Methodenartikel

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

DOI:

10.3791/55199

⸱

10 maart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Molecular Biology Program, Université de Montréal

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-throughput screening (HTS) is momenteel de steunpilaar voor de identificatie van chemische entiteiten kan moduleren biochemische reacties of cellulaire processen. Met de vooruitgang van biotechnologie en de hoge translationele potentieel van kleine moleculen, een aantal innovatieve benaderingen geneesmiddelen hebben ontwikkeld, waarbij de oplevende belangstelling voor het gebruik van HTS verklaart. De oncologie veld is op dit moment de meest actieve onderzoeksgebied voor drug discovery, zonder belangrijke doorbraak voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen targeting-transplantatie gerelateerde complicaties of auto-immune aandoeningen. Hier presenteren we een nieuwe in vitro muizen-fluorescentie gebaseerde assay lymfocyt gemakkelijk worden aangepast voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen. Deze test maakt gebruik van T- of B-cellen afkomstig van een transgene muis waarin het Nur77 promotor drijft GFP expressie na T- of B-celreceptor stimulatie. Aangezien de GFP intensiteit weerspiegelt deactivatie / transcriptionele activiteit van de doelcel, onze assay bepaalt een nieuw hulpmiddel om het effect van bepaalde verbinding (en) aan cellulaire / biologische reacties bestuderen. Zo werd een primaire screening uitgevoerd onder gebruikmaking 4398 verbindingen in afwezigheid van een "target hypothese", die leidde tot de identificatie van mogelijke treffers 160 tonen immunomodulerende activiteiten. Zo is het gebruik van deze test is geschikt voor drug discovery programma verkennen grote chemische libraries voorafgaand aan in vitro / in vivo studies verder valideren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High throughput screening (HTS) is een bewezen strategie voor de identificatie van nieuwe therapeutische moleculen of herpositionering van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen in nieuwe medische indicaties ingeburgerd. 1 nu toe, kan de bereikte HTS succes worden gemeten door de overvloed van eerder ontdekte drugs. Bijvoorbeeld de tyrosine kinase inhibitor lapatinib gebruikt voor de behandeling van borstkanker, sitagliptine; een dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) -remmer gebruikt als een anti-hyperglycemische drugs, en de orale Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitor dasatinib gebruikt voor de behandeling van chronische myelogene leukemie geven enkele voorbeelden van een lange lijst van goedgekeurde geneesmiddelen oorspronkelijk ontdekt door HTS. 2 Hoewel de productiviteit van de farmaceutische industrie onlangs heeft last van een gebrek in de ontdekking van nieuwe chemische entiteiten, de kans op een succesvolle geneesmiddelen kan worden verbeterd door een toename van het aantal pre-klinische candidates weergeven van modulerende biologische / biochemische eigenschappen. Bijgevolg kan de ontwikkeling van nieuwe assays HTS aangepast voor fenotypische screening potentieel belangrijke farmacologische instrumenten verschaffen voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen treffers bieden. 3, 4, 5, 6 Verder kunnen HTS nu worden uitgevoerd in een sneller tempo door belangrijke technologische veranderingen in de afgelopen jaren ook op maat gemaakte flexibele robot installaties nieuwe uitlezing technologieën of omvangrijke miniaturisatie. 2, 7 Onder de factoren die bijdragen aan de groeiende belangstelling voor het gebruik van fenotypische screening (aka forward farmacologie) is de perceptie dat het focussen op de functionele gevolgen in plaats van ongenuanceerd reductionistische aannames ten aanzien van moleculaire doelwitten (target-based screening / biochemische reacties) is de kans groter naar sho w klinische werkzaamheid. Zo fenotypische screening houdt de belofte om nieuwe potentiële therapeutische verbindingen en moleculaire wegen van nog onbehandelbare ziekten bloot te leggen. 2

Goed remmers of activatoren voor een gegeven doelwit of celfunctie te identificeren, is een zeer gevoelige en betrouwbare test nodig om onderscheid te maken tussen bonafide klappen en valse positieven. Dus, wat maakt een goede test? De kwaliteit van een gegeven test moet eerst worden beoordeeld door de signaal-ruisverhouding (weerspiegeld door een Z-factor). 8 Ten tweede moet het gerichte effect of het doel van het scherm duidelijk worden vastgesteld. Zo kunnen functionele celtechnieken belangrijke voordelen voor screening receptor in tegenstelling tot een assay specifiek ontworpen om ligand-receptorbinding te bepalen. De reden hiervoor is dat de laatste benadering niet kan maken tussen agonist en antagonist liganden.ss = "xref"> 9 daarentegen een celgebaseerde aanpak waarschijnlijk effectiever receptorfunctie direct kan worden beoordeeld in een biologisch fenotype te zijn (proliferatie, stoppen van de celcyclus, apoptose en / of differentiatie). Wel moet worden opgemerkt dat biochemische assays belangrijke voordelen kan bieden via fenotypische testen zoals inbreuk maken op een specifieke intracellulaire doelwit. Een goed geoptimaliseerde biochemische assay zullen over het algemeen minder gegevens scatter dan een fenotypische screening en vereenvoudigt nadien onderzoeken die op de drug moleculaire werkingsmechanisme. De belangrijkste nadeel van doelgerichte of biochemische assays is de kans op het amplificeren van het aantal valse positieve hits die aspecifieke doelen kunnen beïnvloeden wanneer getest in een biologisch systeem (verlies van de specificiteit oorspronkelijk onderzocht in de biochemische assay). 10 Hoewel een gevestigde cut-off point tussen negatieve en positieve treffers het aantal valse positieven te minimaliseren in de primaire screening, het gebruik van een fysiologisch relevante systeem nabootsen van de natuurlijke cellulaire omgeving zoals intacte cellen, weefsels of hele hele dier blijft de kern van het testontwerp slinger. Daarom fenotypische screening maakt lead discovery met gewenste biologische / fenotypische effecten op ziekten zonder geïdentificeerde drug targets zonder voorafgaande kennis van activiteiten of wijze van optreden van de verbinding. 11

De hierin studie heeft betrekking op de ontwikkeling en het testen van een geoptimaliseerd en reproduceerbare fenotypische screening op basis van twee belangrijke componenten: een in de handel verkrijgbaar muismodel en een geclusterde sub-familie van chemische verbindingen. Wat het diermodel, de assay berust op het gebruik van lymfocyten afgeleid van een muizenstam (Nur77 GFP) herbergt een bacterieel kunstmatig chromosoom bevat een cassette waarin de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) wordt aangedreven door The Nur77 promotor. 12 Het kenmerk van deze stimulering is gebaseerd op het feit dat Nur77 een directe vroege gen opgereguleerd na T-celreceptor (TCR) of B-cel receptor (BCR) stimulatie. 12 Wat betreft de werkwijze het screenen zelf, is een aanpak om het vermijden van de screening van triviale analogen tegelijk de tijd die nodig is om een grote chemische library (> 10 5 verbindingen) te beoordelen. Om dit te doen, een database van chemische verbindingen geselecteerd door geneesmiddelen chemici gebruik van virtuele screening instrumenten werd benut om topologisch soortgelijke verbindingen met behulp van bekende actieve zaad structuren als verwijzingen te identificeren. Deze aanpak liet ons toe om te screenen 4398 verbindingen waarmee een totaalbedrag bibliotheek van meer dan 136.000 chemische entiteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Montreal. De muizen werden gedood door een geleidelijke inademing van CO 2 tot er geen vitale functies waargenomen gevolgd werden door cervicale dislocatie. De procedure werd uitgevoerd door een gecertificeerd persoon uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de dieren werden gedood op een humane manier en op basis van de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care.

1. Bereiding van splenocyten Medium en Flow-cytometrie Buffer

  1. Voer alle stappen in het kader van een 70% ethanol-gereinigd biologische capuchon.
  2. Verwijder 70 ml voorverwarmde Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium (in de handel verkrijgbaar en in gefilterd 500 ml volume steriele flessen meegeleverd) en plaats in een steriele buis. Het verwijderde medium zal later worden gebruikt in het protocol.
  3. Supplement de resterende 430 ml RPMI 1640 met 1 x 50 ml geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 5 ml penicilline / streptomycine, 5mL HEPES, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natriumpyruvaat en 0,05 ml gefiltreerd (1M) 2-mercaptoethanol.
    OPMERKING: Pre-warm splenocyten medium met behulp van een waterbad ingesteld op 37 ºC tot warmte schokkend cellen te voorkomen. Dit is belangrijk voor inductie van cellulaire apoptose voorkomen.
  4. Om de stroom-cytometrie buffer te bereiden, voeg 2 ml FBS tot 98 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en koel bewaren tot gebruik (bij voorkeur binnen drie dagen).

2. Genereren van splenocyten Cell Suspension uit Nur77 GFP muizenmilten

  1. Een septically de milt uit een 6-8 weken oude vrouwelijke Nur77 GFP muis isoleren.
    1. Hiervoor werken onder steriele kap. Week de opgeofferd muis vacht, schaar en pincet in 70% ethanol.
    2. Leg de muis op zijn rechterzijde, snijd de huid en de spieren in de linkerbovenhoek buik kwadrant. Inspecteer de incisie gebied om zichtbaar te lokaliseren de milt en snijd het uit. Houd de miltin splenocyten medium op ijs pas klaar om de volgende stap uit te voeren.
  2. Plaats de milt (en) in een 10 cm 2 celkweek petrischaaltje met 5 ml voorverwarmd medium splenocyten.
  3. Wrijf de milt met behulp van een steriele injectiespuit zuiger totdat de oplossing troebel. Een milt collageenmatrix moet tegen het einde van de procedure blijven.
  4. Na een uitgebreide pureren in splenocyten medium, het verzamelen van de celsuspensie en geef het door een 70 um cel zeef geplaatst op een 50 ml buis te filteren-out vuil of stolsels.
  5. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Na het weggooien van het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 2-3 ml in-house geproduceerde of commercieel van rode bloedcellen lysisbuffer. Na pipetteren (2-3 keer) laat de schorsing rust voor 20-30 s.
  6. Voeg 5 ml PBS buffer of een geschikte keuze centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g.
  7. Verwijder de bovenstaande vloeistof (moet rood van kleur zijn, want het bevat gelyseerde rode blood-cellen) en resuspendeer de cel pellet in 2 ml splenocyten medium.
  8. Met behulp van een hemocytometer, tel het aantal cellen gekleurd met trypan blauw te maken tussen levende en dode (necrotische) cellen.

3. T-cel Isolatie van de splenocyten Cell Suspension

  1. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g. Resuspendeer de cellen in serumvrij RPMI-medium (50 ml van stap 1,3) tot een cellulaire concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml te verkrijgen.
  2. Overdracht van de cellen naar een 5 ml polystyreen buis en de vernietiging van een 100 ul aliquot van splenocyten zuiverheid beoordeling / vergelijking aan het einde van de zuiveringsstap.
  3. Voeg normaal rattenserum aan de celsuspensie bij 50 ul / ml gevolgd door T celisolatie antilichaam cocktail (50 ul / ml).
  4. Meng de celsuspensie en laat het rusten voor 10 min. Deze stap maakt het antilichaam cocktail om alle ongewenste cellen te binden.
  5. Voeg de streptavidine snelle sferen (magneetic korrels) gedurende 2,5 min, breng dan het volume op 2,5 ml met de serumvrije medium.
  6. Plaats de buis in een celisolatie magneet voor 3 minuten.
  7. Breng de T-cel suspensie in een nieuwe polystyreen buis door het houden van de magneet en uitgieten van de oplossing in één beweging.
    OPMERKING: De geïsoleerde suspensie bevat het gezuiverde T-cellen. Alle ongewenste cellen worden gehouden op de zijkant van de buis gebonden aan de magnetische streptavidine beads.
  8. Tel de geïsoleerde T-cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer.
    OPMERKING: Bij deze stap de zuiverheid van de geïsoleerde T-cellen (optioneel) kan worden gecontroleerd door analyse van het percentage van CD3 + gebeurtenissen voor en na T cel isolatie door flow-cytometrie. 13
    1. Kort Centrifugeer 1 ml splenocyten celsuspensie bij 500 x g. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen in stromingscytometrie buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
    2. Voeg fluorescent-gelabelde anti-mouse CD3 antilichaam bij een concentratie van 1: 100. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was eenmaal, centrifuge en resuspendeer in flow-cytometrie buffer (400 ul) voor analyse door middel van flow-cytometrie.

4. B-cel Isolatie van de splenocyten Cell Suspension

  1. Volgen hetzelfde protocol als beschreven voor T-cellen (stappen 3.1-3.8) maar met gebruik van een B-cel isolatiekit. Voor de beoordeling zuiverheid, gebruik maken van de CD19 antilichaam in plaats van de CD3 antilichaam. 13
    1. Voor de beoordeling zuiverheid (optioneel), gebruik maken van de CD19 antilichaam in plaats van de CD3 antilichaam. Centrifuge 1 ml splenocyten celsuspensie bij 500 x g. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen in stromingscytometrie buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
    2. add fluorescent gelabeld anti-muis CD19 antilichaam bij een concentratie van 1: 100 en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was eenmaal, centrifuge en resuspendeer in flow-cytometrie buffer (400 ul) for analyse door middel van flow-cytometrie.

5. T-cel activatie en de inductie van GFP expressie

  1. Zaad de T-cellen, in suspensie, in een ronde bodem 96-well plaat bij een concentratie van 2,5 x 10 5 cellen / putje.
  2. Voeg recombinant interleukine (IL) -7 bij 2 ng / ml en CD3 / CD28 magnetische parels (25 ui / 10 6 cellen). Houd een gedeelte van de T-cellen behandeld met kralen te dienen als een negatieve controle voor latere metingen die niet-geactiveerde T-cellen vertegenwoordigen.
  3. Twaalf uur later, oogsten de T-cellen van de 96-well plaat door voorzichtig pipetteren de celsuspensie in elk putje en neer elke hiel-cel complex / aggregaten breken. Verzamel de opschorting van alle putjes in een 5 ml polystyreen buis.
  4. De buis wordt met de suspensie in de eerder voor zuivering van T- of B-cellen hetzelfde celisolatie magneet en laat het rusten gedurende 5 min.
  5. Breng de celsuspensie T into een nieuwe polystyreen buis door het houden van de magneet en uitgieten van de oplossing in één beweging.
  6. Centrifugeer de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in splenocyten vers medium tot een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml te krijgen.
  7. Beoordelen van GFP expressie intensiteit door flow-cytometrie (optioneel voor kwaliteitscontrole) op 12 tot 24 uur na de stimulatie in vergelijking met niet-geactiveerde T-cellen. 12
    NB: De GFP-fluorescentie is inherent aan de Nur77 GFP T-cellen en manifesteert zich na succesvolle activering van de TCR. 12
  8. Voor de beoordeling van de levensvatbaarheid en activering (optioneel) van microscopie, vlekken op de geactiveerde cellen met Hoechst 30 minuten vóór de analyse bij een concentratie van 0,2 ug / ml. Voeg voldoende volume van de celsuspensie om een ​​cover dia of een putje van een vlakke bodem zwart-zijdige 384-wells plaat en onderzoek onder de fluorescentie microscoop om levende cellen te beoordelen. Dode cellen zal niet nucleaire behoudenkleuring. 14

6. B-cel activatie en de inductie van GFP expressie

  1. Gebruik een kolf T-25, resuspendeer de geïsoleerde B-cellen in 1 x 10 6 cellen / ml.
  2. Add anti-muis IgG / IgM (H + L) bij 10 ul / ml en recombinant CD40L bij een concentratie van 200 ng / mL. Houd een deel van de B-cellen onbehandeld om te dienen als een negatieve controle voor latere metingen (die niet-geactiveerde B-cellen).
  3. Beoordelen intensiteit GFP expressie door flow-cytometrie op 12 of 24 uur na stimulatie in vergelijking met niet-geactiveerde B-cellen.
    LET OP: De GFP-fluorescentie is inherent aan de Nur77 GFP B-cellen en manifesteert zich na succesvolle activering van de BCR. 12
  4. Voor de beoordeling van de levensvatbaarheid en activering (optioneel) van microscopie, vlekken op de geactiveerde cellen met Hoechst 30 minuten vóór de analyse bij een concentratie van 0,2 ug / ml. Voeg voldoende volume van de celsuspensieeen cover dia of een putje van een vlakke bodem zwart-zijdige 384-wells plaat en onderzoeken in het kader van een fluorescentie microscoop om levende cellen te beoordelen. Dode cellen nucleaire kleuring handhaven. 14

7. high throughput screening van kleine moleculen

  1. Bereid een celsuspensie van 2 x 10 6 cellen / ml van de geactiveerde T- of B-cellen (magnetische korrels of antilichamen / CD40L) of niet-geactiveerde groepen.
  2. Plaat 75.000 cellen / putje in een 384-well plaat (volume van 40 ui). Gebruik een platte bodem zwart-zijdige 384-well plaat of een microscoop dekking glijbaan voor de levensvatbaarheid en activering beoordeling door fluorescentie microscopie (optioneel kwaliteitscontrole stap voorafgaand aan de HTS) met behulp van Hoechst vlek (zie stap 5.8 en 6.4 voor details). 14
  3. Handmatig of met een geautomatiseerd systeem, om de geneesmiddelen van keuze (opgelost in 0,5% DMSO) aan elke well.
  4. Voeg de drager (DMSO) positieve (geactiveerd) en negatieve (non-actiactiveerd) controleputjes. Passen DMSO concentratie tot maximaal 0,5%.
  5. Incubeer de platen gedurende 24 uur (of incubatietijd keuze) bij 37 ° C en 5% CO2.
  6. Op de dag van de screening verdunnen Hoechst 33342 vlek oplossing (1:. 3333, voor bijvoorbeeld voeg 10 ul aan de cellen in 384 putjes met een totaal volume 50 uL genereren). Vlek 30 min voor GFP analyse door toevoeging Hoechst oplossing tot een concentratie van 0,2 ug / ml te bereiken.
  7. Voorzichtig pipet de cellen op en neer om een ​​homogene verdeling in elke krijgen ook.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk bij het afgeven van geneesmiddelen (stap 7,3) onder toepassing van een geautomatiseerd systeem zoals de cellen hopen zich aan één zijde van de put, tegengesteld aan de richting van de stroming.
  8. Spin de platen bij 45 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Laat de platen rusten gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Voer plaat (s) read-outs, met behulp van de geautomatiseerde confocale hoge gehalte scresterking (HCS) -systeem. 15 Laad de plaat aan de machine. Stel de doelstelling op 40X of hogere vergroting. Gebruik camera # 4 voor Hoechst (UV-lamp) en camera # 1 voor GFP (laser 488). Stel de machine 6-10 velden per goed te lezen. Stel de machine tot twee opeenvolgende metingen per gebied te doen bij 488 nm (te lezen GFP) en UV-licht (te lezen Hoechst). Stel de doelstelling op 40X of hogere vergroting.
    NB: Het systeem is een geautomatiseerde microscoop die aanpassingen niet vereist. De brandpuntsafstand, de intensiteit van het invallende licht en de blootstellingsduur worden allemaal automatisch door de machine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontwerp van de HTS assay

Twee belangrijke factoren rekening gehouden bij het ontwerpen van de hierin fluorescentie. Eerst moesten we een fysiologische aandoening waarbij T- of B-celactivering een aandoening (bijvoorbeeld graft-versus-host ziekte) zou betekenen repliceren. Ten tweede moet de beoordeling van cellulaire activering worden uitgevoerd met een gevoelige en kwantitatieve methode. Fluorescentie is tegenwoordi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verscheidene uitlezing werkwijzen zijn gebruikt voor de ontwikkeling van gevoelige en betrouwbare HTS assays. Deze omvatten colorimetrische, lichtgevende of fluorescerende methoden. Hoewel colorimetrische methoden zijn eenvoudig te installeren, ze vereisen meerdere toevoegingen van chemicaliën die kunnen interfereren of verstoren van de cellen getest. 23 Verder zij geen dynamische beoordeling van een biologische respons mogelijk de farmacologische werking wordt gesteld op een specifiek eindpunt. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Merck Frosst Start-up middelen die door Universiteit van Montreal. We danken Drs Jean Duchaine en Dominic Salois van de High-throughput platform aan het Instituut voor Onderzoek in de Immunologie en Kanker voor hun discussie, commentaar en feedback. Moutih Rafei houdt een Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Nur77GFP muizenThe Jackson LaboratoryMuisensoort nr. 016617Er werd een eigen kolonie opgezet in onze dierenfaciliteit 
96 wells-U kweekplaten, sterieelVWR International10062-902T-cel activering met behulp van magnetische kralen
70 µm celzeef, sterieelCorning Inc.352350Generatie van splenocyten celsuspensie
5 ml polystyreen buisjes met ronde bodem, sterieelCorning Inc.352058Generatie van splenocyten celsuspensie
50 ml polypropyleen buisjes met kegelvormige bodem, sterieelVWR International89039-656 Generatie van splenocyten celsuspensie
10 ml spuit zonder naald, sterieelBecton, Dickinson and Company305482Om de milt te pletten
T-25 kweekflaconGreiner Bio-One690 175Om B-cellen tijdens activering te incuberen
5 ml celkweekschaal, sterieelGreiner Bio-One627 160Om de milt te pletten
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)WISENT Inc.450-200-EL  Onderdeel van het splenocyt medium
RPMI 1600 met natriumbicarbonaat en L-glutamineWISENT Inc.350-002-CL Onderdeel van het splenocyt medium
MEM niet-essentiële aminozurenWISENT Inc.321-010-EL Onderdeel van het splenocyt medium
HEPES vrije zuur 1 MWISENT Inc.330-050-EL Onderdeel van het splenocyt medium
Natriumpyruvaat oplossing (100mM)WISENT Inc.600-110-EL Onderdeel van het splenocyt medium
Foetaal bovien serum (FBS) WISENT Inc.080-910 Onderdeel van het splenocyt medium en flowcytometrie buffer
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)WISENT Inc.311-010-CLOnderdeel van flowcytometrie buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023Onderdeel van het splenocyt medium
T-Cellen isolatiekitStemcell Technologies19851Om T-cellen te isoleren
B-Cellen isolatiekitStemcell Technologies19854Om B-cellen te isoleren
Muis T-Activator CD3/CD28 superparamagnetische kralenThermo Fisher Scientific11452DOm T-cellen te activeren 
Celisolatie magneetStemcell Technologies18000Om T-cellen te isoleren en de magnetische kralen te verwijderen 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068Om B-cellen te stimuleren
Recombinant Murine IL-7Peprotech217-17 Om T-cel overleving tijdens activering te ondersteunen
Recombinant CD40LR&D Systems8230-CL/CFOm B-cellen te stimuleren
Anti-muis CD3 antilichaamBD Pharmingen561799Om T-cellen te kleuren voor flow-cytometrie
Anti-muis CD19 antilichaamBD Pharmingen553786Om B-cellen te kleuren voor flow-cytometrie
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A31842Om cellen na 24 uur incubatie opnieuw te suspenderen
Opera Phenix High Content Screening SystemPerkinElmer Inc.HH14000000Om GFP/Hoechst signaal te analyseren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735(2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

T Cell IsolationB Cell IsolationNur77 GFP MouseMagnetic Bead SeparationGFP Expression AnalysisSmall Molecule ScreeningImmunomodulatory Compound IdentificationCell Culture Incubation

Gerelateerde artikelen