Method Article

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiomyocyten zijn vatbaar voor variaties in de celcyclus, zoals endoreduplicatie (doorgaande rondes van DNA-synthese zonder karyokinese en cytokinese) en acytokinische mitose (karyokinese maar geen cytokinese). Dergelijke atypische celcyclusvariaties resulteren in polyploïde en multinucleaire cellen in plaats van celdeling. Daarom is het van cruciaal belang om cardiomyocyt-kernen, het aantal kernen per cel en hun celcyclusstatus correct te identificeren om cardiale vernieuwing en regeneratie te bepalen. Dit geldt vooral voor het gebruik van nucleaire markeringen voor het identificeren van celcyclusactiviteit, zoals thymidine-analogen Ki-67, PCNA of pHH3. Hier presenteren we methoden voor het herkennen van cardiomyocyten en hun nucleaire status en voor het bepalen van hun celcyclusactiviteit. We gebruiken twee gepubliceerde transgene systemen: de Myh6-H2B-mCh transgene muislijn, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocyt-kernen, en de CAG-eGFP-anillin muislijn, voor het onderscheiden van celdeling van celcyclusvariaties. Gecombineerd vergemakkelijken deze twee systemen het onderzoek naar cardiale regeneratie en plasticiteit.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De correcte identificatie van cardiomyocyt kernen en de celcyclus status van cruciaal belang voor het bepalen van de cardiale omzet en regeneratie spier. Dit geldt met name voor het gebruik van nucleaire merkers, zoals pHH3, Ki-67, of thymidine analogen, voor het identificeren celcyclusactiviteit. Aangezien de proliferatieve capaciteit van zoogdier volwassen hartspiercellen zeer klein 1, een valse identificatie van een kern voor een positieve marker proliferatie van cardiomyocyten kern kan een wezenlijk verschil in de uitkomst van een proliferatie assay maken. Bovendien cardiomyocyten zijn gevoelig voor variaties in de celcyclus, zoals endored....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures van dit protocol bij dieren waren in overeenstemming met de ethische normen van de Universiteit van Bonn en in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement over de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt.

1. In Vitro Visualisatie van celcyclusactiviteit in Postnatale Cardiomyocytes

  1. Postnatale cardiomyocyt dissociatie
    1. Pre-experimentele voorbereidingen
      1. Bereid kweekmedia (IMDM, 1% penicilline / streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1% β-Mercaptoethanol); medium 1: voeg FCS tot 2%; medium 2: voeg FCS....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de effecten van siRNAs / miRNAs de celcyclusactiviteit postnatale cardiomyocyten in vitro cardiomyocyten van dubbel transgene Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin muizen te analyseren werden geïsoleerd op postnatale dag 3 (P3) en getransfecteerd met celcyclus activiteit-inducerende miR199 5, siRNA p27 en siRNA Fzr1. In vergelijking met de negatieve controle (Figuur 1A), de Foto miR199- (figuur 1B) en p27- siRNA (fig.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een discussie over de vraag of cardiomyocyten kunnen de celcyclus opnieuw invoeren en verdelen en na beschadiging tijdens weefsel homeostase. Waarden voor de basisomzet cardiomyocyten werden gegeven in het traject tussen 1% en 80% 1 7. Ook na een cardiale laesie, is de inductie van celcyclus-activiteit en het scheppen van nieuwe cardiomyocyten gerapporteerd in het grensgebied, met waarden tussen 0,0083% 8 en 25 - 40% 7........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken S. Grünberg (Bonn, Duitsland) en P. Freitag (Bonn, Duitsland) voor hun technische assistentie.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dishSarstedt821472
100 µm cell strainerBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ injection cannula, StericanBraun, Melsungen4657519
20 gauge needleBecton Dickinson GmbH301300
24-well platesBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Methyl-butaneCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% formaldehyde solutionAppliChem GmbH A0936,1000
3-way stopcockB. Braun Medical Inc.16494C
50 mL syringeB. Braun Medical Inc.8728810F
70% ethanolOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibodyJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half AreaGreiner bio-one675986
Collagenase BRoche11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
donkey serumJackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
fetal calf serumPromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%)PanReac AppliChemA3697
Gelatine from porcine skin, Type ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
glass coverslipsVWR631-0146
GlucoseSigma-AldrichG7021
Heidelberger extension tubeIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond microscope slidesMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Insulin syringeBecton Dickinson GmbH300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
microcentrifuge tubeSarstedt72690
Mini shakerVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negative control(scrambled RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Neonatal Heart Dissociation KitMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum MediumGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicillin/StreptomycinGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifadingSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
sample containersVitlab80731
Serological pipetteGreiner607180
software NIS ElementsNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 iodide (642/661)Molecular probes/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeledVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
α-actinin antibodySigma-AldrichA7811
β-MercaptoethanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiomyocyte NucleiCell Cycle ActivityH2B mCherry TransgenicEGFP Analin SignalsConfocal Video MicroscopyHeart Tissue DigestionNuclearity DeterminationEndoreduplication DetectionMitosis VisualizationCardiac Regeneration

Related Articles