Restenosis na cardiovasculaire procedures (bypass operatie, angioplastie of stenting) is een significant probleem waardoor de duurzaamheid van deze procedures wordt verminderd. Een ideale therapie zou de proliferatie van gladde spiercellen (VSMC) verhinderen, terwijl het bevorderen van regeneratie van het endothelium. We beschrijven een model voor gelijktijdige beoordeling van VSMC proliferatie en endotheliale functie in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Murine Aortic Crush Injury: Een Efficiënt
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Arteriële reconstructie, ofwel angioplastiek of bypass-operatie, omvat iatrogene trauma waardoor endotheliale verstoring en vasculaire gladde spiercellen (VSMC) proliferatie veroorzaakt worden. Gemeenschappelijke muizenmodellen bestuderen kleine vaten, zoals de carotis- en femorale slagaders. Hierin beschrijven we een in vivo systeem waarin zowel VSMC proliferatie als endotheliale barrière functie gelijktijdig in een groot vat kunnen worden beoordeeld. We bestudeerden het infrarenale aorta respons op letsel in C57BL / 6 muizen. De aorta werd gewond van de linker nierader naar de aorta bifurcatie door 30 transmurale verpletteringen van 5 seconden duur met een katoenstippel applicator. Morfologische veranderingen werden beoordeeld met conventionele histologie. Aorta wanddikte werd gemeten van het luminale oppervlak naar de adventitia. EdU-integratie en tellerverf met DAPI en alfa-actine werd gebruikt om VSMC proliferatie te demonstreren. Activatie van ERK1 / 2, een bekende moderator van intimale hyperplasievorming, was afschrikkelijkOntgonnen door Western Blot analyse. Het effect van ontsteking werd bepaald door immunohistochemie voor B-cellen, T-cellen en macrofagen . En gezichtsafdelingen van endothelium werden gesynchroniseerd met scan-elektronenmicroscopie (SEM). Endotheliale barriere functie werd bepaald met Evans Blue staining. Transmurale letsel leidde tot verdikking van de aorta wand. Deze verwonding veroorzaakte VSMC proliferatie, meest prominente bij 3 dagen na verwonding, en vroege activatie van ERK1 / 2 en verminderde p27 kip1 expressie. Schade leidde niet tot verhoogde B-cellen, T-cellen, of macrofagen infiltratie in de vat van het vat. Schade veroorzaakte deelement van de endotheliale cel en verlies van cel-celcontact. Schade resulteerde in een significant verlies van de endotheliale barrière functie, die na zeven dagen terug naar de basislijn kwam. Het murine transmurale stomp aorta schade model biedt een efficiënt systeem om zowel VSMC proliferatie als endotheliale barrière functie in een groot vat te bestuderen.
Inleiding
restenose Volgende cardiovasculaire procedures (bypass operatie, angioplastie of stenting) is een significant probleem waardoor de duurzaamheid van deze procedures wordt verminderd. Alle revascularisatieprocedures worden geplaagd door restenose. Huidige strategieën ter voorkoming van restenose (drug-eluerende stents en geneesmiddelcoated ballonnen) remmen zowel vasculaire gladde spiercellen (VSMC) en endotheliale cel proliferatie (EC). Bijgevolg voorkomen deze interventies VSMC gemedieerde restenose, maar voorkomen ook de regeneratie van het endothelium. Zonder een intact endothelium, zijn patiënten verplicht te zijn op krachtige antiplatelet middelen om het risico op in situ trombose te verminderen met het risico op bloedingen complicaties. Een ideale therapie zou VSMC proliferatie remmen, terwijl het bevorderen van de regeneratie van het endothelium. Zo is er een noodzaak om tegelijkertijd de VSMC proliferatie- en endotheliale barrièrefunctie in n vivo te bestuderen.
Momenteel zijn er ernstigeAl muismodellen van restenose 1 . Deze modellen omvatten carotid ligatie en femorale arterie draad verwonding 2 . Aortische modellen omvatten stentplaatsing 3 , ballonbesering 4 en aorta-allograft 5 . Alle huidige modellen zijn beperkt. Carotidligatie genereert een doorstroming gemedieerde neointimale laesie en heeft geen endotheel letsel. Bovendien hebben zowel carotide- als femorale slagaders veel vallen minder cellagen dan menselijke vaten, waardoor hun translatiewaarde wordt beperkt. De aorta van de muis die ongeveer 1,3 mm in diameter is, is het enige vat dat een klinisch relevante (coronaire) menselijke slagader benadert (3).
Ondanks het translatiepotentiaal van muizen aorta modellen van ziekte, hebben huidige modellen beperkingen. Deze modellen vereisen geavanceerde microchirurgische vaardigheden en gespecialiseerde apparatuur zoals angioplastiekballonnen en stents. Hierin presenteren weEen nieuwe, reproduceerbare techniek om tegelijkertijd VSMC proliferatie te induceren en endotheliale barrièrefunctie te verstoren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Etiekverklaring: De protocollen voor dierhantering werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Maryland (protocol nummer 0416009) en uitgevoerd volgens de AAALAC-internationale normen.
1. Chirurgische procedure
- Anesthetische techniek
- Steriliseer alle instrumenten die worden gebruikt in overlevingskirurgie met stoomsterilisatie bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
- Anesthesie via een inductietank met 100% O2 en 2,5% isofluraan afgeven via precisieverdamper. Na inductie, stop de isofluraan en spoel de kamer met O2. Anesthesie onderhouden met 1,5-2% isofluraan via gezichtsmasker en 1 L / min O 2 bij inademing.
- Bevestig zowel de inductiekamer als het gezichtsmasker aan een houtskoolafscheider voor afzuigafzetting om personeel te beschermen. Zorg voor een adequaat verdovingsplan door demonstratieDaarbij is er geen reactie op schadelijke stimuli (toe knijp).
- Creëer een operatief veld bestaande uit een chirurgische dienblad met isothermisch pad om thermische ondersteuning tijdens de operatie te verschaffen. Een extra isothermisch pad zorgt voor thermische ondersteuning voor dieren in hun herstelkooi.
- Dierlijke bereiding
- Voer het volgende onderzoek uit op 10-12 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen.
- Verwijder het haar op het ventrale buikoppervlak van het dier van het baarmoeder naar het inguinale gebied met een depilator of een elektrische klipper met een nummer 40 blad.
- In geval van depilatory agent, voeg deze verbinding toe op het chirurgische gebied gedurende 2-3 minuten en verwijder het dan met katoen. We gebruiken een in de handel verkrijgbare verbinding van calciumhydroxide en natriumhydroxide.
- Prep het gebied over de schouder met 70% alcohol en injecteer carprofen (5 mg / kg) subcutaan met een 25 gauge of kleinere boornaald. DezeDe behandeling zal postoperatieve analgesie voor het dier verschaffen.
- Verplaats het dier naar het chirurgische veld en plaats in dorsale recumbency.
- Bereid de chirurgische plaats door 8-12% providone-jodium te schrobben met een schone katoen applicator of katoen gaas. Spoel vervolgens de huid twee keer met 70% alcohol.
- Plaats oculair smeermiddel in beide ogen om de incidentie van corneale uitdroging te verminderen. Bedek de chirurgische plaats met een steriele draperie.
- Operatieve techniek
- Maak een median buiklaparotomie incisie ongeveer 2-2,5 cm lang met een scalpel begin onmiddellijk caudal het xiphoide proces en uitstrekken naar het bekken.
- Mobiliseer de darm en duodenum en zijwaarts naar rechts. Rol een strook steriele katoen door en bedekt met steriele zoutoplossing voor injectie om de viscera te verpakken om de blootstelling te verbeteren.
- Met de dunne darm gemobiliseerd naar de rechterkant van deBuik, de retroperitoneum blootstellen en de abdominale aorta van de linker nierader naar de aorta bifurcatie blootstellen ( Figuur 1 ).
- Met een steriele katoenen tip applicator, leveren 30 opeenvolgende knuffels, elke vijf seconden in de duur.
- Verwijder de verpakking en laat de viscera terugkeren naar hun oorspronkelijke positie.
- Sluit fascia met een lopende 4-0 absorberende monofilament hechting (polydioxanon). De huid is gesloten met een lopende 6-0 niet-absorbeerbare monofilament hechting (nylon).
- Herstel en post-procedure zorg
- Plaats de dieren in een herstelkooi met schoon beddengoed op een isotermisch pad om de thermische ondersteuning te doorlopen totdat het dier normaal kan ambuleren. Verlaat het dier niet toezicht totdat het het vermogen toont om sternale recumbency te onderhouden.
- Monitor het dier elke uur voor de eerste 4 uur na de operatie. Zodra het dier ambulerend is, ga ik normaal terug T naar de toegewezen boerenkamer. Het dier wordt niet gehuisvest in het gezelschap van een ander dier totdat het volledig is hersteld.
- Monitor het dier tweemaal daags gedurende de eerste 72 uur na de operatie en tenminste 3 keer per week daarna. Monitoring omvat het wegen van het dier drie keer per week.
- Administreer carpofen (5 mg / kg) tweemaal daags subcutaan gedurende de eerste 72 uur na de operatie.
2. Aankoop van Weefsel
- Methode van Euthanasie
- Euthanize de dieren op vooraf bepaalde tijdspunten.
- Anesthesie via een inductietank met 100% O2 en 2,5% isofluraan afgeven via precisieverdamper.
- Om de integriteit van het endothelium te bestuderen, geef Evans Blue kleurstof aan het dier.
OPMERKING: Evans Blue is een negatief geladen azofleurstof met een hoge bindingsaffiniteit voor albumine en kan alleen bloedvaten vinnen in afwezigheid van een intact endotheelS = "xref"> 6. - Voor endothelial integrity studies, op het tijdstip van euthanasie, perfuse de dieren met 5 ml van 0,3% Evans Blue kleurstof gevolgd door 5 mL PBS bij fysiologische druk gedurende 5 min. Het dier wordt gehandhaafd in een chirurgisch vlak van verdoving tijdens de perfusieprocedure.
- Om de integriteit van het endothelium te bestuderen, geef Evans Blue kleurstof aan het dier.
- Na het bereiken van een diep anesthetisch vliegtuig, open de borst met een sternotomie. Maak een laceratie in het rechter atrium om de afvoer van bloed uit het dier mogelijk te maken en toegang tot de linker ventrikel is toegankelijk met een 21 G-naald en injecteer fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot het effluent van het rechter atrium duidelijk is.
- Na perfusie met PBS, ga de buik binnen door middel van een incisie.
- Nogmaals mobiliseer de dunne darm aan de rechterkant van de buik die de infrarenale aorta blootstelt, ontleed de aorta van aangrenzende weefsels en accijns het van de linker nierader naar de aorta bifurcatie.
- Bewaar de uitgesneden aorta in een 4% paraformaalEhydraatoplossing tot weefselverwerking optreedt.
- Voor endotheliale integriteitstudies, open de aorta in de lengterichting en knijp het op een wasblad dat de helft van het luminale oppervlak 6 blootstelt. Voer een kwalitatieve beoordeling van de endotheliale integriteit uit door de mate van kleuring met Evans Blue Dye 6 .
- Voor andere histologische analyses, snijd de aorta dwars door en integreer deze in optimale snijtemperatuur (OCT) verbindingen zoals bepaald door de histologische methode die moet worden gebruikt 7 .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Transversale afdelingen aorta ingebed in OCT werden gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine, vervolgens teller gekleurd met Verhoeff-Van Gieson (VVG) vlek om de interne en externe elastische lamina 7 te identificeren. Crush injury veroorzaakte aorta wandverdikking in vergelijking met de aorta's van dieren die werden behandeld met een sham procedure (alleen laparotomie en kleine darm mobilisatie). De wanddikte, zoals beoordeeld door de afstand van adven...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben de effecten van een muizen aorta verwondingsmodel gekenmerkt, dat resulteert in mediale hyperplasie en endotheliale barriere dysfunctie. Gedeeltelijke EC-detachering langs de aorta-intima leidde tot het verlies van cel-celcontact en het verhogen van celuitstulpingen. Corresponderend was de endotheliale barrièrefunctie significant aangetast, die de mitogeengevoelige signaleringstrajecten stimuleerde, wat leidde tot proliferatie van VSMC's en verdikking van de vatwand. De sterkten van dit model zijn dat het ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Dit werk werd gefinancierd door de afdeling Veterinaire Zaken Carrièreontwikkeling Award (1IK2BX001553-01) (TSM) en de Vasculaire Cures EJ Wylie Scholarship (TSM).
Dankbetuigingen
Wij danken Hsia Ru-ching PhD, van de Electron Microscopy Core Facility van de Universiteit van Maryland School of Medicine, voor haar technische ondersteuning bij het verwerken van de scan elektronische microscopie monsters.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Farmaceutische middelen |
| Isofluraan | VetOne | 502017 | Farmaceutische middelen |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Farmaceutische middelen |
| Precisie verdamper | Summit Medical | 10675 | Chirurgische benodigdheden |
| Houtskoolschotel | Bickford Inc. | 80120 | Chirurgische benodigdheden |
| Isothermale pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Chirurgische benodigdheden |
| Steriele katoenen applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Chirurgische benodigdheden |
| 4-0 absorbeerbare monofilamentnaald | Ethicon, Inc | J310 | Chirurgische benodigdheden |
| 5-0 niet-absorbeerbare monofilamentnaald | Ethicon,Inc | 1666 | Chirurgische benodigdheden |
| 21-gauge x 1 inch naald | BD Biosciences | 305165 | Chirurgische benodigdheden |
| 25-gauge x 1 inch naald | BD Biosciences | 305125 | Chirurgische benodigdheden |
| Droge sterilisator | Cellpoint | 7770 | Chirurgische benodigdheden |
| Fijne schaar | Fine Science Tools | 14058-09 | Chirurgische instrumenten |
| Adsontang | Fine Science Tools | 11006-12 | Chirurgische instrumenten |
| Dumont #5 fijne pincet | Fine Science Tools | 11254-20 | Chirurgische instrumenten |
| Vannas veerscharen 3 mm snijkant | Fine Science Tools | 15000-00 | Chirurgische instrumenten |
| Naaldvoerder | Fine Science Tools | 91201-13 | Chirurgische instrumenten |
| Scalpamel #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Chirurgische instrumenten |
| Scalpamelmesjes #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Chirurgische instrumenten |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagentia voor weefselverwerking |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagentia voor weefselverwerking |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagentia voor weefselverwerking |
| Modelleerwaar | Bego | 40001 | Reagentia voor weefselverwerking |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagentia voor weefselverwerking |
| Mayer's hematoxylinen oplossing | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagentia voor immunohistologische analyse |
| Eosin Y alcoholische oplossing | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagentia voor immunohistologische analyse |
| Elastine kleurstofkit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagentia voor immunohistologische analyse |
| Click-it Edu Alexa-488 Beeldvormingskit | Invitrogen | C10337 | Reagentia voor immunohistologische analyse |
| Anti-Erk1/2 antilichaam | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagentia voor immunohistologische analyse |
| Anti-fosfo-Erk1/2 antilichaam | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagentia voor immunohistologische analyse |
| Anti-p27kip1 antilichaam | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagentia voor immunohistologische analyse |
| Trichloorazijnzuur | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagentia voor immunohistologische analyse |
Referenties
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062(2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397(2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
