie van primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen kan op betrouwbare wijze worden bereikt met behulp van onze protocol, dat een unieke klein molecuul remmers van het canonieke WNT signalering exploiteert. Fase-specifieke WNT activering door de GSK3β-remmer CHIR9902133 geeft aanleiding tot definitieve h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Department of Internal Medicine, divisie van hematologie, Washington University School of Medicine. CD werd gesteund door T32HL007088 van het nationale hart-, Long- en bloed Instituut. CMS werd gesteund door een American Society of Hematology Scholar Award.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell ratedGemini Bioproducts100-500
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30396.03
L-glutamine, 200 mM solutionLife Technologies25030-081
Penicillin-streptomycinLife Technologies15070-063
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200056
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300054
Gelatin, porcine skin, Type ASigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
Knock-out serum replacementLife Technologies10828028"KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA)Life Technologies11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solutionLife Technologies21985023
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
Fraction V, Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 supplementLife Technologies17502048
B27 supplement, no vitamin ALife Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
Growth factor reduced MatrigelCorning354230"MAT"
L-absorbic acidSigma-AldrichA4403
Human serum transferrinSigma-Aldrich10652202001
Monothioglycerol (MTG)Sigma-AldrichM6145
Collagenase BRoche11088831001
Collagenase IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
Phosphate Buffered Saline (PBS)Life Technologies14190144
bFGFR&D Systems233-FB
BMP4R&D Systems314-BP
Activin AR&D Systems338-AC
VEGFR&D Systems293-VE
SCFR&D Systems255-SC
IGF-1R&D Systems291-G1
IL-3R&D Systems203-IL
IL-6R&D Systems206-IL
IL-7R&D Systems207-IL
IL-11R&D Systems218-1L
TPOR&D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L)R&D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4BD Biosciences560650Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8BD Biosciences561950Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12BD Biosciences340441Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12BD Biosciences348801Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10BD Biosciences555475Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1BD Biosciences557833Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1BD Biosciences642284Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159BD Biosciences555518Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2BD Biosciences550257Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5BD Biosciences555976Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)BD Biosciences564907Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cellsHolmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q water purification systemEMD Millipore
5% CO2 incubatorSet at 37 C
Multigas incubatorSet at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plateCorning353046
24 well tissue culture plateCorning353226
6 well low-adherence tissue culture plateCorning3471
24 well low-adherence tissue culture plateCorning3473
35 mm tissue culture dishesCorning353001
Blunt-end needle, 16 gaugeCorning305198
3 cc syringesCorning309657
5 mL polypropylene test tubeCorning352063

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vorming van embryonale lichamenmesodermspecificatieGSK3 remmerPORCN remmerVEGF behandelingFACS isolatieflowcytometrie

Gerelateerde artikelen