Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Samenvatting

Een op macrofoam gebaseerde bemonsteringsmethodologie werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de detectie en kwantificering van norovirus op harde oppervlakken in het milieu.

Samenvatting

Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische gastro-enteritis wereldwijd. Omdat de meeste infecties, hetzij rechtstreeks worden verspreid via de route van persoon tot persoon of indirect via het milieu oppervlakken of voedsel, besmet fomites en levenloze oppervlakken zijn belangrijke voertuigen voor de verspreiding van het virus tijdens het norovirus uitbraken.

We ontwikkeld en geëvalueerd een protocol met behulp van macroschuim swabs voor de detectie en typering van de menselijke norovirussen van harde oppervlakken. Vergeleken met vezel getipte swabs of antistatische doekjes, macroschuim swabs toestaan virus herstel (range 1,2-33,6%) van de wc-bril oppervlakken van maximaal 700 cm ^2. Het protocol omvat stappen voor de extractie van het virus van de swabs en verdere concentratie van het virale RNA met behulp spinkolommen. In totaal zijn 127 (58,5%) van de 217 wattenstaafje monsters die waren verzameld van oppervlakken in cruiseschepen en langdurige zorg voorzieningen waar norovirus gastro-enteritis was geweestgerapporteerd testte positief voor GII norovirus door RT-qPCR. Van deze 29 (22,8%) met succes kon worden gegenotypeerd. Tot slot, detectie van norovirus op het milieu oppervlakken met behulp van het protocol ontwikkelden we kunnen helpen bij het bepalen van het niveau van milieuverontreiniging tijdens uitbraken alsmede opsporing van het virus wanneer klinische monsters niet beschikbaar zijn; het kan ook het toezicht op de effectiviteit van de sanering strategieën te vergemakkelijken.

Inleiding

Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische acute gastro-enteritis wereldwijd ^{1, 2, 3.} Het virus is zeer besmettelijk en de transmissie gebeurt via direct van persoon tot persoon interactie of indirect door contact met besmet voedsel, water en milieu oppervlakken. Noroviruses kan worden afgestoten langdurig en verlengde overleving van het virus omgevingsoppervlakken is gedocumenteerd ^{1, 2, 3.} Tijdens drukke verlies, miljarden virusdeeltjes vrijkomt per gram ontlasting en braaksel bevat ook een voldoende aantal virale deeltjes infectie ^{4, 5, 6, 7, 8 veroorzaken,}ef "> ^{9, 10.} Bovendien kan de overdracht van het virus tussen levenloze oppervlakken en menselijke huid gemakkelijk voordoen ^{2, 11, 12.} Derhalve kunnen de controle van milieuverontreiniging helpen uitbraak onderzoeken en evalueren van de doelmatigheid van sanering en desinfectie procedures.

Milieubemonstering verschillende protocollen zijn beschreven voor de detectie van rotavirus, colifaag MS2, feline calicivirus (FCV), en bacteriofaag P22 ^{13, 14, 15, 16.} De in deze studies, waaronder snelle uitdroging (<1 uur) en de kleine oppervlakte beschreven valideringsomstandigheden (25 x 100 cm ^2), mogelijk onvoldoende lokale instellingen vertegenwoordigen. Bovendien, de verwachte geringe besmetting met envinmental oppervlakken moeten protocollen die in staat zijn om heel weinig virusdeeltjes te detecteren zijn.

We ontwikkelden een-macroschuim gebaseerde oppervlak sampling methode voor de detectie en typering van norovirus. Deze methode is gevalideerd in meerdere norovirus uitbraken. Het protocol bevat 1) hoe staafje monsters van het milieu oppervlakken te verzamelen (2) hoe u het beste te onderhouden integriteit van de monsters tijdens het verzamelen en verzending naar het laboratorium, en 3) laboratorium testen en typering van norovirus.

Protocol

1. Swab Sampling in het veld

1. Draag een schone paar handschoenen.
2. Meten van de grootte van bemonsteringsplaats zonder het oppervlak met een meetlint of liniaal. Probeer om het gebied zo goed mogelijk te schatten en invullen van een meldingsformulier (aanvullende tabel 1).
3. Controleer de swab-kit voor eventuele lekkages en het label monster transport tassen en swab kits.
4. Verplaats het staafje over de bemonstering gebied als volgt: een slag in horizontale richting, een slag in verticale richting en een slag in een diagonale richting. Niet een oppervlakte die groter zijn dan 700 cm ² zwabberen.
5. Plaats elke zwabber in een buis en draai de dop goed.

2. Opslag en Transport van Swabs aan het Laboratorium

1. Houd uitstrijkjes bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur. Als de opslag langer vereist is, slaan de doekjes bij -20 ° C (of -70 ° C).
2. Houd de buizen bij 0-4 ° C (dwz. Gebruik koude kompressen) in een geïsoleerde container tijdens het transport naar het laboratorium en het schip binnen 24-48 uur van de collectie.

3. Virus Concentratie, virale RNA-extractie en zuivering

Opmerking: Alle centrifugatiestappen gebruiken een tafelblad centrifuge bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Wees extra voorzichtig bij het werken met de universele nucleïnezuur extractie (UNEX) buffer. Draag een veiligheidsbril of gezichtsbescherming.

1. Label een 15 ml buis en één RNA Midi kolom voor elk monster. Neem een ​​negatieve extractie controle in elk experiment.
2. De Lysis oplossing bereiden 10 swabs, meng 25 ml UNEX buffer met 25 ml PBST (PBS pH 7,2 bevattende 0,02% Tween-80).
3. Voeg 50 ul van colifaag MS2 suspensie (10 ⁶ PFU / ul) aan 50 ml Lysis oplossing.
4. Plaats een wattenstaafje in een 15 ml buis en voeg 5 ml Lysis oplossing. Meng en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Voeg 5 ml 100% ethanol aan elke buis en vortex gedurende 10 s.
6. Verwijder voorzichtig het staafje uit de 15 ml buis (het bevat UNEX buffer) zacht aan te drukken tegen de zijkant van de buis om overtollige vloeistof te verwijderen en dan gooi het staafje. Het resterende volume moet tussen 9-10 ml.

4. Midi Column viraal nucleïnezuur Extraction

1. Breng zorgvuldig 4,5 ml UNEX / ethanol mengsel van stap 3.6 op een midi-kolom, centrifuge en gooi het filtraat.
2. Plaats een andere 4,5 ml van dezelfde mengsel op dezelfde kolom, centrifuge, en gooi het filtraat.
3. Voor de eerste wasbeurt, voeg 3,5 ml van 70% ethanol op de Midi kolom, centrifuge en gooi het filtraat.
4. Voor de tweede wasbeurt, voeg nog eens 3,5 ml van 70% ethanol op de kolom Midi. Centrifuge en gooi het filtraat.
5. Voor de droge-spin, centrifuge de Midi kolommen om alle sporen van ethanol (wat een negatieve invloed kan hebben op uw viraal RNA herstel) te verwijderen.
6. Plaats de kolom Midi in een nieuwe 15 ml centrifugebuis. Voeg 250 ul elutiebuffer op de kolom Midi; wacht 1 min voor centrifugeren om de hoogste virale RNA terugwinning te verkrijgen.
7. De uitgepakte nucleïnezuur bij -70 ° C of onmiddellijk overgaan naar stap 5.

5. Concentratie van viraal nucleïnezuur met behulp van RNA Schoon en Concentrator Kits

1. Voeg 500 ul van RNA Binding Buffer 250 pl RNA geëlueerd in stap 4.7 hierboven en vortex gedurende 10 s.
2. Voeg 750 ul 100% ethanol en vortex gedurende 10 s.
3. Label een spin kolom voor elk monster. Laad de 750 pi monster op een spin-kolom.
4. Centrifugeer de spinkolommen bij 12.000 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal.
5. Laad de resterende 750 pl op een spinkolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 min.
6. Voor de voorwas, voeg 400 ul RNA Prep buffer elke spin kolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 min. Gooi het doorstroomkanaal.
7. Voor de eerste wasbeurt, voeg 800 ul RNA Wash Buffer om elke spin kolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi het doorstroomkanaal.
8. Voor de tweede wasbeurt, voeg 400 ul RNA Wash Buffer naar kolom en centrifuge draaien op 12.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi het doorstroomkanaal.
9. Voor de droge-spin centrifuge de spin kolom om alle sporen van wasbuffer verwijderen bij 12.000 xg gedurende 2 minuten.
10. overdracht spinkolom goed naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.
11. Voeg 25 ul elutiebuffer naar de spinkolom en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Dit zal het herstel van de virale RNA te verhogen van de kolom.
12. Verzamel RNA door centrifugeren van de spinkolom bij 10.000 xg gedurende 1 min.
13. Hetzij direct doorgaan naar RT-qPCR (stap 6) of opslag RNA bij -70 ° C.

6. Mutiplex RT-qPCR detectie van genogroup I en II Norovirussen en colifaag MS 2 (aanvullende tabel 2)

1. Schoon werken oppervlakken, pipettes en centrifuges met RNase decontaminatie oplossing om mogelijke verontreiniging te verminderen.
2. Ontdooi RT-qPCR reagentia op het ijs. Dooi RNA op ijs (in een aparte ruimte / kamer).
3. Bepaal het aantal reacties en voeg ten minste 10% meer daarvan (bijvoorbeeld als 10 reacties nodig zijn, maken master mix voor 11).
4. Vortex afzonderlijke master mix componenten, met uitzondering van de 25x RT-qPCR enzym, gedurende 5 s. Zorgvuldig mengen van het enzym door de knop van de buis met een vinger.
5. Kort centrifuge master mix componenten gedurende 5 s.
6. Bereid de master mix voor realtime RT-PCR detectie van norovirus GI en GII volgens de kit instructies toevoegen norovirus-specifieke oligonucleotideprimers en probes in een 1,5 ml microcentrifugebuis (aanvullend tabel 3).
7. Meng de master mix door pipetteren 5-10 keer op en neer (vortexen wordt niet aanbevolen). Aliquot 22 pi van de master mix in elk putje van real time PCR 96-well plaat.
8. Vortex monster RNAvoor 5 sec, en het verzamelen van korte (5 s) centrifugeren.
9. Voeg 3 ul van het monster RNA en GI en GII positieve controles voor de RT-qPCR plaat (volg sjabloon in tabel 2). Voeg 3 ul van nuclease-freewater in de niet-matrijs-control (NTC) wells.
10. Verzegeling van de real-time plaat met optische zelfklevende film.
11. centrifuge voorzichtig de real-time plaat bij 1300 xg gedurende 1 min om eventuele luchtbellen of vloeistofdruppels die in de putjes kunnen worden verwijderd.
12. Het opzetten van een real-time PCR-instrument en de set-up van de volgende thermische cycli voorwaarden: 1) RT stap gedurende 10 min. bij 45 ° C (2) activering van Taq polymerase, 10 min. bij 95 ° C en (3) 45 cycli van 15 s bij 95 ° C en 60 s bij 60 ° C.

7. Kwantificering van Norovirus in Swabmonsters

1. Controleer de resultaten van positieve en negatieve controles voor RT-qPCR resultaten (aanvullend tabel 3) bevestigen.
2. Bepalen of elke standaard curve voldoet aan deacceptabele waarden in aanvullende tabel 2 en de berekening van de totale standaardafwijking voor de standaard curve met behulp van Vergelijking 1.
   (Vergelijking 1)% rendement = 100 x 10 ^{(gemiddelde Ct Values-Intercept) / Helling.}
3. Als de PCR thermal cycler software niet de helling voor elke standaard curve heeft te berekenen, bepalen helling en ^R2-waarden door regressie met behulp van statistische software (bijvoorbeeld Excel, SPSS of SAS). Bereken bovendien de efficiëntie% voor standaard curves volgende vergelijking I
4. Noteer het RNA kopienummer berekend door de thermische cycler software voor alle monsters gebaseerd op standaard curven die aan de in tabel 4 aanvullende criteria. Herhaald alle monsters met standaard krommen D at niet voldoen aan de criteria of vals-positieve controles. Controleer Ct waarden van colifaag MS2, die als een interne controle voor PCR remming volgen werd toegevoegd.
5. Bepaal het aantal RNA-kopieën per monster, door het RNA kopienummer in stap 7,2, berekend door de verhouding van het volume (25-50 pi) totaal RNA elutiemiddel dat het RNA (3-5 ul) gebruikt voor de RT-qPCR reactie vermenigvuldigen. Als alternatief, het berekenen van de RNA dichtheid door het totale RNA aantal kopieën te delen door het oppervlak object gebied ^(cm2) geanalyseerd.

8. Genotypering van Real-time RT-PCR-positieve monsters door Hemi Geneste Conventionele PCR Amplification

1. Bereid de eerste ronde van de master mix voor elke primer set van de RT-PCR-test (Aanvullende tabellen 2 en 5).
2. Voeg 5 ul van norovirus positieve RNA tot 20 ul van master mix.
3. Voer het RT-PCR onder de volgende voorwaarden: (1) RT stap gedurende 30 minuten bij 42 ° C (2) activering van Taq polymerase, 15 min bij 95 ° C, en (3) 40 cycli van 30 s bij 95 ° C , 30 s bij 50 ° C en 60 sec bij 72 ° C. Na 40 cycli, incubeer gedurende nog 10 min bij 72 ° C.
4. Bereid de tweede ronde van mater mix voor elke primer set van de RT-PCR-test (Aanvullende tabellen 2 en 5).
5. Voeg 23 ul master mix en voeg 2 ul van de eerste ronde RT-PCR-producten (van de eerste ronde) aan elke buis (idealiter de eerste ronde product moet worden verdund 1/10 in RNase-free water).
6. Herhaal stap 8.3.
7. Bereid een 2% agarosegel in 1 x 100 ml Tris-acetaat EDTA (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, en 1 mM EDTA, pH 8,3). Na agarose oplossen door het mengsel in de magnetron, voeg 10 pl nucleïnezuur vlek per 100 ml bereide gel na afkoelen van het mengsel tot 60-70 ° C, giet de gel en plaats de kammen. Laat de gel regelen ten minste 30 min.
8. Mix 15 pi van elke RT-PCR product met 3 pi van 6x ladingskleurstof. Load 15 pi van elk monster en de Electrophorese agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur.
9. Accijnzen doel RT-PCR-fragmenten van geschikte grootte (330 bp voor GI en 341 bp voor GII) uit de gel eend RNA te zuiveren onder toepassing van een commercieel gelextractiekit. Het gezuiverde PCR-product kan nu worden gebruikt voor Sanger sequentiebepaling.

Resultaten

Figuur 1 toont een stroomdiagram van het staafje bemonsteringsprotocol. Dit protocol bestaat uit vier stappen; 1) monstername, 2) sample opslag en het transport, 3) viraal RNA zuivering en concentratie en 4) RT-qPCR assay en genotypering.

Figuur 1: Stroomdiagram van de definitieve protocol voor het milieu oppervlakte bemonstering v...

Discussie

Noroviruses een menselijke infectieuze dosis 50% tussen 18 en 10 ^{3 20} virusdeeltjes. Daarom kan zelfs low-level vervuiling van oppervlakken een gevaar voor de volksgezondheid opleveren. Verschillende aspecten van het staafje bemonsteringsprotocol geëvalueerd waaronder: 1) verschillende swab materialen, 2) opslagpositie swabs tijdens transport, 3) viraal RNA-concentratie, en 4) colifaag MS2 extractie als interne controle.

Tot voor kort was alleen de prestati...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Generieke naam voor kits
Macrofoam-doekje	Premoistened EnviroMax Swab kit	Puritan	2588060PFUW
RNA Lysis buffer	CDC UNEX buffer	Microbiologics	Cat No MR0501
RNA extractie spinkolom	Midi kolom	Omega Biotek	Cat No R6664-02
RNA zuiveringsspinkolom	Zymol RNA Clean and Concentrator kit	Zymo Research	Cat No R1016
Real time RT-PCR kit	AgPath kit One-Step RT-PCR Kit	Life Technologies	Cat No 4387391
Conventionele RT-PCR kit	Qiagen one step RT-PCR kit	Qiagen kit	Cat No 210212
Gel extractie kit	Qiagen QIAquick gel extractie kit	Qiagen kit	Cat No 28704 of 28706
	Coliphage MS2	ATCC	Cat No 15597-B1
	RNA run-off transcripten
	Realtime PCR platform	Applied Biosystems	Model ABI 7500
	Optische 96-wells reactieplaat	Thermo Scientific	Cat No 4316813
	MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Scientific	Cat No 4306311